CN101423813B

CN101423813B - 重组梭菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN101423813B
Application number: CN2008102395575A
Authority: CN
Inventors: 王少华; 张延平; 董红军; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101423813A

Abstract

本发明公开了一种重组梭菌及其构建方法与应用。构建重组梭菌的方法，是将编码甲酸脱氢酶的基因导入梭菌中构建重组菌。所述梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。本发明还公开了一种生产丁醇的方法，是发酵培养由所述构建重组梭菌的方法构建的重组菌生产丁醇。本发明构建的重组丙酮丁醇梭菌发酵生产丁酮的产量最高可达到14.1g/L。

Description

重组梭菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及重组梭菌及其构建方法与应用。

背景技术

化石能源的不可再生性以及储存的有限性是现代社会面临的一个重大问题。这导致原油价格一直呈上升趋势，给国家的经济发展带来了沉重的负担。化石燃料大量使用的同时也带来了严重的环境问题。化石燃料的燃烧急剧增加大气中二氧化碳的含量，造成温室效应，使全球气候变暖。另外化石燃料在燃烧过程中排放的硫化物，氮化物导致大面积范围的酸雨，破坏了环境。因此，亟需寻求可以替代的并且具有环境友好的可再生燃料。生物质是大自然中取之不尽的资源，具有可再生性，并且被利用后不会向环境中排放更多的二氧化碳。因此利用生物质作为原料生产生物能源具有广阔的前景。目前利用生物质生产的并且已经广泛使用的生物燃料包括生物乙醇和生物柴油。

丁醇是一种重要的化工原料，可以用来合成丙烯酸脂、丙烯酸甲酯、乙二醇醚、乙酸丁酯、正丁胺、氨基树脂的前体的大宗化学产品。丁醇也可以可用于生产粘合剂、生物碱、抗生素、樟脑、防冻液、人造牙齿、洗涤剂、人造橡胶、电子产品、乳化剂、化妆品、纤维制品、凝聚剂、浮选酸(如丁基黄药)、硬表面清洗剂、激素、维生素、刹车和制动液、工业覆膜、唇膏、指甲保护产品、油漆、油漆稀释剂、香料、杀虫剂、塑料、油墨、树脂、防弹玻璃、剃须膏及个人护理产品、表面覆膜、超级吸附剂、人造水果调料、人造丝、在纸层析和薄层色谱中作为流动相、作为油料添加剂，用于造纸和皮革业中的最后处理等。研究表明，丁醇也是一种优良的生物燃料。使用丁醇替代乙醇作为生物燃料有很多优点。第一，丁醇能单独或者以任意比例混合汽油使用，而乙醇最大混合比例只能达到85％。第二，丁醇单独使用或添加到燃料中去使用时，对目前的汽车发动机不需要任何改造。第三，丁醇蒸气压较低，易于安全运输。第四，丁醇不易吸水，可以在汽油储藏和分装之前与之混合，而乙醇混合汽油之后必须马上使用，这个特点使丁醇万一泄露也不会污染地下水。第五，丁醇腐蚀性低，这意味着现有的基础设施(油罐、输送管道、泵等)仍然可以使用。第六，丁醇的热容量更高，这提高了公里/汽油混合率。2007年BP和DuPont公司宣布在英国重新启动ABE发酵工程以作为生物燃料供应英国市场，所以生物丁醇生产的研究有着光明的前景。

然而，发酵法生产丁醇目前仍存在溶剂浓度低，底物成本高等技术障碍。造成了生物发酵法生产丁醇与化学合成法相比目前仍然不具有价格竞争优势。因此，需要对现有的菌株进行遗传改造，获得性状优良的新型菌株应用于生产。目前，在这一方已进行了大量研究工作，开发出了应用于丙酮丁醇梭菌的穿梭质粒载体，以及新兴的用于插入突变获得表型突变株的二型内含子。已经通过过量表达与溶剂合成途径相关的基因以及提高耐受性的热激蛋白基因构建了基因工程菌株，另外也利用同源重组获得的一些代谢途径基因突变菌株。但是目前产量的水平仍不具有与化学合成竞争的能力，因此仍需进行深入的研究。

通过对丙酮丁醇梭菌的代谢途径进行分析后发现，在丁醇产生过程中需要消耗大量的还原力NADH，在此过程中还要产生乙醇、氢气等消耗还原力的物质。但是在代谢过程中仅能产生有限的NADH，因此考虑通过提高NADH供给的办法来提高丁醇的产量。

甲酸脱氢酶(FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类，根据4级结构、辅基的构象和类型以及底物特异性的区别，分为几种不同的类型，其中很重要的一类就是NAD⁺依赖型的甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2)，它可以将甲酸氧化为CO₂，同时将NAD⁺还原为NADH，该类型的甲酸脱氢酶由2个相同的亚基组成，不包含金属离子和辅基，并且对甲酸和NAD⁺具有高度的专一性。NAD依赖型FDH催化过程的一个显著特征是来自底物的氢离子直接转移到NAD⁺的烟碱C₄原子上，无需酸碱催化步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组梭菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的构建重组梭菌的方法，是将编码甲酸脱氢酶的基因导入梭菌中构建重组菌。

其中，所述甲酸脱氢酶可是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸由a)衍生的蛋白质。

为了使a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述编码甲酸脱氢酶的基因具体可是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码甲酸脱氢酶的DNA分子；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码甲酸脱氢酶的DNA分子。

所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述编码甲酸脱氢酶的基因还经过甲基化修饰。所述梭菌为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。所述丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1CGMCC №.2287。

由构建重组梭菌的方法制备的重组梭菌也属于本发明的保护范围。

所述重组梭菌具体可为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF)CGMCC No.2798。

本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。

本发明所提供的生产丁醇的方法，是发酵培养所述重组梭菌生产丁醇。

其中，每升发酵培养的培养基含KH₂PO₄ 0.5-1.0g；K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2-0.8g；MnSO₄·H₂O 0.01-0.05g；FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05g；NaCl 0.1-2.0g；酵母粉2.0-5.0g；(NH₄)₂SO₄ 0.5-2.0g；葡萄糖60-80g。

所述发酵培养基中还含有25-100mg/L的红霉素，所述发酵培养基还包含1mM

丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的代谢途径中都具有产生甲酸的步骤。本发明构建重组丙酮丁醇梭菌的方法将甲酸脱氢酶导入丙酮丁醇梭菌中，并在丙酮丁醇梭菌内表达，甲酸脱氢酶以NAD⁺为底物，能够产生NADH，来增加胞内NADH的供给，从而提高了丁醇的产量。该方法构建重组拜氏梭菌也能获得相同的效果。本发明构建的重组丙酮丁醇梭菌发酵生产丁酮的产量最高可达到14.1g/L。

附图说明

图1为重组表达载体pITF的结构示意图。

图2为PCR鉴定含有重组表达载体pITF的丙酮丁醇梭菌。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。下述实施例的实验结果均为三次重复实验的平均值。

下述实施例以丙酮丁醇梭菌为例阐明本发明的构建重组梭菌的方法。

实施例1、构建表达甲酸脱氢酶的丙酮丁醇梭菌

从博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)2.2160(中国普通微生物菌种保藏管理中心中心)(http://www.cgmcc.net/index.php/Contents/search)基因组中扩增甲酸脱氢酶(fdh)，扩增fdh基因的引物如下：

fdh-A：AGTGTCGACAGGTGCTGTCAATGTGGT；

fdh-B：AGTGGATCCGTGCTCCCGTCATTATCT。

PCR扩增产物连至表达载体pIMP1(Mermelstein，L.D.，N.E.Welker，G.N.Bennett，and E.T.Papoutsakis.(1992).Expression of cloned homologousfermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Bio/Technology.10：190-195)(中国科学院微生物研究所)上，获得重组表达载体pITF(图1)，连接转化后测序验证，测序结果表明扩增fdh基因的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列1，编码序列表中序列2所示的蛋白。

由于已经证明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824中含有限制性内切酶Cac824I，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在对丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1 CGMCC №.2287(专利号：200810102673.2)进行转化前对重组表达载体pITF进行甲基化修饰。具体操作步骤为从E.coliJM109中提取的pITF转入E.coli ER2275(E.coli ER2275含质粒pAN1，pAN1含来自枯草芽孢杆菌的Φ3T甲基化酶基因)(Mermelstein，L.D.and E.T.Papoutsakis(1993).″In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillussubtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids fromrestriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824.″Appl.Environ.Microbiol.59(4)：1077-1081.)(中国科学院微生物研究所)中进行甲基化，获得甲基化的重组表达载体pITF。

制备梭菌感受态的培养基为强化梭菌培养基(RCM)(每升RCM培养基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH 6.8)。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1 CGMCC №.2287(专利号：200810102673.2)菌体生长至OD₆₀₀＝0.8时，收集菌体，用ETB溶液(270mM蔗糖，5mM磷酸二氢钠，pH 7.4)洗涤菌体两次，最后用适量ETB溶液悬浮菌体，分装成600μl/管待转化。所有操作保持菌体在厌氧状态及冰上(4℃离心)。

将甲基化的重组表达载体pITF与菌体混合，置于冰上10min，然后将混合物转移至4mm电击杯内进行转化，使用的电转化参数为：电压2.0kV，电容25μF，电阻∞。典型电击持续时间为12ms。电转化完毕后，立即将菌液转至10ml RCM培养基中，复壮6-8h，涂布于含25μg/ml红霉素的RCM平板上，37℃培养36h。

随机挑取红霉素抗性菌落接种于含50μg/ml红霉素液体培养基中，培养24h后提取基因组DNA，用引物fdh-A和fdh-B进行PCR鉴定(图2)，获得含有重组表达载体pITF的丙酮丁醇梭菌，命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITF)。

图2中，“1”代表DNA Marker；“2”代表丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF)；“3”代表丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pIMP1)。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF)在用RCM培养基中37℃静置培养至对数期，作为发酵种子液。

发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L玉米粉培养基(每100mL水中加入8.0g玉米粉，加热糊化)的7L发酵罐中，同时加100mg/L的红霉素，37℃，静止发酵。用液相色谱检测发酵48小时后的发酵液。以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)作为对照。液相色谱检测条件如下：样品前处理：12000rpm离心1min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤；色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H₂SO₄，流速0.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。

表2.液相色谱检测48小时的发酵液的结果

菌株	丁醇(g/L)	丙酮(g/L)	乙醇(g/L)
				丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMP1)	11.0	4.7	1.4
丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF)	11.8	5.0	1.8

发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L玉米醪培养基(每100mL水中加入8.0g玉米淀粉，加热糊化)的7L发酵罐中进行发酵，添加不同浓度(0mM、1mM、2mM)的甲酸钠，同时加100mg/L的红霉素，37℃，静止发酵。用液相色谱检测发酵48小时后的发酵液。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMP1)作为对照。

表3.液相色谱检测添加不同浓度的甲酸钠的48小时的发酵液的结果

添加不同浓度的甲酸钠时，对丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMP1)产丁醇的能力有了较大影响，添加1mM甲酸钠时，丁醇产生量从11.0g/L下降至1.2g/L。丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF)添加1mM甲酸钠时，丁醇产量提高到12.9g/L。

将丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF)用RCM培养基于37℃温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。进行如下的发酵实验：

(1)发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L CGM培养基(每升CGM培养基含KH₂PO₄，0.75g；K₂HPO₄·3H₂O，0.75g；MgSO₄·7H₂O，0.4g；MnSO₄·H₂O，0.01g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；NaCl，1.0g；酵母提取物，5.0g；(NH4)₂SO₄，2.0g；葡萄糖，80g)培养基的7L发酵罐中，同时加100mg/L的红霉素和1mM甲酸钠，控制发酵罐pH为5.0，37℃，200rpm发酵。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMP1)作为对照。

(2)发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L CGM培养基(每升CGM培养基含KH₂PO₄，0.75g；K₂HPO₄·3H₂O，0.75g；MgSO₄·7H₂O，0.4g；MnSO₄·H₂O，0.01g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；NaCl，1.0g；酵母提取物，5.0g；(NH4)₂SO₄，2.0g；葡萄糖，80g)培养基的7L发酵罐中，同时加100mg/L的红霉素，控制发酵罐pH为5.0，37℃，200rpm发酵。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMP1)作为对照。

用液相色谱检测发酵60小时后的各个发酵液。

表4.液相色谱检测添加1mM甲酸钠的60小时的发酵液的结果

丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF)产丁醇能力有了较大提高，在不添加甲酸钠时丁醇的产量提高了31.2％。当甲酸钠存在情况下，对照菌株的产量大幅度下降，此时工程菌株的产量达到了14.1g/L。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF)中的一株菌在发酵60小时后，其发酵液中的丁醇产量为14.1g/L，将该菌株已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2798。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>重组梭菌及其构建方法与应用

<130>CGGNARW82068

<160>2

<210>1

<211>1046

<212>DNA

<213>博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)

atgaagatcg ttttagtctt atacgatgct ggtaaacacg ctgccgatga agaaaaatta 60

tacggttgta ctgaaaacaa attaggtatt gccaattggt tgaaagatca aggacatgaa 120

ttaatcacca cgtctgataa agaaggcgga aacagtgtgt tggatcaaca tataccagat 180

gccgatatta tcattacaac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagaatcgac 240

aaggctaaaa aattgaaatt agttgttgtc gctggtgtcg gttctgatca tattgatttg 300

gattatatca accaaaccgg taagaaaatc tccgttttgg aagttaccgg ttctaatgtt 360

gtctctgttg cagaacacgt tgtcatgacc atgcttgtct tggttagaaa ttttgttcca 420

gctcacgaac aaatcattaa ccacgattgg gaggttgctg ctatcgctaa ggatgcttac 480

gatatcgaag gtaaaactat cgccaccatt ggtgccggta gaattggtta cagagtcttg 540

gaaagattag tcccattcaa tcctaaagaa ttattatact acgattatca agctttacca 600

aaagatgctg aagaaaaagt tggtgctaga agggttgaaa atattgaaga attggttgcc 660

caagctgata tagttacagt taatgctcca ttacacgctg gtacaaaagg tttaattaac 720

aaggaattat tgtctaaatt caagaaaggt gcttggttag tcaatactgc aagaggtgcc 780

atttgtgttg ccgaagatgt tgctgcagct ttagaatctg gtcaattaag aggttatggt 840

ggtgatgttt ggttcccaca accagctcca aaagatcacc catggagaga tatgagaaac 900

aaatatggtg ctggtaacgc catgactcct cattactctg gtactacttt agatgctcaa 960

actagatacg ctcaaggtac taaaaatatc ttggagtcat tctttactgg taagtttgat 1020

tacagaccac aagatatcat cttatt 1046

<210>2

<211>348

<212>PRT

<213>博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)

<400>2

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn

20 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Gly Asn Ser Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile

50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Asp Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Gln Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu

340 345

Claims

1.丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF)，其保藏号为CGMCCNo.2798。

2.一种生产丁醇的方法，是发酵培养权利要求1所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF)生产丁醇。

3.根据权利要求2所述的方法，所述发酵培养的培养基每升中包含如下物质：KH₂PO₄ 0.5-1.0g；K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2-0.8g；MnSO₄·H₂O 0.01-0.05g；FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05g；NaCl 0.1-2.0g；酵母粉2.0-5.0g；(NH4)₂SO₄ 0.5-2.0g；葡萄糖60-80g。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中还含有25-100mg/L的红霉素，所述发酵培养基还包含1mM甲酸钠。