CN103320357A - 一种可提高白酒风味的醋酸菌及其白酒酿造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可提高白酒风味的醋酸菌(Acetobacter sp.)HJB-012，属于白酒酿造技术领域。该菌株已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6982。HJB-012菌株为异型厌氧发酵，既产乙酸又产乳酸，具有良好的产酸产酯性能，可有效改善白酒品质、提高白酒风味。菌株HJB-012应用于白酒酿造中，为白酒酿造补充了重要功能菌，进行强化制酒，可为现代自动化制酒工艺的改进提供理论依据和技术支持，为推动传统产业的升级提供技术指导，该技术的推广对老白干香型及其它香型白酒的生产也具有非常重要的实践意义。
Description
技术领域
本发明属于白酒酿造技术领域，具体是一种可提高白酒风味的醋酸菌(Acetobacter sp.)HJB-012及其在白酒酿造中的应用。
背景技术
醋酸菌属好氧性的革兰氏阴性菌，易变异，是氧化细菌的重要菌种。在白酒生产过程中，醋酸菌在发酵过程中产生的醋酸是白酒的主要香味成分，同时也是丁酸、己酸及其酯类的前提物。若醋酸菌发酵适量，可提高白酒的口味品质，但若控制不当，将会给生产带来灾难，如管理不善，卫生不好，导致酒中醋酸过剩，从而影响白酒的口味，同时也会影响酵母的生长代谢。醋酸菌在白酒酿造过程中同时也可产生适量乳酸，以乳酸为前提物质可进行多种白酒风味物质的合成，如丙酸菌可以利用乳酸产生丙酸、丁酸菌可以利用乳酸为碳源生成丁酸、乳酸通过酯化生成乳酸乙酯。
由此可见，醋酸菌在白酒酿造中即是有害菌又是必不可少的有益菌、功能菌，固态法白酒酿造是开放式的，操作中势必带入一些醋酸菌，成为白酒中醋酸的主要来源，普通的醋酸菌为好氧性发酵，具有强氧化性，可以利用氧气将乙醇氧化为乙酸，大量醋酸菌的引入势必会产生大量醋酸，导致酒中醋酸过剩，同时也会产生大量的其它羧酸，从而影响白酒的口味，也会影响酵母的生长代谢，给生产造成不可挽回的损失。
如何解决开放式发酵中醋酸菌的引入；如何控制白酒酿造中醋酸、乳酸等代谢产物使之平衡；如何筛选出优良的醋酸菌株并将其应用于白酒酿造中，生产出品质卓越，风味独特的优质白酒是本行业技术人员的长期追求。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种既产乙酸又产乳酸，具有良好的产酸产酯性能，可有效改善白酒品质、提高白酒风味的醋酸菌菌株。
本发明所述菌株具体为醋酸菌(Acetobacter sp.)HJB-012，是从河北衡水老白干酒业股份有限公司的大曲中分离得到的，该菌株已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCC NO.6982。
所述HJB-012菌株的细胞呈短杆状，单生或成链存在，在醋酸菌固体培养基培养2天后，形成暗白色菌落，直径约1mm，表面湿润，圆形，低凸起，边缘整齐，革兰氏染色阴性。
所述HJB-012菌株为异型厌氧发酵，既产乙酸又产乳酸，具有良好的产酸产酯性能，微氧环境有利于发酵产酸。
所述HJB-012菌株在温度35℃，接种量4％，培养时间96h和pH值6.5，其产酸量达到34.436g/L，其中乙酸为33.553g/L，乳酸为0.883g/L，产乙酸乙酯1.42mg/100ml。
本发明所解决的另一技术问题是利用所述HJB-012菌株酿造白酒的方法，包括如下步骤：
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，35-37℃培养24-48h，活化两次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
所述醋酸菌固体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，35-37℃培养24-48h，然后将培养好的发酵液以5％-10％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，32-35℃培养16h-18h，最后再将培养好的发酵液以4％-6％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中32-35℃培养16-18h，得醋酸菌菌液；
所述醋酸菌液体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
所述醋酸菌菌液活菌含量为107-108个/ml。
3)将步骤2)醋酸菌菌液接入二茬酒醅中入缸发酵27天，二茬酒醅入缸温度25-26℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.2℃，出缸温度28℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
所述醋酸菌菌液接入酒醅的接种量为0.9-2.5ml/kg酒醅。
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅蒸馏得乙酸及乙酸乙酯含量较高的基酒。
本发明菌株HJB-012在白酒酿造中的应用。
有益效果
1.本发明菌株HJB-012为异型厌氧发酵，既产乙酸又产乳酸，具有良好的产酸产酯性能，微氧环境有利于菌体发酵产酸，所产乳酸与其它不挥发的高分子有机酸一样，是白酒的重要酸味剂，可增加酒体的口味，虽然乳酸香气微弱，但能使酒质浓厚，延长白酒的后味，是构成酒体“后味”的重要物质，适量的乳酸可增加酒体的甜味感和回甜感，减少或消除杂味及燥辣感，增加酒的醇和度，具有减轻水味、掩饰苦味、压香解暴等多种调节作用。可有效改善白酒品质、提高白酒风味。
2.本发明菌株HJB-012应用于白酒酿造中，为白酒酿造补充了重要功能菌，进行强化制酒，可为现代自动化制酒工艺的改进提供理论依据和技术支持，为推动传统产业的升级提供技术指导，该技术的推广对老白干香型及其它香型白酒的生产也具有非常重要的实践意义。
附图说明
图1是HJB-012菌株菌体形态
图2是HJB-012菌株菌落形态
图3氧对醋酸菌产酸的影响
图4培养时间对醋酸菌产酸的影响
图5接种量对醋酸菌产酸的影响
图6温度对醋酸菌产酸的影响
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明所述菌株具体为醋酸菌(Acetobacter sp.)HJB-012，是从河北衡水老白干酒业股份有限公司的大曲中分离得到的，该菌株已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCC N0.6982。
所述醋酸菌固体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
所述醋酸菌液体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
实施例2菌株HJB-012的筛选
1)取1g粉碎的大曲(由河北衡水老白干酒业股份有限公司提供)溶于9mL 0.9％的灭菌生理盐水的试管中，振荡30分钟；
2)取上述方法制得的大曲液，按10倍梯度稀释到10-6，从10-6试管中吸取0.2ml，注入装有醋酸菌固体培养基的培养皿内进行涂布，30℃培养2d后，观察菌落和菌体特征。挑取单个菌落，简单染色后，在显微镜下，观察细胞形状、排列方式；
3)从步骤2)培养皿内挑取细胞短杆状，单生或成链存在的菌落，在装有醋酸菌固体培养基培养皿内30℃划线培养2d后，形成暗白色菌落，直径1mm，表面湿润，圆形，低凸起，边缘整齐，革兰氏染色阴性；
4)挑取上述菌落在装有的醋酸菌固体培养基培养皿内30℃划线培养2d后，从中挑取单个菌落接入试管固体斜面，30℃下培养2d，将其放入冰箱保存备用。
5)16S rRNA基因序列测定
挑取菌体于50ul试剂盒TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(CodeNo.D304)中80℃、15min变性后离心取上清作为模板，使用试剂盒TaKaRa 16S rDNA BacterialIdentification PCR Kit(Code No.D310)，进行PCR扩增目的片段，取5ul进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段，以16S Forward、16S Internal和16S Reverse为引物进行DNA测序。测序结果在GeneBank中利用Blast程序进行比对。
采用特异性引物扩增后，获得的16SrDNA序列在GeneBank的比对结果显示，HJB-012与醋酸菌(Acetobacter sp.)(AM748710.1)的16S rRNA基因的相似性达到100％。结合菌体形态特征的鉴定结果，将菌株HJB-012确定为醋酸菌(Acetobacter sp.)。
实施例3：醋酸菌的产酸产酯特性试验
酸碱滴定法测定醋酸菌单因素产酸的影响
取发酵液10mL，加入20mL蒸馏水和2～3滴酚酞试剂，用标定过的0.1000mol/L NaOH溶液进行滴定，发酵液的酸度以消耗0.1000mol/L NaOH溶液的毫升数表示。
A、氧对醋酸菌产酸的影响
由图3可知，在微氧条件下，发酵液的酸度最高，消耗氢氧化钠35.3ml，在有氧条件下发酵液的酸度最低，消耗氢氧化钠20.9ml，因此该菌株的最佳培养条件是微氧条件。
B、培养时间对醋酸菌产酸的影响
由图4可知，在不同培养时间，发酵液的酸度存在不同程度的差异，在48h时，发酵液的酸度最低，消耗的氢氧化钠数量仅为24.273mL，随着时间的延长，发酵液酸度在逐渐增加，在72h时，发酵液的酸度最高，消耗氢氧化钠56.870mL，是48h时酸度的2.34倍，随着发酵时间的继续延长，酸度反而下降，在92h时，消耗氢氧化钠56.144mL，因此，该菌株的最佳发酵时间在72h。
C、接种量对醋酸菌产酸的影响
从图5可知，代谢产酸与接种量有一定的关系，在3％-5％的范围内，发酵液的酸度与接种量成正比关系，3％的接种量，发酵液酸度最低，消耗氢氧化钠23.62lmL，当接种量增加到5％时，发酵液的酸度最高，消耗氢氧化钠28.485mL，相当于3％接种量时的1.21倍。综合考虑，5％是该菌株最适宜的接种量。
D、温度对醋酸菌产酸的影响
由图6可以看出，随着温度的升高，菌株HJB-012发酵液的酸度也逐渐增大，在29℃时，发酵液的酸度最低，消耗氢氧化钠的量仅为34.604mL，温度增加到33℃时，发酵液的酸度含量最高，消耗氢氧化钠46.690mL，是29℃时的1.350倍。因此，该菌株的最适宜发酵温度是33℃。
在较低的温度下，细胞生长缓慢，延滞期长，生化反应过程需要的酶活力低，不利于代谢产物的积累。随着温度的升高，细胞生长速度加快，在33℃时生长最快，延滞期短，酶活力提高，代谢产物的积累量相对29℃时明显提高。
产酯分析
斜面转接到5ml，10ml，30℃培养18h，然后转接到40ml高粱汁中，最后转接到160ml高粱汁中(含6％乙醇)，培养92h然后蒸馏，气相测定产酯量，经测定发酵液中乙酸乙酯和含量为1.42mg/100ml。
经HJB-012菌株L9(34)正交实验结果及方差分析，并进行了理论最佳发酵产酸、产酯条件与生产试验相互确认，综合考虑氧气、温度、时间、接种量等因素对菌株的影响程度，最终确定菌株HJB-012的最佳发酵产酸条件为：温度35℃，接种量4％，培养时间96h和pH6.5，其产酸量达到34.436g/L，其中乙酸为33.553g/L，乳酸为0.883g/L，乙酸乙酯1.42mg/100ml。
实施例4利用菌株HJB-012改善老白干香型白酒品质的实验及效果评价
冬季气温偏低，气温达-13-15℃，老白干香型白酒以地缸发酵为主，而醋酸菌适宜生长温度为35℃，这限制了醋酸菌正常的生长代谢，使得酒醅发酵过程中产乙酸量减少，进而酯化得到的乙酸乙酯含量减少，酒醅本身所含的醋酸菌数量相对不足，基酒口味寡淡，采用菌株HJB-012经扩大培养，再次强化利用，加入到发酵酒醅中，利用产酸微生物醋酸菌提高乙酸乙酯的前体物质乙酸的含量，进而在相关酶的作用下生成乙酸乙酯，经过蒸馏得到基酒，使得基酒中乙酸及其乙酸乙酯含量均有所提高，进而提高了基酒质量，具体步骤如下：
一、白酒酿造
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，35℃培养24h，将活化好的菌种再活化一次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，35℃培养24h，然后将培养好的发酵液以5％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，32℃培养16h，最后再将培养好的发酵液以4％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中32℃培养16h，得醋酸菌菌液；
所述醋酸菌菌液活菌含量为107个/ml。
3)将步骤2)醋酸菌菌液按表1中的接种量接入分班组分别接入1700kg的二茬酒醅中入缸发酵27天；
二茬酒醅由于淀粉含量较低(已利用过一次)，含氧量高于大茬，所以二茬酒醅冬天入缸温度一般在20-21℃；第1天温度为18℃，第2天升至22℃，第3天到达顶火温度28℃，第4天温度为28℃，第5天降温至25℃，一般酵母最适生长温度20-30℃，而醋酸菌最适生长温度35℃，在30-40℃范围较适合。前期酵母温度需求还能达到，而醋酸菌最适合生长温度与缸温相差甚多，限制了醋酸菌的生长繁殖，其代谢缓慢，产酸量较高温时明显减少，因而后期酯化作用中产生的乙酸乙酯含量较低。
本实验二茬酒醅入缸温度25℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.5℃，出缸温度21℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
表1接种量及编号
| 组别 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 接种量ml | 0 | 1500 | 2000 | 2500 | 3000 | 4000 |
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅分别蒸馏得基酒。
二、基酒检测及品评
出缸基酒中乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量的测定结果见表2
表2基酒中各有效成分含量(单位：mg/100mL)
从表2检测结果分析：乙酸乙酯和乙酸随接种量增加表现为先升后降，尤以2-2乙酸乙酯增量最大。
经过8位具有十年以上评酒经验的评酒员对上述6个酒样进行品评，品评后，给予简单言语描述，并根据口感优劣进行排序，结果见表3
表3实验组基酒酒样品评结果
醋酸菌的加入不同程度上予以酒体舒适度，但并非越高越好，可见乳酸乙酯与乙酸乙酯及其他酸、酯、醛、醇的协调度直接决定着酒体的舒适度等口感指标，综合考虑，当接种量为1.18ml/kg(实验组2)时，最有益于酒体提升质量。
醋酸有愉快的酸味，对酒的主体香起衬托作用。该醋酸菌株为异型发酵，所产乳酸与其他不挥发的高分子有机酸一样，是白酒的重要酸味剂，可增加酒体的口味，虽然乳酸香气微弱，但能使酒质浓厚，延长白酒的后味，是构成酒体“后味”的重要物质，适量的乳酸可增加酒体的甜味感和回甜感；减少或消除杂味及燥辣感，增加酒的醇和度。具有减轻水味、掩饰苦味、压香解暴等多种调节作用。可见醋酸菌对于改善白酒品质具有明显的积极作用。
实施例5
一种利用菌株HJB-012酿造白酒的方法，包括如下步骤：
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，36℃培养36h，将活化好的菌种再活化一次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，36℃培养36h，然后将培养好的发酵液以8％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，34℃培养17h，最后再将培养好的发酵液以5％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中34℃培养17h，得醋酸菌菌液；
所述醋酸菌菌液活菌含量为108个/ml。
3)将步骤2)醋酸菌菌液按1ml/kg酒醅的接种量接入二茬酒醅中入缸发酵27天，二茬酒醅入缸温度26℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.5℃，出缸温度21℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅蒸馏得基酒，所述基酒经检测乙酸乙酯含量为168.98mg/100ml。
实施例6
一种利用菌株HJB-012酿造白酒的方法，包括如下步骤：
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，37℃培养48h，将活化好的菌种再活化一次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，37℃培养48h，然后将培养好的发酵液以10％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，35℃培养18h，最后再将培养好的发酵液以6％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中35℃培养18h，得醋酸菌菌液；
所述醋酸菌菌液活菌含量为108个/ml。
3)将步骤2)醋酸菌菌液按2ml/kg酒醅的接种量接入二茬酒醅中入缸发酵27天，二茬酒醅入缸温度25℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.5℃，出缸温度21℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅蒸馏得基酒，所述基酒经检测乙酸乙酯含量为158.28mg/100ml。
Claims (10)
1.一种可提高白酒风味的醋酸菌(Acetobacter sp.)HJB-012，该菌株已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6982。
2.一种利用如权利要求1所述的HJB-012菌株酿造白酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，35-37℃培养24-48h，活化两次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，35-37℃培养24-48h，然后将培养好的发酵液以5％-10％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，32-35℃培养16h-18h，最后再将培养好的发酵液以4％-6％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中32-35℃培养16-18h，得醋酸菌菌液；
3)将步骤2)醋酸菌菌液接入二茬酒醅中入缸发酵27天，二茬酒醅入缸温度25-26℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.5℃，出缸温度21℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅蒸馏得乙酸及乙酸乙酯含量较高的基酒。
3.如权利要求2所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌固体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
4.如权利要求2所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌液体培养基组成为：葡萄糖10g，酵母膏10g，碳酸钙10g，蒸馏水1000mL，pH值7.5，121℃灭菌20min。
5.如权利要求2所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌菌液活菌含量为107-108个/ml。
6.如权利要求2所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌菌液接入酒醅的接种量为0.9-2.5ml/kg酒醅。
7.如权利要求2或6所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌菌液接入酒醅的接种量为1.18ml/kg酒醅。
8.如权利要求2或6所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，所述醋酸菌菌液接入酒醅的接种量为2.0ml/kg酒醅。
9.如权利要求2-6任一所述的一种酿造白酒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌种活化
将保存完好的HJB-012斜面菌种接种于醋酸菌斜面固体培养基进行活化，35℃培养24h，将活化好的菌种再活化一次，得到醋酸菌固体斜面菌种；
2)液体菌种扩大培养
将步骤1)所得醋酸菌固体斜面菌种接种于装有5ml醋酸菌液体培养基的试管中，35℃培养24h，然后将培养好的发酵液以5％的接种量接入装有10ml液体培养基的试管中，32℃培养16h，最后再将培养好的发酵液以4％接种量接入装有150ml液体培养基的250ml三角瓶中32℃培养16h，得醋酸菌菌液；
所述醋酸菌菌液活菌含量为107个/ml；
3)将步骤2)醋酸菌菌液按1.18ml/kg酒醅的接种量接入二茬酒醅中入缸发酵27天，二茬酒醅入缸温度25℃，入缸升温情况：第1天温度为26℃，第2天升至30℃，第3天升至32℃，第4天到达顶火温度34℃，第5天降温至33℃，第6天降至32℃，以后每天下降0.5℃，出缸温度21℃，待酒醅发酵结束，得发酵成熟酒醅；
4)将步骤3)的发酵成熟酒醅蒸馏得基酒，所述基酒经检测乙酸乙酯含量为243.41mg/100ml。
10.如权利要求1所述的菌株HJB-012在白酒酿造中的应用。
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