CN110257487A - 一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其应用 - Google Patents

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石振华
张琪
车建刚
廖斌斌
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations

Abstract

本发明提供一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其在畜禽粪污堆肥化处理中的应用，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用荧光定量PCR分别扩增其16 S DNA和纤维素酶基因，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量。所得值的200~500倍即为每公斤菌剂适用的堆体吨量。该方法既保证了菌体数量及活性，又有效缩短堆肥周期并提高堆肥效率，较盲目施加菌剂具定向、精准和灵活的优势。在畜禽粪污的快速堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

Description

一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其应用。
背景技术
堆肥化处理是指在人工控制的条件下，依靠自然界中的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程，是目前最常用的无害化、资源化处理有机废弃物的有效方法。然而，在自然好氧堆肥条件下，受堆体内土著微生物种类及数量等因素限制的影响，堆肥初期升温缓慢，高温期持续时间短，而且存在发酵时间长、臭气污染严重、腐熟度低等问题。
对于堆肥中遇到的问题，目前的主要策略是在堆肥初期人为接种微生物制剂，以提高堆肥初期微生物的群落结构、增强微生物的降解活性，进而缩短达到高温期的时间及提高堆肥效率。例如，公开号CN102409005A公布了一株具有双重酶活并用于好氧堆肥发酵的高温菌，公开号CN105349462A公开了一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1, 均可有效促进堆体温度提升，提高堆体蛋白酶活性和纤维素酶活性，加快了堆体总碳和纤维素的降解。公开号CNIO7177533A公开了一种由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂混合获得的嗜热菌复配菌剂，较单一嗜热接种菌剂，该复合菌剂具有生产周期短、有效活菌数高、保存周期长和能耐受高温堆肥环境等优势。公开号CNIO6978366A公开了一种由脉芽孢杆菌菌株TB42、地衣芽孢杆菌菌株TA65和热反硝化地芽孢杆菌菌株TB62混合而成的菌剂，该混合菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和DOM降解，提高凯氏氮的含量，促进堆肥腐熟等优势等。除此之外，市场中的菌剂产品也已有非常多的品种。
虽然这些菌剂及其产品都有施用量可供参考，然而，堆体原料种类及其成份的多样化和复杂化，使得所选菌剂在参考适用量范围内往往难以达到预期效果。鉴于目前在菌剂施加量依据方面的参照甚少，本发明提供一种基于堆肥原料和菌剂中的纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法。该方法在保证菌体数量的同时还能保证其活性，可有效缩短堆肥处理时间，提高堆肥效率，在畜禽粪污等有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于富含纤维素的有机废弃物的堆肥化处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其应用，该方法在保证菌体数量的同时还能保证其活性，可有效缩短堆肥处理时间，提高堆肥效率，在畜禽粪污等有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于富含纤维素的有机废弃物的堆肥化处理。
本发明可通过以下技术方案实现:
一种计算菌剂施加量的方法，包括以下步骤：
（1）分别提取堆肥原料和菌剂的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；
（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16 S DNA和纤维素酶基因，PCR扩增时，要求两种引物扩增条件下所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致或具有相同的PCR扩增条件；
（3）堆体原料和菌剂的16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为；
（4）计算获得纤维素酶基因的相对含量的结果的200~500倍即为每公斤菌剂可适用的堆体吨量。
本发明的优点在于：利用本发明的制备方法，可在堆体成分难以统一及普适性菌剂有限的情况下，评价所购或自配菌剂对当前堆体的适用性能，有效避免菌剂的浪费，降低堆肥成本并增强菌剂的功效、提高堆肥效率及产品肥效。此外，本发明还具有定向、精确和灵活的优点，在畜禽粪污堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于富含纤维素的有机废弃物的堆肥化处理。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中所用到的三种菌剂为某三种品牌的适用于畜禽粪污堆肥化处理的发酵菌剂。
实施例：堆体菌剂施加量的计算及其应用效果。
1. 实施例中所用菌剂为从市场购买的可适用于牛粪堆肥化处理的发酵菌剂，具体为固肥菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂、有机物料腐熟剂。
2.实施例中所涉及的引物：
16S DNA扩增引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；纤维素酶扩增基因选自熊小龙同学的硕士论文《应用于宏基因组纤维素酶基因钓取的新PCR方法的构建》，位于第60页，即GHF9E1F（5'-GGACGTGACCGGCGGNTGGTAYGA-3'）和GHF9E1R（5'- GGCCATCCACACCAGAGGNGCRTTCCA-3'）。
3. 堆肥原料的牛粪采集于奶牛牧场，将水稻秸秆和新鲜牛粪按体积比4:6混合制堆，调整含水量约为65%。
4. 分别称取0.5 g堆肥原料和5 g菌剂，利用土壤DNA提取试剂盒（MPbiomedicals, 116560-200）提取堆肥原料和三种菌剂的DNA，堆肥原料的DNA用30 μl的溶解缓冲液溶解，菌剂的DNA用50 μl的溶解缓冲液溶解，利用荧光定量PCR扩增16 S DNA和纤维素酶基因扩增，退火温度为60℃，延伸时间为80 s，循环次数为45次，荧光定量PCR检测试剂选用SYBR Fast qPCR Mix（RR430A，TaKaRa）。反应体系是按荧光定量PCR检测试剂使用说明书添加，20μl总反应体系，其中，DNA模板2μl，一对引物各0.5μl，荧光定量PCR检测试剂10μl，无菌水7μl。
5. 以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算三种菌剂中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为；结果分别为0.013、0.016和0.029；
6. 根据计算结果，对于当前堆体而言，这三种菌剂每公斤适用的堆体量为：2.6~6.5吨、3.2~8.0吨和5.8~14.5吨。
7. 将堆肥原料平均分成3份，依次标记为T1、T2、T3。每份约1吨重，按每种菌剂每公斤对应的最高值和最低值的平均值计算，每个处理组的菌剂施加量如下表所示（表1），添加比例为0.025%（以原始物料质量百分比计）。
表1菌剂施加量
8. 堆肥过程中的温度变化。
每隔1d 测定堆体温度，以堆体前、后、左、右和中心5点温度的平均值作为堆体的发酵温度，测量时温度计插入堆体表面25cm 以下，温度测定至温度下降至室温。结果显示，三个处理组在5~7 d升至50℃，50℃以上高温可持续13 d左右（表2）。说明按照本实施例的计算方法所选择的菌剂施加量在提升堆体升温速度和延长高温维持时间方面可以发挥其正常功效。
表2 温度检测结果 (℃)
9. 堆肥前后的碳氮（C/N）比变化。
C/N是比较常用的评价堆肥腐熟度的指标。本实施例中，牛粪堆肥初始物料的C/N值28左右，堆肥产物的C/N值20左右（表3），表明三种处理基本腐熟完全。
表3 堆肥前后样品的C/N值
10. 堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
利用小白菜种子发芽率测定堆肥产物的肥效，测定方法参照公开号CN107177533A，具体为：取5 g鲜样加水50 mL，浸提30 min，室温200 rpm振荡30 min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫3张滤纸，加入堆肥提取液8 mL，以去离子水作为对照，均匀放入20粒籽粒饱满，大小均匀一致小白菜种子，25℃培养24 h后测定发芽率。结果显示，三种堆肥产品的小白菜种子的发芽率均超过90%（表4），说明堆肥产物腐熟度更好，质量更高，更利于作物生长。
表4堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
综上所述，按照常规腐熟度的评价指标进行评价，由本发明所得的菌剂施加量均能保证堆体的腐熟，说明本发明的方法可以用于计算特定堆体的菌剂施加量。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省致青生态环保有限公司
<120> 一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ggacgtgacc ggcggntggt ayga 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
ggccatccac accagaggng crttcca 27

Claims (8)

1.一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，基于所选菌剂中纤维素酶基因的相对含量，计算菌剂的施加量，进而提高牛粪堆肥效率及堆肥产物肥效。
2.根据权利要求1所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，首先分别提取堆肥原料和菌剂的DNA，利用荧光定量PCR扩增16 S DNA和纤维素酶基因。
3.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，16 S DNA扩增引物为常用的通用引物。
4.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，纤维素酶基因扩增引物为适用于可分泌纤维素酶的细菌的简并引物。
5.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，扩增16 S DNA和纤维素酶基因的两对引物具有相同的PCR扩增条件或PCR扩增时，所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致。
6.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，堆肥原料和菌剂16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，菌剂中纤维素酶基因相对含量的计算公式为。
7.根据权利要求1所述的一种基于纤维素酶基因计算菌剂施加量的方法，其特征在于，纤维素酶基因相对含量的200~500倍即为每公斤菌剂可适用的堆体吨量。
8.如权利要求1~7所述的计算菌剂施加量的方法在畜禽粪污堆肥化处理中的应用。
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