CN109022327A - 一种微生物混合菌剂的制备方法及在高温堆肥中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微生物混合菌剂的制备方法、微生物混合菌剂及其应用，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：活化卷枝毛霉菌种（Mucor circinelloides）、特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），将卷枝毛霉菌的孢子和另外两株菌按1:3:3混合后接种于CPDA培养基中，28℃，150 r/min恒温摇床内培养48 h，即可得混合菌液。该复合菌剂将卷枝毛霉菌生长速度快且可携带细菌扩散的特点应用于有机废弃物的好氧堆肥，增强了有机废弃物降解菌在堆体中的扩散，有效缩短堆肥周期并提高堆肥效率。较单一菌剂具有适应性强和性能稳定优势，在有机废弃物快速堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

Description

一种微生物混合菌剂的制备方法及在高温堆肥中的应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种应用于好氧堆肥的复配菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

堆肥化又叫好氧堆肥化处理，在人工控制的条件下，依靠自然界中广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进科生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程，是目前最常用的无害化、资源化处理有机废弃物的有效方法。有机废弃物（如秸秆、餐厨垃圾、畜禽粪便等）通常含有丰富的N、P及一定量的微量元素，经过好氧堆肥处理后，有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用，是作物生长的最适宜肥料。此外，有机废弃物中的致病菌、寄生虫等也会随之被杀死。然而在自然好氧堆肥条件下，受堆体内土著微生物种类及数量等因素限制的影响，堆肥初期升温缓慢，高温期持续时间短，而且存在发酵时间长、臭气污染严重、腐熟度低等问题。

堆肥初期人为接种微生物制剂可提高堆肥初期微生物的群落结构、增强微生物的降解活性、缩短达到高温期的时间、提高堆肥效率和成品质量等。因此，微生物制剂的制备是驱动堆肥化产业发展的引擎，而有效微生物的筛选则是这一方案可行性的保障。公开号CN102409005A公布了一株具有双重酶活用于好氧堆肥发酵的高温菌，公开号CN105349462A公开了一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1, 可有效促进堆体温度提升，提高堆体蛋白酶活性和纤维素酶活性，加快了堆体总碳和纤维素的降解。然而，单一菌株难以适应多种有机废弃物的好氧堆肥处理。因此，开发多种菌株复配的复合微生物接种剂在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值。

公开号CNIO7177533A公开了一种由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂混合获得的嗜热菌复配菌剂，较单一嗜热接种菌剂，该复合菌剂具有生产周期短、有效活菌数高、保存周期长和能耐受高温堆肥环境等优势。公开号CNIO6978366A公开了一种由脉芽孢杆菌菌株TB42、地衣芽孢杆菌菌株TA65和热反硝化地芽孢杆菌菌株TB62混合而成的菌剂，该混合菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和DOM降解，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟等优势等。然而，这些菌剂主要由细菌组成，虽然其增殖速度快，但其扩散速度有限，特别是在秸秆、牛粪等松散度比较大的有机废弃物中。虽然人为翻堆可促进菌株在堆体中的扩散，但这必然增加堆肥成本。

卷枝毛霉（Mucor circinelloides）在基体内外能广泛蔓延，菌丝体每日可延伸3厘米左右，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。此外，卷枝毛霉还具有较强的分解纤维素的能力。因此，利用卷枝毛霉的增殖带动堆体降解微生物的扩散，将有效促进各类有机物质的降解速率，缩短堆肥处理时间，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用于高温好氧堆肥的复合菌剂制备方法及其应用。本发明可通过以下技术方案实现:

一种微生物混合菌剂，由卷枝毛霉菌CGMCC No. 11578、特基拉芽孢杆菌CGMCC No.5935和贝莱斯芽孢杆菌CGMCC No. 4992三种菌按菌液体积比1:3:3组成。

所述卷枝毛霉菌菌液孢子浓度为l×10⁸个/mL；特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液菌体浓度均为l×10⁸个/mL。

一种微生物混合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：卷枝毛霉菌接种于固体PDA培养基，28℃恒温培养6～7 天，用灭菌蒸馏水将平板内的孢子洗至灭菌锥形瓶内，用血球计数板计数并调整孢子浓度；特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌分别划线接种于固体LB培养基，37℃培养24 h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12 h，收集菌体并用血球计数板调整菌体浓度；

（2）混合菌种复配：将获得的卷枝毛霉菌的孢子、特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌接种液按体积比1:3:3混合获得复配接种液；

（3）混合菌剂制备：将复配接种液按体积比5%接种于CPDA培养基中28℃，150 r/min恒温摇床内培养2～4 天，即可得混合菌剂。

根据需要将所述制备方法获得的微生物混合菌剂应用于高温堆肥腐熟中。

本发明的优点在于：利用本发明的制备方法可促进活性微生物在堆体中的扩散，缩短堆肥处理时间，且具有生产周期短、有效活菌数高、保存周期长等优势。

具体实施方式

下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明所涉卷枝毛霉菌株（No. 11578）、特基拉芽孢杆菌菌株（No. 5935）和贝莱斯芽孢杆菌菌株（No. 4992）的菌种，均从中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）引进。

实施例1：复配菌剂的制备及其在堆肥中的应用。

1. 实施例中所涉及的培养基:

PDA培养基组成为：马铃薯（200 g/L）（用浸出汁），葡萄糖（20 g/L），向其中加入20 g琼脂粉，制成固体PDA培养基；LB培养基组成为：胰蛋白胨（10 g/L），酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L），pH调为7.0，也可向其中加入20 g琼脂粉，制成固体LB培养基； CPDA培养基的组成为：马铃薯（200 g/L）（用浸出汁），葡萄糖（1.25 g/L），磷酸二氢钾（2 g/L），硫酸镁（0.5g/L），水1000 mL，pH 6.0。

2. 菌种活化：卷枝毛霉菌接种于固体PDA培养基, 28℃恒温培养6 d，用10 mL灭菌蒸馏水将平板内的孢子洗至50 mL灭菌锥形瓶内，用血球计数板计数并调整孢子浓度约l×10⁸个/mL；特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基，37℃培养24 h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12 h，12000 rpm，1 min，去出上清液后用1 mL无菌水悬浮，稀释10⁶倍后用血球计数板计数并调整菌体浓度约l×10⁸个/mL。

3. 混合菌种复配：分别将步骤2获得的3种菌液（A：卷枝毛霉；B：特基拉芽孢杆菌；C：贝莱斯芽孢杆菌）按照表1进行处理，得到复配接种液；

表1各菌株接种液体积比

4. 复配菌剂制备：按照体积比5%的接种量向液体CPDA培养基中接入步骤（3）制备的复配接种液，摇床转速180 rpm，37℃培养12 h，得到液体菌剂。

5. 堆肥实验：堆肥原料选用牛粪采集于长富乳业第二十七牧场，将水稻秸秆和新鲜牛粪按体积比4:6混合制堆。平均分成5份，依次标记为T1、T2、T3、T4、T5。调整含水量约为65%，每个处理组依次施加步骤3所配制的液体菌剂，添加比例为0.025%（以原始物料质量百分比计）。

获得发酵原料，堆肥进行20 d，分别在第0、5、10、15、20 d取样，测定了温度、pH、含水率、有机质、凯氏氮、无机氮、DOM含量等参数。整个堆肥过程只在0 d接种菌剂一次，在第3、6、9、12 d堆体翻堆。

6. 实验结果

（1）从堆肥过程中的温度变化分析，添加混合菌剂的堆体温度比只添加单一菌剂和不添加菌剂的堆体温度高，且升温更快。这有利于促进堆肥物料的高温降解及堆体腐熟（表2）。

表2 温度检测结果 (℃)

（2）从堆肥过程中的pH和含水率变化分析，添加混合菌剂的堆体温度比只添加单一菌剂和不添加菌剂堆体的pH升得更高，水分降得更快（表3和表4）。这可能是由于添加混合菌剂的堆体反应更加剧烈，导致NH₃挥发及水蒸气散发增加所致。

表3 pH检测结果

表4 含水率检测结果（%）

（3）从堆肥过程中的有机质（OM）降解率分析，添加混合菌剂的OM降解率比只添加单一菌剂和不添加菌剂堆体的OM降解率更高（表5）。

表5 有机质检测结果（%）

（4）从堆肥过程中的凯氏氮和无机氮变化分析，添加混合菌剂的堆体温度比只添加单一菌剂和不添加菌剂堆体的凯氏氮含量更高（表6），但无机氮变化不明显（表7和表8）

表6 凯氏氮检测结果 (%)

表7 NH₄+-N检测结果 (mk/Kg)

表8 NO₃ ^--N检测结果 (mg/Kg)

（5）从堆肥过程中可溶性有机物（DOM）的含量变化分析, 添加混合菌剂的DOM降解率比只添加单一菌剂和不添加菌剂堆体的DOM降解率略高（表9）。

表9 DOM检测结果 (mg/g)

7. 堆肥产物对小白菜种子发芽率影响

利用小白菜种子发芽率测定堆肥产物的肥效，测定方法参照公开号CN107177533A，具体为：取5 g鲜样加水50 mL，浸提30 min，室温200 rpm振荡30 min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫3张滤纸，加入堆肥提取液8 mL，以去离子水作为对照，均匀放入20粒籽粒饱满，大小均匀一致小白菜种子， 25℃培养24h后测定发芽率。

表10堆肥产物对小白菜种子发芽率影响

综上所述，添加该发明所述混合菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和DOM降解，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟等。此外，堆肥产物的提取液对小白菜种子发芽率明显高于对照组（T1），表明该发明所述混合菌剂可提高堆肥产物的肥效，利于作物的生长。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种微生物混合菌剂，其特征在于，由卷枝毛霉菌CGMCC No. 11578、特基拉芽孢杆菌CGMCC No. 5935和贝莱斯芽孢杆菌CGMCC No. 4992三种菌按菌液体积比1:3:3组成。

2.根据权利要求1所述的一种微生物混合菌剂，其特征在于，所述卷枝毛霉菌菌液孢子浓度为l×10⁸个/mL；特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液菌体浓度均为l×10⁸个/mL。

3.如权利要求1所述的一种微生物混合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：卷枝毛霉菌接种于固体PDA培养基，28℃恒温培养6～7 天，用灭菌蒸馏水将平板内的孢子洗至灭菌锥形瓶内，用血球计数板计数并调整孢子浓度；特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌分别划线接种于固体LB培养基，37℃培养24 h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12 h，收集菌体并用血球计数板调整菌体浓度；

（2）混合菌种复配：将获得的卷枝毛霉菌的孢子、特基拉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌接种液按体积比1:3:3混合获得复配接种液；

（3）混合菌剂制备：将复配接种液按体积比5%接种于CPDA培养基中28℃，150 r/min恒温摇床内培养2～4 天，即可得混合菌剂。

4.如权利要求1或2所述的微生物混合菌剂在高温堆肥腐熟中的应用。