CN104164395B - 一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.9411。培养时先将该菌株的冻存液进行厌氧培养，得到培养好的菌株培养菌液，将菌株培养液离心后重悬菌体，得到的重悬菌液作为接种菌源，将接种菌源接入产氢培养液中在恒温水浴摇床上无光培养产氢，直至产氢结束。该菌株可利用自然界常见且难以被大多数微生物利用的碳源及氮源发酵制氢，在发酵制氢的同时会生产乙醇及丁醇等生物燃料。是目前报道的首例多功能型新型拜氏梭菌菌株；可应用于生物质发酵产氢、乙醇丁醇生物燃料生产等，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的拜氏梭菌，特别涉及一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用。
背景技术
拜氏梭菌是一群单细胞原核微生物，以其可以在富糖环境生长、严格厌氧、在厌氧环境中可将单体糖类转化为氢气和二氧化碳。
氢气是一种清洁能源，生物发酵制氢方法与化学制氢方法相比具有更大的潜力因为它的生产过程更加节能。生物发酵制氢能够转化多种生物质，如木头、农作物秸秆、工业废水以及含纤维素的固体废弃物为氢气。但是生物质中含有大量的纤维素、半纤维素及木质素，这些物质因为多相性及结晶度很高，因此很难被大多数细菌直接利用转化为氢气。细菌直接利用这些物质产生氢气的底物转化率和速率是很低的或者不能利用而不产生氢气。因此，这些生物质在发酵制氢之前需经过预处理获得水解液然后进行发酵产氢。水解液中已糖(葡萄糖)和戊糖(木糖和少量阿拉伯糖)的含量分别占到55-65％和35-45％。水解液中的葡萄糖很容易被纯种或者混合产氢细菌生物转化为氢气。但是，很多细菌都不能有效的转化多种底物来发酵制氢气，这也成为生物制氢中的限制因素。生物发酵制氢的过程被许多因素如pH、底物浓度、温度及氮源等因素的影响。因此，为了有效的利用纤维素生物质水解液中的糖转化为氢气，获得高效的产氢细菌，特别是高效利用多种底物发酵产氢的细菌很重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用，该拜氏梭菌可降解多种碳源和氮源为底物制氢，同时可以得到生物燃料和小分子有机酸作为副产物，具有广泛的应用价值。
为达到上述目的，本发明是采用以下技术方案来实现的：
一种用于发酵产氢的拜氏梭菌，其分类命名为Clostridium beijerinckii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.9411。
该拜氏梭菌能够利用多种碳源和氮源进行生长并发酵产生氢气。
所述的碳源包括单糖、二糖和/或多糖；其中单糖包括葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和木糖；二糖包括纤维二糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖；多糖包括葡聚糖、淀粉、木聚糖和纤维素；所述的氮源包括酵母膏、蛋白胨、L-谷氨酸和铵盐。
该拜氏梭菌能够发酵产生生物燃料和小分子有机酸。
所述的生物燃料包括乙醇和丁醇，小分子有机酸包括乙酸和丁酸。
用于发酵产氢的拜氏梭菌的发酵方法，包括以下步骤：
1)取保存于-80℃的用于发酵产氢的拜氏梭菌CGMCC NO.9411的冻存液，将其划线于梭菌强化琼脂培养基平板上，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，直至培养得到单菌落；
2)挑取梭菌强化琼脂培养基平板上长出来的单菌落，无菌操作将其移入装有梭菌强化液体培养基的培养容器中，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，得到对数生长期的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液；
3)将得到的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液分装到离心管中，在4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，使菌体沉淀在离心管底部，然后倒掉上清液；
4)向底部含有菌体沉淀的离心管中加入产氢培养液并将菌体重悬，再次在4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，保留菌体沉淀；
5)重复步骤4)1～3次，然后向含有菌体沉淀的离心管中加入产氢培养液并重悬菌体，得到浓度为OD600＝1.0的重悬菌液，将重悬菌液作为接种菌源；
6)在产氢反应器中加入产氢培养液，然后以5～20％的体积比的接种量加入接种菌源；
7)向产氢反应器中通入氮气或惰性气体，除去其中的空气，然后将产氢反应器放在恒温水浴摇床上，以100～200rpm/min的转速，在25～45℃的温度下无光培养，直至产氢结束。
每升产氢培养液中含有以下物质：糖5～20g，谷氨酸钠0.1～2g，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液5～20mL，微量元素溶液10～30mL，余量为水；
每升微量元素溶液中含有以下物质：氨三乙酸5～15g，MgSO4·7H2O20～35g，FeSO4·7H2O0.01～1.2g，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.001～0.015g，CaCl2·2H2O1～4g，母液30～60mL，余量为水；
每100mL母液中含有以下物质：ZnSO4·7H2O0.5～1.5g，EDTA180～350mg,FeSO4·7H2O300～700mg，H3BO35～15mg，MnSO4·H2O80～200mg，CuSO4·5H2O20～50mg，Co(NO3)2·6H2O10～30mg，余量为水。
用于发酵产氢的拜氏梭菌作为发酵制氢的菌株的应用。
用于发酵产氢的拜氏梭菌作为发酵制生物燃料和小分子有机酸的菌株的应用。
用于发酵产氢的拜氏梭菌作为单细胞蛋白生产菌株的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明从牛粪滤液中分离获得了一株高效分解生物质产生氢气的菌株，并且研究了该菌株在生物发酵制氢过程中的主要影响因素，同时获得了一种利用该菌株高效降解底物产氢的发酵方法。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌，是一株具有特殊能力的新型梭菌，其菌落具有颜色为白色、边缘整齐、中间凸起、肥厚湿润及不透明等特点；菌体形状为长杆状，以二分裂方式繁殖。序列比对分析发现该新型菌株与已知的拜氏梭菌的相应序列的相似性为99.0％，初步认定其属于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌，在梭菌强化琼脂培养基上可以形成芽孢，说明该菌株是芽孢杆菌。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌，能以多种无机及有机碳源和氮源作为能源进行生长且在无氧条件产生高浓度氢气和低浓度的二氧化碳。这一特点用于生物质水解液及工业废水产氢发酵，较之于只能发酵生物质水解液中的葡萄糖的暗发酵细菌，可以降低生物质水解液及工业废水发酵制氢的成本，利于增加生物制氢的竞争性及市场推广力。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌，具有利用多种有机及无机氮源快速生长的能力，这一特点用于单细胞蛋白生产，较之于普通细菌，无需添加有机氮源，从而能够降低生产成本。并且生产得到的单细胞蛋白可作为家禽饲料等应用，但由于该菌具有轻微致病性(胃肠炎)，在作为饲料使用时，需先经灭活处理。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌，在厌氧条件下可以将底物降解为氢气和二氧化碳等气体，同时可以产生小分子有机物，使含有溴甲酚紫pH指示剂的培养基变黄。收集其产生的小分子有机物，采用液相色谱进行鉴定，表明小分子有机物中主要产物为丁酸、乙酸等小分子有机酸和可作为生物燃料的乙醇、丁醇等物质。这表明该拜氏梭菌可以作为暗-光两步法的前期暗发酵的菌种，同时也可以作为生物制乙醇、丁醇等生物燃料的生产菌种应用。
本发明提供的用于发酵产氢的拜氏梭菌的发酵方法，先将该菌株的冻存液进行厌氧培养，得到用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液，将菌株培养液离心后重悬菌体，得到的重悬菌液作为接种菌源，将接种菌源接入产氢培养液中在恒温水浴摇床上无光培养产氢。使用产氢培养液进行菌株的发酵培养能够很好的满足菌体对各种营养物质的需求，使得产氢量和产氢效率都大幅度提升。该方法具有成本低廉、操作简单、菌体生长快、氢气产量高、产速快等优点，并可同时得到价值较高的生物燃料作为副产物，而且适用于工业化规模生产，开发应用潜在价值大。
保藏说明
本发明所述的用于发酵产氢的拜氏梭菌进行了下述保藏：
保藏时间：2014年7月3日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC；保藏号为CGMCC NO.9411。
附图说明
图1为CGMCC NO.9411在梭菌强化琼脂培养基上的菌落形态图；
图2为CGMCC NO.9411在梭菌强化琼脂培养基上的菌体及芽孢在显微镜下的图片；
图3为CGMCC NO.9411在梭菌强化液体培养基中的电子显微镜下的图片；
图4为CGMCC NO.9411芽孢染色后在光学显微镜下的图片；
图5为CGMCC NO.9411在梭菌强化培液体养基中培养的图片；
图6为CGMCC NO.9411在梭菌强化液体培养基中培养管底物菌体沉降的图片；
图7为基于MEGA 5.016S rRNA序列的系统进化树；
图8为本发明使用的发酵制氢反应装置的示意图；
其中，1：产氢反应器；2：第一硅胶管；3：第一橡胶塞；4：第一止水夹；5：排水集气瓶；6：塑料管；7：第二橡胶塞；8：第二硅胶管；9：第二止水夹；10：量筒。
图9为CGMCC NO.9411以木糖为底物时不同氮源对其产氢影响的测试结果图，其中(a)为氢气产率、菌体干重和氢气产生速度与氮源的关系图，(b)为木糖降解率和发酵结束pH值与氮源的关系图，(c)为不同氮源下小分子有机物的产量图。
图10为CGMCC NO.9411以木糖为底物时不同pH值对产氢影响的测试结果图；其中(a)为氢气产率、菌体干重和氢气产生速度与pH值的关系图，(b)为木糖降解率和发酵结束pH值与pH值的关系图，(c)为不同pH值下小分子有机物的产量图。
图11为CGMCC NO.9411以木糖为底物时不同底物浓度对其产氢影响的测试结果图；其中(a)为氢气产率、菌体干重和氢气产生速度与底物浓度的关系图，(b)为木糖降解率和发酵结束pH值与底物浓度的关系图，(c)为不同底物浓度下小分子有机物的产量图。
图12为CGMCC NO.9411木糖为底物时不同温度对其产氢影响的测试结果图；其中(a)为氢气产率、菌体干重和氢气产生速度与温度的关系图，(b)为木糖降解率和发酵结束pH值与温度的关系图，(c)为不同温度下小分子有机物的产量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
以下对本发明的CGMCC NO.9411菌株的筛选和鉴定过程作进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
1.所用培养基特征、用途和配方：
本实验中所用培养基及产氢培养液中的水均为双蒸水，下面是实验中共同用的无机盐溶液配方。
磷酸盐缓冲液(1L)：KH2PO468.05g,K2HPO4114.1g,pH值6.8，余量为水。
微量元素溶液(1L)：氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid)5～15g，MgSO4·7H2O20～35g，FeSO4·7H2O0.01～1.2g，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.001～0.015g，CaCl2·2H2O1～4g，母液30～60mL，余量为水。
母液(100mL)：ZnSO4·7H2O0.5～1.5g，EDTA180～350mg，FeSO4·7H2O300～700mg，H3BO35～15mg，MnSO4·H2O80～200mg，CuSO4·5H2O20～50mg，Co(NO3)2·6H2O10～30mg，余量为水。
1)产氢培养液，其组成为：糖(主要为单糖和/或多糖)5～20g/L，谷氨酸钠0.1～2g/L，KH2PO4-K2HPO45～20mL/L，微量元素溶液10～30mL/L，溶剂为水。
2)梭菌强化液体培养基：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl3g，NaAc3g，水1000mL，pH值7.0，刃天青3mg/L，121℃湿热灭菌30min。
3)梭菌强化琼脂培养基：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl3g，NaAc3g，水1000mL，pH值7.0，刃天青3mg/L，琼脂粉20g，121℃湿热灭菌30min。
2.菌源采集和富集培养：
在西安市郊区采集牛粪，在105℃烘干3h以杀死产甲烷菌，之后取10g烘干的牛粪在50mL的无菌双蒸水中浸泡2h，之后用200目筛过滤浸泡的牛粪，获得滤液。该滤液为分离细菌的混合菌源。
配制菌源富集培养基(梭菌强化液体培养基)分装入80mL/100mL血清瓶，冷却至室温，之后在无菌工作台上向每个80mL的培养基中加入10mL的牛粪滤液，放于厌氧培养箱中富集培养。
所得到的富集培养物中包含了富集得到的混合菌源。
3.用于发酵产氢的拜氏梭菌的初筛：
将富集培养物以不同的梯度稀释并涂布在梭菌强化琼脂培养基的平板上，放于厌氧培养箱中30℃恒温培养，不定时观察平板上菌落的生长情况。
挑取菌落形态不同的单菌落在梭菌强化琼脂培养基上进行划线纯化同时依据形态进行编号。划线纯化三次之后，获得的纯菌种在梭菌强化液体培养基中进行富集培养，48h后以该菌种为菌源以10％的比例接种到产氢培养液中进行产氢测试。所获得的44株纯细菌中有一株细菌产氢效果最佳，该菌即为CGMCC NO.9411。
4.拜氏梭菌CGMCC NO.9411的形态学鉴定：
为了对该菌进行分类，首先对分离的拜氏梭菌进行了基本的形态学鉴定。具体方法和结果如下：
4.1菌落形态和细胞形态：
按照常规操作，稀释涂布法接种CGMCC NO.9411于梭菌强化琼脂培养基上，30℃培养2天后观察单菌落形态如图1所示，可见该菌菌落呈乳白色，菌落边缘整齐，湿润、菌落中央凸起不透明。显微镜下观察培养物的形态，结果如图2所示。可见该菌株细胞呈杆状，有芽孢生成，可以进行二分裂繁殖。电子显微镜下细菌形态以及大小如图3所示，菌体杆状直径0.8～1.0μm×2.0～2.5μm左右，图5及图6为CGMCC NO.9411在梭菌强化液体培养基中培养物的图片，可以看到在图5的管子上部有气泡，说明有大量的气体产生，梭菌强化液体培养基浑浊并且呈现乳白色，在梭菌强化液体培养基的底部形成了大量的白色菌体沉淀如图6所示，这说明该细菌菌体生长速度很快。
4.2芽孢的观察鉴定：
按照经典试验方法，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，用着色力强的染色剂(如孔雀石绿)在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液(如沙黄水溶液)染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。结果如图4所示。可见该菌株CGMCC NO.9411产生了芽孢，是芽孢杆菌的特征之一。
5.菌株的分子生物学分类鉴定：MEGA 5.0 16S rRNA序列分析。
16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S RNA即16S ribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。16S rRNA具有高度的保守性和特异性并且该基因序列足够长(包含约50个功能域)。原理为将菌株采用通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1492R(5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3')进行PCR扩增获得1471bp的16S rRNA的片段并送上海生工进行PCR产物的测序，获得序列如SEQ.ID.NO.1所示。该序列已提交至NCBI数据库，并获得GenBank序列号(accessionnumber)为JX560483。
用NCBI的BLAST分析工具，将序列与GenBank数据库中的其他DNA序列进行序列比对分析，发现该序列与多株已知的拜氏梭菌对应序列覆盖率高达96％以上，且相似性高达99％。用mega5.0软件构建依赖于序列的系统进化树，并计算菌株间的序列遗传距离，结果如图7所示。该结果表明，菌株CGMCC NO.9411，即图中命名为CGMCC NO.9411(JX560483)的比对菌株，与已知的Clostridium beijerinckii NCIMB8052的16S rRNA序列相似性高达99.0％，没有大的差异。树状图中涉及的菌株，全部属于梭菌。由此推定菌株CGMCC NO.9411可能是拜氏梭菌的一个新变种。
6.拜氏梭菌CGMCC NO.9411的发酵方法：
具体步骤为：
1)取保存于-80℃冰箱中的用于发酵产氢的拜氏梭菌CGMCC NO.9411冻存液，取少量划线于梭菌强化琼脂培养基平板上，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，直至培养得到单菌落；
2)挑取梭菌强化琼脂培养基上长出来的单菌落，无菌操作将其移入装有50mL的梭菌强化液体培养基的100mL血清瓶中，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，得到对数生长期且菌体浓度足够的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液；
3)取得到的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液，将其分装入50mL离心管中，在4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，使菌体沉淀在离心管底部，然后倒掉上清液；
4)然后向底部含有菌体沉淀的离心管中加入25mL的产氢培养液并将菌体重悬，之后于4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，保留菌体沉淀；
5)重复步骤4)1～3次，然后向每支含有菌体沉淀的离心管中加入产氢培养液10～40mL并重悬菌体，得到浓度为OD600＝1.0的重悬菌液，将重悬菌液作为接种菌源；
6)在体积为330mL的产氢反应器1(图8所示)中加入150mL的产氢培养液，之后加入步骤5)中所获得的接种菌源，加入的接种菌源的体积为产氢培养液体积的5～20％；
7)向产氢反应器1和排水集气瓶5中通入高纯氮气，以除尽发酵制氢反应装置中的空气成分，之后在产氢反应器1上塞上第二硅胶塞7，在排水集气瓶5上塞上第一橡胶塞3，并在产氢反应器1的8第二硅胶管上夹上第二止水夹9，在用于连接产氢反应器1和排水集气瓶5的塑料管6上夹上第一止水夹4；
8)然后将产氢反应器1放于恒温水浴摇床中，以100～200rpm/min的转速，在25～45℃的温度下无光培养，直至产氢结束。整个产氢周期最大为36h。
7.对拜氏梭菌CGMCC NO.9411利用多种碳源发酵产氢能力的测试：
对于产氢菌株来说，底物的利用类型很重要，特别是对于复杂的碳源的利用能力。因此，单糖(葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和木糖)，二糖(纤维二塘、乳糖和麦芽糖)，多糖(葡聚糖、淀粉、木聚糖和纤维素)，无机氮源(铵盐)和有机氮源(酵母膏、蛋白胨、L-谷氨酸和谷氨酸钠)均被测试对CGMCC NO.9411(Clostridium beijerinckii YA001)产氢的影响。在pH为6.86，温度为37℃，碳源浓度为10g/L的条件下，不同碳源对产氢的影响的测试结果与之前文献发表的对比结果在表1中。最高的氢气总产量在以葡聚糖为底物时被获得，产量为240.79mL H2/g，最低的氢气总产量在以甘露糖为底物时被获得，产量为1.75mL H2/g。葡萄糖、蔗糖、葡聚糖的氢气产率分别为81.88mL H2/g、137.65mL H2/g和240.79mL H2/g。有意思的发现是，CGMCC NO.9411这株细菌具有利用复杂糖比单糖具有更高的产氢能力。以甘露糖为底物时，获得最低的氢气产量(1.75mL H2/g)和更长的延迟时间(15h～15.5h)。除此之外，纤维素和可溶性淀粉很难被利用。这些现象证明了该菌在利用生物废弃物和废水时具有很好的产氢潜力，因为这些废弃物和废水的组成中有很多均为上述测试物质。
表1各菌株以多种有机及无机碳源和氮源作为能源产氢的测试结果
注：“+”表示可以利用，“ND”表示没有测试。菌株DMHC-10参考文献(Kamalaskar,L.B.,et al.,High biohydrogen yielding Clostridium sp.DMHC-10 isolated fromsludge of distillery waste treatment plant.International Journal of HydrogenEnergy,2010.35(19):p.10639-10644.)；菌株Fanp3参考文献(Pan,C.M.,et al.,Fermentative hydrogen production by the newly isolated Clostridiumbeijerinckii Fanp3.International Journal of Hydrogen Energy,2008.33(20):p.5383-5391.)。
8.对拜氏梭菌CGMCC NO.9411的降解木糖产氢的能力的验证：
为了验证所获菌株的降解木糖发酵产氢能力及最适合条件，采用图8所示的发酵制氢反应装置进行产氢测试，通过排水集气的方法收集氢气并通过量筒10测量第一硅胶管2流出来的水的体积，来获得产生气体的体积。其中排水集气法中所用的水为pH＝2.0的盐水，以降低氢气的溶解性，所使用的第一、第二硅胶管和第一、第二橡胶塞都是能够防止氢气泄露的。通过气相色谱仪对产氢反应器1的上端气体进行分析获得氢气的浓度，从而获得产生氢气的总体积。定时采取样品从发酵产氢装置中的第二硅胶管8中用无菌的注射器吸取，测试菌体干重、发酵液pH值及液相产物。
9.氮源对于CGMCC NO.9411产氢的影响：
为了考察氮源对于CGMCC NO.9411产氢的影响，在产氢培养液中的氮源采用无机氮源和有机氮源分别进行测试(以木糖为底物)，结果如图9所示。图9说明了氮源对于CGMCCNO.9411有很大的影响。当培养基中酵母膏作为氮源时，显示了最高的氢气产率为1.63molH2/mol木糖，细胞干重为1.4g/L，VFAs和最终的pH值为4.47。规律显示，当以有机氮源为氮源时，氢气产量普遍高于无机氮源。类似的结果也多次被报道。氮源对产氢的影响的测试说明了当以酵母膏作为氮源时，可以获得最高的氢气产量，为1819.02mL H2/(L·h)。当以无机氮源(NH4)2SO4为单一氮源时，也可以获得相当高的氢气产量，为1294.95mL H2/(L·h)。这些结果显示了CGMCC NO.9411可以利用成本低廉的无机氮源代替有机氮源产氢，这也表明CGMCC NO.9411具有很大的工业化应用的潜能。
10.pH值对CGMCC NO.9411产氢影响的测试结果：
为了考察pH值对于CGMCC 9411产氢的影响，调节产氢培养液的初始pH值范围为5.0～10.0(以木糖为底物)。结果如图10所示。图10说明了pH值对于CGMCC NO.9411发酵制氢有很大的影响。pH值从5.0增加到8.0时，氢气产率从1.16增加到1.86mol H2/mol木糖，当pH值大于8.0增至10.0时，氢气产率随着pH值增加而降低。在pH值为8.0时，获得最大的氢气产率及最大氢气产生速率分别为1.86mol H2/mol木糖和236.2mL H2/(L·h)。
11.CGMCC NO.9411以木糖为底物时底物浓度对产氢影响的测试结果：
初始底物浓度在氢气的生产过程中通常有很重要的作用和影响。在pH值为8.0的条件下，初始木糖浓度对氢气生产的影响研究，如图11所示。图11显示了不同木糖浓度对氢气生产的影响。木糖浓度从5.0g/L增加至10.0g/L时，氢气产率、氢气的产量和细胞干重均随木糖浓度增大而增加，并且在木糖浓度为10g/L时，最大氢气产率，氢气产生速率，细胞干重均达到最大值，分别为1.86mol H2/mol木糖，236.16mL H2/(L·h)，1.8g/L。随着木糖浓度的继续增加，最大氢气产率，氢气产生速率，细胞干重均减小。这一现象被归因于底物浓度过大，对细菌产生了底物抑制现象。
12.温度对CGMCC NO.9411产氢影响的测试结果：
培养温度对于CGMCC NO.9411产氢的影响结果显示在图12中。最大氢气产率、氢气产生速率、细胞干重均随着温度从30℃至40℃增加而增大，然后随着温度进一步增加，最大氢气产率、氢气产生速率、细胞干重均开始急剧减小。在培养温度为40℃时，最大氢气产率，氢气产生速率，细胞干重均获得最大值分别为2.31mol H2/mol-木糖、311.30mL H2/(L·h)和1.85g/L。VFAs显示了与细胞干重随温度变化而变化的相同趋势，但发酵最终pH值却与VFAs随温度变化的趋势相反。本研究的结果显示：过低或过高的温度都将抑制细菌CGMCCNO.9411和生长和氢气的生产。这种现象被归因于温度对于生物体内酶的失活作用。当温度超过酶的临界温度时，在产氢系统中的主要酶如乙酰转移酶、乙酸激酶和氢酶等酶，都会随着温度的增加而活性降低。
综上，新分离的高效产氢细菌CGMCC NO.9411(Clostridium beijerinckiiYA001)，它是一株嗜温的、厌氧的拜氏梭菌。最优化的产氢条件是pH值8.0，10％的底物浓度，培养温度为40℃和酵母膏作为有机氮源。菌株Clostridium beijerinckii YA001能够利用许多氮源和碳源产氢，这也说明该菌具有很高的工业应用价值。通过菌落形态观察、细胞个体形态观察、芽孢观察和16S rRNA序列比对分析，结果表明，该CGMCC NO.9411为拜氏梭菌的一个新变种。在厌氧条件下能够降解生物质产生氢气和二氧化碳同时产生乙酸和丁酸等小分子有机酸，同时会产生乙醇以及丁醇等生物燃料物质。
基于以上特点，该梭菌能够应用于如下三个方面，且比现有菌株更具有显著的优势：
首先，该菌株能利用多种自然界中常见并且难以被多数菌株利用的碳源进行菌体生长和发酵制氢，与现有的只能以葡萄糖作为碳源的产氢发酵菌株相比，可以更加充分的降解纤维素生物质水解液中的还原糖(主要成分葡萄糖和木糖)，使得底物利用率更高，氢气产率更高，因此显著地降低发酵成本。
此外，该菌株在厌氧条件下能够高效降解木糖产生氢气和二氧化碳同时产生乙酸和丁酸等小分子有机酸，同时会产生乙醇以及丁醇等生物燃料物质。因此，可以作为生物燃料乙醇、丁醇生产的最主要的微生物菌种。
最后，本发明提供了的利用该菌株高效发酵产氢的条件为：pH值8.0，10％的底物浓度，培养温度为40℃和酵母膏作为有机氮源，此时可获得最大氢气产率和最大的氢气产生速率分别为2.31mol H2/mol-木糖和311.3mLH2/(L·h)。
本发明公开了一种用于发酵产氢的拜氏梭菌及其发酵方法和应用，该专用菌属于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.9411。该菌不仅可利用葡萄糖发酵制氢，还可利用自然界常见且难以被大多数微生物利用的碳源及氮源发酵制氢，在发酵制氢的同时会生产乙醇及丁醇等生物燃料。成为目前报道的首例多功能型新型拜氏梭菌菌株；可以应用于生物质产氢发酵、乙醇丁醇生物燃料生产，将在自然界大量存在的废弃生物质如农作物秸秆、树叶等生物质发酵制氢的应用中，具有极为广泛的应用前景。
Claims (4)
1.一种用于发酵产氢的拜氏梭菌，其特征在于：其分类命名为Clostridiumbeijerinckii，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9411。
2.权利要求1所述的用于发酵产氢的拜氏梭菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取保存于-80℃的用于发酵产氢的拜氏梭菌CGMCC NO.9411的冻存液，将其划线于梭菌强化琼脂培养基平板上，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，直至培养得到单菌落；
2)挑取梭菌强化琼脂培养基平板上长出来的单菌落，无菌操作将其移入装有梭菌强化液体培养基的培养容器中，在20～40℃的厌氧培养箱中培养20～48h，得到对数生长期的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液；
3)将得到的用于发酵产氢的拜氏梭菌培养菌液分装到离心管中，在4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，使菌体沉淀在离心管底部，然后倒掉上清液；
4)向底部含有菌体沉淀的离心管中加入产氢培养液并将菌体重悬，再次在4000～8000rpm/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，保留菌体沉淀；
5)重复步骤4)1～3次，然后向含有菌体沉淀的离心管中加入产氢培养液并重悬菌体，得到浓度为OD600＝1.0的重悬菌液，将重悬菌液作为接种菌源；
6)在产氢反应器中加入产氢培养液，然后以5～20％的体积比的接种量加入接种菌源；
7)向产氢反应器中通入氮气或惰性气体，除去其中的空气，然后将产氢反应器放在恒温水浴摇床上，以100～200rpm/min的转速，在25～45℃的温度下无光培养，直至产氢结束；
其中，梭菌强化琼脂培养基的成分为：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，水1000mL，pH值7.0，刃天青3mg/L，琼脂粉20g；
梭菌强化液体培养基的成分为：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，水1000mL，pH值7.0，刃天青3mg/L；
每升产氢培养液中含有以下物质：糖5～20g，谷氨酸钠0.1～2g，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液5～20mL，微量元素溶液10～30mL，余量为水；
每升微量元素溶液中含有以下物质：氨三乙酸5～15g，MgSO4·7H2O 20～35g，FeSO4·7H2O 0.01～1.2g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001～0.015g，CaCl2·2H2O 1～4g，母液30～60mL，余量为水；
每100mL母液中含有以下物质：ZnSO4·7H2O 0.5～1.5g，EDTA 180～350mg,FeSO4·7H2O300～700mg，H3BO3 5～15mg，MnSO4·H2O 80～200mg，CuSO4·5H2O 20～50mg，Co(NO3)2·6H2O 10～30mg，余量为水。
3.权利要求1所述的用于发酵产氢的拜氏梭菌作为发酵制氢的菌株的应用。
4.权利要求1所述的用于发酵产氢的拜氏梭菌作为发酵制生物燃料和小分子有机酸的菌株的应用。
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