CN112625948A - 一株具有固氮功能的特基拉芽孢杆菌s1及其在堆肥中的应用 - Google Patents

一株具有固氮功能的特基拉芽孢杆菌s1及其在堆肥中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1，其分离自生态良好的耕植土壤，具有较强的固氮能力，并具备一定的耐高温和降解纤维素的能力。本发明还公开了特基拉芽孢杆菌S1在以酵母废液浓缩液和稻壳为原料的混合堆肥中的应用。将特基拉芽孢杆菌S1进行液体发酵，将发酵液接种至上述堆肥原料，在堆肥高温期其它氮源减少的情况下，特基拉芽孢杆菌S1可吸收空气中的氮气为氮源，弥补氮源的不足并促进堆肥原料中纤维素的降解，从而有效的缩短了堆肥周期，并提高了堆肥产品的腐植酸和总氮含量，最终达到提升堆肥效率和堆肥产品肥效的目的。

Description

一株具有固氮功能的特基拉芽孢杆菌S1及其在堆肥中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有固氮功能的特基拉芽孢杆菌S1及其在以酵母废液浓缩液和稻壳为原料的混合堆肥中的应用。
背景技术
我国有机废弃物资源丰富，但实际利用率不足40％。有机肥废弃物堆肥生产有机肥具有经济、简便等优点，既处理了污染，又实现了有机废弃物的资源化、肥料化、回归土壤、减少化肥用量，对经济和生态的可持续发展均具有重要意义。秸秆、果蔬残渣、禽畜粪便、厨余垃圾等是目前堆肥生产有机肥的主要有机废弃物来源。同时，残糖、氨氮、色素、有机质含量均较高，处理难度极大的工业发酵废水，如酵母发酵废液浓缩液等工业有机废弃物的堆肥化技术正成为新的研究热点。
堆肥是微生物对有机废物进行生物化学降解的过程，微生物是堆肥过程的主体。堆体中的微生物一般来自堆肥原料自身和从堆肥环境中自然富集。然而，原料中的主要碳源组分---纤维素的降解和转化主要发生在堆肥的高温阶段，但高温使得微生物种群活性受到抑制，具体表现为高温阶段堆体微生物种群丰度的降低和活菌数量的减少，一般比堆肥升温阶段低1～2个数量级。更重要的是，堆肥过程中微生物首先将有机废弃物中的其它含氮物质分解为氨氮，再被微生物利用或转化，分解产生的氨态氮和/或原料自身所含的氨态氮在堆肥高温阶段易受热挥发，导致高温期纤维素降解阶段微生物所需的氮源不足，又在一定程度上限制了微生物对纤维素的降解和转化。因此，筛选获得具有较强固氮功能，且具有一定耐高温和降解纤维素能力的微生物，将其接种至堆肥体系，对缩短堆肥时间、提高堆肥效率、提升堆肥产品的总氮含量就显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一株特基拉芽孢杆菌S1及其在以酵母废液浓缩液和稻壳为原料的混合堆肥中的应用方法。该菌株具有较强的固氮能力，并具备一定的耐高温(60℃)和降解纤维素的能力。将该菌株进行液体发酵，将发酵液接种至上述堆肥原料，进一步强化堆肥高温期纤维素的降解和转化，提升堆肥产品的腐植酸和总氮含量，最终达到缩短堆肥周期、提升堆肥效率和堆肥产品肥效的目的。
本发明提供的一株特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：中国.武汉.武汉大学，湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学；保藏日期为2020年9月11日；保藏编号为CCTCC NO:M2020487。菌株Bacillustequila strain S1在LB平板上的菌落呈灰白色，中间及边缘颜色无差异，革兰氏染色阳性。
所述的特基拉芽孢杆菌S1分离自生态良好的耕植土壤(供植物正常生长所需的耕植土壤)，具有较强的固氮能力，并具备一定的耐高温(60℃)和降解纤维素的能力。
一种含特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1发酵液，将特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1接种至葡萄糖玉米浆干粉液体培养基中，在发酵条件为pH6.0～7.0，发酵温度为37-40℃，搅拌速度为150～250rpm，发酵所得。
所述的葡萄糖玉米浆干粉液体培养基中包括葡萄糖1.0-1.5g/L、玉米浆干粉2-4g/L，经调节pH值至7.0-7.5，灭菌后得到。
本发明的技术方案将所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液作为固氮微生物的应用。
本发明的技术方案将所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液在降解微生物上的应用。
本发明的技术方案将所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液在堆肥上的应用。具体是将所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液接种至堆肥原料中，在50-60℃下发酵30-35天。
所述的堆肥原料为酵母废液浓缩液和稻壳的混合物。
酵母废液浓缩液和稻壳的混合物的质量比为1：1.1-1.5。
所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液的接种量为0.1-0.5wt％，堆肥原料的含水量为50％-55％。
本发明的有益效果：
本发明以生态良好的耕植土壤为分离源，分离出了一株特基拉芽孢杆菌Bacillustequila strain S1，其具有较强的固氮能力，并具备一定的耐高温(60℃)和降解纤维素的能力。将特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1发酵液接种于堆肥堆体中，可在堆肥高温期弥补氮源的不足，促进堆肥原料中纤维素的降解，从而缩短堆肥周期，提高堆肥产品的腐植酸和总氮含量，最终提升堆肥效率和堆肥产品的肥效。
附图说明
图1为实施例1菌株Bacillus tequila strain S1在接种后第2天在无氮源阿须贝氏培养基上的生长状况。
图2为实施例1菌株Bacillus tequila strain S1在CMC-刚果红平板产生的透明圈。
图3为实施例1菌株Bacillus tequila strain S1和相近菌株的16S rRNA序列构建的系统发育树。
图4为实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体的温度变化图。
图5为实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体氨态氮 (NH3-N)含量变化。
图6实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体总氮(TN) 含量变化。
图7实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体总钾(K2O) 含量变化。
图8实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体的速效磷 (P2O5)含量变化。
图9实施例3接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液处理和对照堆体的有机质 (TOC)含量变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1：菌株S1的分离、筛选及鉴定
菌株的分离：从宜昌市夷陵区龙泉镇水府庙村5组中的湖北田头生物科技有限公司试验基地 (鸦鹊岭“葡萄园”示范基地)取生态良好的农田表层(2-5cm深)耕植土壤样品5个。实验室内将土壤样品等量均匀混合，取10g混合后的土壤样品放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，150rpm，37℃振荡30min制成悬液。取10mL悬液，加入无菌试管，并在沸水浴中加热10min后，将悬液用无菌水配制成浓度为10-7的稀释液，取稀释液0.1mL涂布于LB 固体培养基。将涂布好的平板放在60℃培养，3天内能够生长并形成单菌落的，挑取单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步筛选用。
菌株的筛选：分离得到的单菌落分别接种到灭菌后的无氮源阿须贝氏培养基(甘露醇10g、CaCO3 5g、MgSO4 0.2g、CaSO4 0.1g、NaCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、琼脂15g、去离子水1L，pH7.0)和灭菌后的CMC培养基(羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaCl 5g、KH2PO4 1g、琼脂15g、去离子水1L，pH7.0)。
将接种后的无氮源阿须贝氏培养基平板置于60℃培养箱中培养，记录接种后培养基表面形成菌落的时间。若菌落接种后第2天形成，标记为“+++++”，若菌落接种后第3天形成，标记为“+++”，以此类推，“+”越多说明菌株固氮能力越强。其中菌株S1在无氮源阿须贝氏培养基上接种后第2天的生长状况如图1所述，从图1中可以看出该菌株能够在 60℃条件无其它氮源的条件下吸收空气中的氮气为氮源生长，固氮能力标记为“+++++”。
将接种后的CMC培养基平板置于60℃培养箱中培养至菌落丰厚。向平板中加入1mg/mL的刚果红溶液直至覆盖整个平板，静止放置，染色1h，弃去染液；再加入适量1 mol/L的NaCl溶液，浸泡1h洗去多余的染液后，若菌落的周围出现清晰的透明圈，说明菌株分泌纤维素酶，具有降解纤维素的能力。测量透明圈直径H(mm)和菌落直径C(mm)， H/C值越大说明菌株降解纤维素能力越强。其中菌株S1在CMC-刚果红平板产生的透明圈如图2所示，从图2中可以看透明圈直径H为33mm、菌落直径C为19mm、H/C值为 1.74，说明其具有良好的纤维素降解能力。
通过上述分离、筛选方法得到同时具有较强的固氮能力和一定耐高温(60℃)、降解纤维素的能力菌株1株，命名为S1。将菌株S1转接入液体LB培养基中摇床培养至对数期，制成甘油管，-80℃保藏，供下一步鉴定用。
菌株的鉴定：(1)菌落特征观察：以2％的接种量取-80℃甘油贮存液接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡静置培养24h。将活化后的菌株接种到LB固体培养基中于 60℃培养箱中培养，24h后形成单菌落，用肉眼直接观察。菌株S1在LB平板上的菌落直径为1-1.5mm，菌落呈灰白色，中间及边缘颜色无差异，但边缘有光泽、不整齐符合芽孢杆菌菌落特征的菌株。(2)个体形态观察：取LB平板上形成的S1单菌落，固定于载玻片上进行革兰氏染色，用光学显微镜观察。菌株S1为革兰氏阳性、有芽孢、具有杆菌典型形貌特征。(3)菌株测序：将上述接种于LB液体培养基中的菌株S1摇床培养至对数期，取适量培养液离心2min(4000rpm，4℃)，弃尽上清液，得到适量菌体，提取菌体基因并测序。通过 16S rDNA序列构建的系统发育树分析表明(图3)，菌株S1位于Bacillus tequila分支上。结合生理生化特征将菌株S1鉴定为特基拉芽孢杆菌。该菌株特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：中国.武汉.武汉大学，湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学；保藏日期为2020年9月11日；保藏编号为 CCTCC NO:M2020487。
实施例2：菌株S1发酵液的生产
将实施例1的菌株Bacillus tequila strain S1(CCTCC NO:M2020487)接种至葡萄糖玉米浆干粉液体培养基中发酵扩大培养。50L发酵罐的发酵条件为pH 6.0～7.0，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250rpm，发酵时间36h，发酵结束时发酵液中菌浓度OD600＝12～15。所用葡萄糖玉米浆干粉液体培养基配制方法为：葡萄糖1.5g/L、玉米浆干粉4g/L，调节初始pH 值至7.5，115℃灭菌30min，发酵培养基体积30L。发酵过程若需要补料，补料培养基配制方法为：葡萄糖15g/L、玉米浆干粉40g/L，调节初始pH值至7.5，115℃灭菌30min，补料培养基体积3L。
实施例3：堆肥实验
将酵母废液浓缩液(由安琪酵母股份有限公司提供，具体为酵母生产产生的发酵废液，经蒸发浓缩后得到，性状为棕褐色粘稠液体，主要成分及含量：有机质62％、水分35.6％、总氮2.6％、氨态氮0.8％、P2O5 0.5％、K2O 6.5％、pH 5.6)和稻壳按照质量比0.45:0.55初步混合，直至观察不到酵母废液浓缩液的流动，按照堆肥原料总质量的0.5％接入实施例2的菌株Bacillus tequila strain S1发酵液，补水至堆体含水率为50％～55％，混合均匀后，堆成长 10米、宽4米、高1.5米近似立方形的堆体(简称：实验组，下同)。堆肥过程中用铲车翻堆，升温期每3～5天翻堆一次，高温期每2天翻堆一次，降温(腐熟)期不翻堆。每天上午 10点测定堆体温度。第0、4、10、26、35天和堆肥结束后采样检测。
设立未接种菌株Bacillus tequila strain S1发酵液的堆体为对照(简称：对照组，下同)，其它操作均与实验组堆体相同。
菌株Bacillus tequila strain S1发酵液的接入能够有效缩短堆体的升温时间和堆肥周期。实验组第4天升温至50℃以上，第10天升至最高温度60℃，对照组第8天升温至50℃以上，第19天升温至最高温度60℃；实验组最高温度60℃维持10天左右，第26天堆体温度降低至50℃以下，对照组最高温度60℃仅维持2天左右，第32天堆体温度降低至 50℃以下；实验组第35天降温至室温，对照组第42天降温至室温(图4)。即相比于对照组，接菌处理使堆肥的升温期缩短4天，高温期持续时间基本相同，但高温期的温度明显高于对照组，并提前6天达到降温期。
堆肥过程中实验组和对照组样品中的氨态氮(NH3-N)含量未显示出显著的差异(图 5)，说明接入菌株S1未能明显改变堆肥过程中氨态氮的含量变化。堆体的氨态氮含量是原料自身所含的氨态氮数量、微生物分解产生和利用消耗氨态氮的速率，以及堆肥过程中，主要是高温期氨态氮的挥发速率等多种因素综合作用的结果。堆肥过程中实验组和对照组样品中的总氮(TN)含量变化差异明显(图6)。未接菌的对照组进入高温期后，总氮含量开始降低，如前所述这是因为微生物生长需要将原料中的含氮物质分解产生氨态氮，而高温期 (50～60℃)加速了氨态氮的挥发，在无其它氮源补充的情况下导致总氮(总氮包含氨态氮和其它形式的氮元素)含量的减少和高温期氮源的降低甚至不足。而接入菌株S1的实验组进入高温期后，虽然总氮含量仍存在一定的波动(主要由氨态氮的挥发引起)，但实验组的总氮含量明显高于未接菌的对照组，证明菌株S1在堆肥过程中，尤其是堆肥10天后氨态氮含量开始下降的情况下发挥了其固氮能力，有效的为高温期微生物降解纤维素提供了氮源，使高温期微生物能够继续以纤维素为碳源生长，从而提升了纤维素降解和转化的速度与程度，并提高了堆肥高温期的温度。此外，堆肥进入降温期的第35天接入菌株S1的实验组的总氮含量约为1.58％，高于堆肥初始物料的总氮含量1.47％，考虑到堆肥过程中不可避免的氨态氮的挥发，说明菌株S1在堆肥过程中确实起到了固氮的作用。
堆肥过程中实验组和对照组样品中的总钾(K2O)(图7)和速效磷(P2O5)(图8)含量呈现相似趋势，但仍可以看出实验组的总钾和速效磷有机质含量整体上高于对照组。说明接入菌株S1除总氮外，还有助于钾、磷等肥效关键元素含量的提升。
堆肥过程中实验组和对照组样品中的有机质(TOC)含量呈现相似趋势(图9)，但仍可以看出实验组有机质含量整体上高于对照组。堆体的有机质包括未降解的纤维素、木质素、残糖、蛋白质、堆肥产生的腐植酸、甚至微生物菌体等多种成份。《有机肥料》标准 NY/T525-2012规定有机肥料中有机质的质量分数应≥45％，接入菌株S1的实验组堆肥产物可到此标准，未接菌的对照组则未能达标。
实验组和对照组堆肥结束后堆肥产物的主要指标参数检测结果(表1)表明，实验组堆肥产物的有机质含量高于对照组，且实验组堆肥产物中的有机质主要以腐植酸的形式存在 (含量26.27％)，未被降解的纤维素含量<10％，而对照组堆肥产物中的有机质主要以纤维素的形式存在(含量20.81％)；实验组堆肥产物的氮、磷、钾等元素的含量均高于对照组，尤其是总氮含量相较于对照组增加了43％。实验组堆肥产物的发芽指数、水分含量、pH等指标参数与对照组堆肥产物基本相同或略高。
表1实施例3接种菌株S1发酵液处理和对照堆肥产物主要成份
Figure RE-GDA0002946431850000061
Figure RE-GDA0002946431850000071
注：有机质、总氮、速效磷、总钾、水分、pH按照《有机肥料》标准NY/T 525-2012规定的方法测定；发芽指数按照国标《堆肥质量要求》征求意见稿规定的方法测定；腐植酸含量参照标准LY/T 1238-1999进行测定；纤维素含量参照标准GB/T5009.10-2003进行测定。
在本案的实施例条件下，接种量过低，如接种0.1wt％的接种量，则总氮含量约为1.11％，基本与对照组持平。而接种量过高，如0.6wt％的接种量，第10天开始温度上升至62-65℃，且持续时间为16-18天，48-50天才得以降至室温，长期的高温更易造成铵态氮的挥发以及有机物的流失。
综合上述结果可知，菌株S1发酵液的添加有效的缩短了堆体的升温时间和堆肥周期，提高了堆肥高温期的温度，加快了堆体中纤维素的降解和转化，提高了堆肥产品的腐植酸和总氮含量，最终提升了堆肥效率和堆肥产品肥效。

Claims (10)

1. 一株特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1，2020年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020487，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
2. 一种含有权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1发酵液，其特征在于，将特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1接种至葡萄糖玉米浆干粉液体培养基中，在发酵条件为pH 6.0~7.0，发酵温度为37-40℃，搅拌速度为150~250 rpm，发酵所得。
3.根据权利要求2所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1发酵液，其特征在于，所述的葡萄糖玉米浆干粉液体培养基中包括葡萄糖1.0-1.5 g/L、玉米浆干粉2-4g/L，经调节pH值至7.0-7.5，灭菌后得到。
4. 根据权利要求1或2或3所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液作为固氮微生物的应用。
5. 根据权利要求1或2或3所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液在降解微生物上的应用。
6. 根据权利要求1或2或3所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液在堆肥上的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的堆肥原料为酵母废液浓缩液和稻壳的混合物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，酵母废液浓缩液和稻壳的混合物的质量比为1：1.1-1.5。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求1或2或3所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液接种至堆肥原料中，在50-60℃下发酵30-35天。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，权利要求1或2或3所述的特基拉芽孢杆菌Bacillus tequila strain S1或其发酵液的接种量为0.2-0.5wt%，堆肥原料的含水量为50%-55%。
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