CN101838615B

CN101838615B - 一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用

Info

Publication number: CN101838615B
Application number: CN2010101740560A
Authority: CN
Inventors: 韩北忠; 梁恒宇; 严斌; 陈晶瑜; 苏宁; 谢喆
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-05-11
Also published as: CN101838615A

Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5 CGMCC No.3732。NJZSC5在酒精发酵过程中利用苹果酸和柠檬酸的能力强，积累琥珀酸的能力较弱，在苹乳发酵后乳酸含量更低。用NJZSC5生产葡萄酒，可使整个酿造周期大幅缩减(5-8d)，提高葡萄酒的出品率和成品酒的品质。NJZSC5可解决高酸度葡萄产区和葡萄品种生产较低酸度优质葡萄酒的难题。NJZSC5生产出的葡萄酒优点在于：葡萄酒酸度较低，口感清爽、柔和，不艰涩，酸甜平衡，层次感分明，极具特色；挥发性香气成分平衡，葡萄本身特征香气更加明显。

Description

一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用

技术领域

本发明涉及一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。

背景技术

葡萄酒的酿造主要是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的作用下，采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中的各种潜在品质和优势在酿造过程中充分表现出来。葡萄酒中适量的有机酸可以赋予葡萄酒清新、爽利的酸感；酸量过高则会使人感到尖涩、刺口甚至生硬，严重影响葡萄酒的口味。因此酸的含量和种类是生产特色优质葡萄酒的重要指标之一。优质葡萄酒中一般应含有6.0-8.5g/l的酸类物质。白葡萄酒中酸含量在5-9g/l，pH值在3.1-3.4之间；而红葡萄酒的酸含量在5-7g/l，pH值在3.3-3.6之间。葡萄酒中不同有机酸性质及浓度取决于酿酒酵母酿造特性、酿造工艺、葡萄原料等多种因素。由于生长年份、自然环境、生态条件、酿酒葡萄的品种特性及栽培方式的影响，葡萄原料的酸度往往较高，所以在葡萄酒酿造过程中常常面临降酸的问题。

通常的降酸方法包括化学降酸、物理降酸、调配降酸和生物降酸法四种。化学降酸主要是去除酒石酸，以使用酒石酸钾、碳酸钙、碳酸氢钙等化学试剂与酒石酸形成沉淀再通过过滤的方法除去沉淀，从而达到降酸的目的；物理降酸主要是通过冷冻或阴离子交换处理来调整酸的含量。化学降酸和物理降酸法对酒质的负面影响较大。调配降酸是在有经验的调酒师指导下用高酸度的葡萄原酒与低酸度的葡萄原酒按照一定的比例进行调配以得到酸度达标的葡萄酒。目前常用的生物法降酸主要是针对生理历代比较活跃的苹果酸进行的，其原理是利用微生物(酒类酒球菌)分解苹果酸从而达到降酸目的。发明专利“一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法”(专利申请号：CN200510041935.5，公开号：CN1721524)以酿酒酵母CICC1450及酒酒球菌SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术构建的成一株可以进行苹果酸乳酸发酵的基因改良菌株。然而在一些葡萄产地(尤其是较寒冷地区)有些年份的某些葡萄品种酿制的葡萄酒在经历降苹果酸工序后酸度仍然较高，导致酿出的葡萄酒具有较强的后酸感，甚至是酸涩感。这样就会大大降低葡萄酒的品质和适口性。尤其在我国葡萄酒原料基地生产的葡萄，在大多数情况下不需要补酸，反而有一些原料需要进行降酸处理(比如在我国吉林通化、甘肃武威、河北沙城等产区)。

葡萄酒中的总酸度包括挥发性酸度和固定酸度，以固定酸度为主。固定酸主要由酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等不挥发性酸构成。酒石酸、苹果酸和柠檬酸是葡萄中的主要酸类物质。其中酒石酸是葡萄的特征酸，其含量与栽培环境和葡萄品种有关，不宜于被微生物所利用；但其在葡萄酒中的含量受其钾盐和钙盐的形成的沉淀量的影响很大。苹果酸和柠檬酸具有“生酸味”，虽然它们在葡萄中的含量也很高，但由于它们在苹乳发酵后会被酒类酒球菌的代谢作用转化为酸味较弱的乳酸，因此其在葡萄酒中含量低。除此之外葡萄在发酵过程中会由酵母三羧酸循环(TCA)途径产生一些一元酸、二元酸和三元酸。这些酸均是TCA循环的中间产物，其中主要包括琥珀酸、丙酮酸、α-酮戊二酸和异柠檬酸等。

琥珀酸是酿酒酵母在酒精发酵过程中产生的最主要不挥发酸，其性质在老熟过程中仍非常稳定，其在葡萄酒中的口味也最为复杂和特殊，是味感最为强烈的一种酸。刚入口时其酸感比酒石酸、苹果酸和柠檬酸淡，随后味感变浓，先咸后苦，并能促进唾液分泌。因此琥珀酸的含量会直接影响葡萄酒的口味和风格。

不同的酿酒酵母菌株代谢和积累苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等TCA循环中间产物的能力有着显著的差异。而这种差异会继而影响后续苹乳发酵的进程，也正是这种差异造成了不同酿酒酵母菌株所酿葡萄酒会给品酒者的味觉带来不同的酸感。

利用微生物对葡萄酒进行降酸处理已经在葡萄酒酿造业得到普及。虽然经过苹果酸-乳酸发酵后的葡萄酒酸度得以降低，但有些葡萄酒由于产地、气候、栽培方式和葡萄品种等因素的影响，导致经过苹乳发酵的酒中酸度仍然较高，因此大大影响成品酒的质量。然而选用不同的酿酒酵母菌株却可以得到不同酸度的葡萄酒，为高酸葡萄酿造出低酸葡萄酒提供了可能。

我国葡萄种植面积广，吉林、辽宁、河北、山东、甘肃、新疆和云南等地都是重要的葡萄产区。不同产区栽培的酿酒葡萄品质千差万别，导致高酸度葡萄原料难以生产出低酸度的优质葡萄酒。

发明内容

本发明的目的是提供一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，名称为NJZSC5，属于酵母属(Saccharomyces sp.)，分离自河北省沙城县原产地葡萄产区赤霞珠葡萄表面，已于2010年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3732。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5CGMCC No.3732，简称酿酒酵母NJZSC5或NJZSC5。

酿酒酵母NJZSC5可用于生产葡萄酒。所述葡萄酒可为干红葡萄酒、干白葡萄酒或佐餐葡萄酒。

本发明提供了一种生产葡萄酒的方法，是利用酿酒酵母NJZSC5对葡萄原料进行发酵，得到葡萄酒。酿酒酵母NJZSC5特别适于用酸度较高的葡萄原料生产葡萄酒。

利用NJZSC5生产出的葡萄酒优点在于：当葡萄原料酸度偏高时，葡萄酒中总糖含量为1-3g/L，酒精度为9-14％，甘油含量为3-8g/L，总酸含量为5-7g/L，硫化氢、乙醛、乙酸和尿素等对葡萄酒风味或品质不利的代谢产物产量较低，柠檬酸和琥珀酸代谢能力较强，苹果酸利用率更高，总酯含量更高而总高级醇含量适中；葡萄酒酸度较低，pH较高，口感更为清爽、柔和，无艰涩感，酸甜口味更加平衡，层次感分明，极具特色；葡萄酒的挥发性香气成分平衡，葡萄本身的特征香气更加明显。NJZSC5应用于生产葡萄酒，可以缩短酒精发酵时间和苹乳发酵时间，使整个酿造周期大幅缩减(5-8d)，有利于提高葡萄酒的出品率和提高成品酒的品质。NJZSC5可解决高酸度葡萄产区和葡萄品种生产较低酸度优质葡萄酒的难题。

附图说明

图1为NZJSC5在WL营养琼脂上的菌落形态。

图2为NJZSC5在McClary培养基上28℃培养1-4周后，在显微镜中的形态。

图3和图4为实施例4的酒精发酵的发酵液的代谢物组和主成分分析结果。

图5和图6为实施例4的干红葡萄酒的代谢物组和主成分分析结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取统计平均值。

实施例中的培养基如下：

模拟葡萄汁培养基由水和溶质组成，pH＝3.3；溶质的浓度如下：葡萄糖，200g/1000mL；柠檬酸，6g/1000mL；苹果酸6g/1000mL，尿嘧啶，20mg/1000mL；磷酸二氢钾，750mg/1000mL；硫酸钾，500mg/1000mL；七水硫酸镁，250mg/1000mL；氯化钠200mg/1000mL；二水氯化钙，155mg/1000mL；一水硫酸锰，4mg/1000mL；硫酸锌，4mg/1000mL；碘化钾，1mg/1000mL；五水硫酸铜，1mg/1000mL；硼酸，1mg/1000mL；二水钼酸钠，1mg/1000mL；六水氯化钴，0.4mg/1000mL；肌醇，20mg/1000mL；烟酸，2mg/1000mL；泛酸钙1.5mg/1000mL；盐酸硫胺素0.25mg/1000mL；盐酸吡哆辛0.25mg/1000mL；生物素，0.003mg/1000mL；脯氨酸，61.5mg/1000mL；谷氨酰胺，50.7mg/1000mL；精氨酸，37.5mg/1000mL；色氨酸，18mg/1000mL；丙氨酸，14.7mg/1000mL；谷氨酸，12mg/1000mL；丝氨酸，7.8mg/1000mL；苏氨酸，7.8mg/1000mL；亮氨酸，4.8mg/1000mL；天冬氨酸4.5mg/1000mL；缬氨酸，4.5mg/1000mL；苯丙氨酸，3.9mg/1000mL；异亮氨酸，3.3mg/1000mL；组氨酸，3.3mg/1000mL；甲硫氨酸，3.3mg/1000mL；酪氨酸，1.8mg/1000mL；甘氨酸，1.8mg/1000mL；赖氨酸，1.8mg/1000mL；半胱氨酸(cysteine)，1.2mg/1000mL；氯化铵，55.8mg/1000mL；麦角甾醇，15mg/1000mL；油酸钠，5mg/1000mL；吐温-80，0.5ml/1000mL。

YEPD培养基由水和溶质组成，自然pH值；溶质的浓度如下：葡萄糖，20g/1000mL；蛋白胨，20g/1000mL；酵母抽提物，10g/1000mL；固体培养基加入20g/1000mL琼脂(微波炉加热完全融化后灭菌)；121℃，灭菌15min。

WL营养琼脂培养基由水和溶质组成，pH＝6.5；溶质的浓度如下：酵母抽提物，4g/1000mL；胰蛋白胨，1g/1000mL；葡萄糖，50g/1000mL；KH₂PO₄，0.550g/1000mL；KCl，0.425g/1000mL；CaCl₂，0.125g/1000mL；MgSO₄，0.125g/1000mL；FeCl₃，0.0025g/1000mL；MnSO₄，0.0025g/1000mL；溴甲酚绿，0.022g/1000mL。

McClary培养基由水和溶质组成；溶质的浓度如下：葡萄糖，1g/1000mL；KC1，1.8g/1000mL；无水乙酸钠，8.2g/1000mL；酵母膏，2.5g/1000mL；琼脂，20g/1000mL。

实施例中各个性能的测定方法如下：

CO₂失重：称量法(M.S.Pérez-Coellol，A.I.Briones Pérez，J.F.Ubeda Iranzo and P.J.Martin Alvarez.Characteristics of wines fermented with different Saccharomycescerevisiae strains isolated from the LaMancha region.Food Microbio.1999，16(6)：563-573)。

乙醛含量：乙醛测定试剂盒(Acetaldehyde Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)。

甘油含量：甘油测定试剂盒(Glycerol Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)。

尿素含量：尿素测定试剂盒(UreaAssay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)。

总酯、总高级醇等香气物质含量：SPME-GC-MS法；用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent 5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测(参见文献：张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)。

挥发酸含量(以乙酸计)：滴定法，(GB/T 15038-2006)。

代谢物组和主成分分析：核磁共振法(参见文献：Son H.S.，Hwang G.S.，Kim K.M..et al.¹H NMR-Based Metabolomic Approach for Understanding the FermentationBehaviors ofWine Yeast Strains.Anal Chem.2009，81：1137-1145)。

pH值：pH计法(GB/T 15038-2006)；

总糖含量(以葡萄糖计)：直接滴定法(GB/T 15038-2006)。

酒精度：密度瓶法(GB/T 15038-2006)。

总酸含量(以酒石酸计)：电位滴定法(GB/T 15038-2006)。

有机酸(苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸)含量：液相色谱法(GB/T15038-2006)。

总SO₂含量：直接碘量法(GB/T 15038-2006)。

游离SO₂含量：直接碘量法(GB/T 15038-2006)。

感官评定：(GB/T 15038-2006)。

比重测定：比重计法。(参见文献：Rogerson F.，Symington C.A method for theestimation of alcohol in fortified wines using hydrometer Bauméand refractometer Brix.Am J Enol Viticult.2006，57(4)：486-490)。

实施例1、酿酒酵母NJZSC5的分离、纯化及其鉴定

酿酒酵母NJZSC5分离自河北省沙城县原产地葡萄产区赤霞珠葡萄表面。鉴定方法采用传统形态学鉴定、生理生化鉴定结合ATB ID 32C酵母自动鉴定系统(生物梅里埃公司，法国)，并辅以5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析；经鉴定为酿酒酵母的菌株以法国LAFFORT公司生产的商业化活性干酵母Zymafiora F15(以下均简写作F15)为对照菌株，进行试管发酵初筛、摇瓶发酵复筛、小型酿酒优选菌株筛选实验和优筛菌株中试规模酿酒实验，对菌株进行筛选。经过近五年的系统研究和反复筛选，得到具有独特降酸酿造特性的酿酒酵母菌株NJZSC5。

1、形态学鉴定

经过48h培养：NJZSC5在YEDP固体培养基上生长的菌落为乳白色、圆形、有光泽、边缘整齐、粘稠、易挑起，显微镜下观察为细胞成圆形或卵圆形、多边芽殖、无假菌丝；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色、菌落球形突起、表面光滑、不透明、奶油状，如图1所示；在McClary培养基上28℃培养1-2周后，在显微镜下观察有2-4个子囊孢子形成、孢子壁光滑，如图2所示。

2、生理生化鉴定

根据酵母属的分类检索表，选取对于酿酒酵母属种内区分比较重要的四项生理生化测试：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的发酵能力；纤维二糖和肌醇的同化能力；硝酸盐和L-赖氨酸的同化能力；抗放线菌酮能力。经过生理生化实验后发现，NJZSC5的碳源同化、氮源同化和放线菌酮生长实验的结果均与对照菌株CICC1450(标准商业对照菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，以下均写作CICC1450)测试结果相同，具体结果见表1。

表1 对照菌株和NJZSC5的生理生化实验结果

[注]：“+”表示菌体生长，试验结果阳性；“-”表示菌体不生长，试验结果阴性。

3、ID 32C酵母菌鉴定系统鉴定

利用ID 32C酵母菌鉴定系统(梅里埃公司，法国)和ATB全自动鉴定及药敏测试仪(梅里埃公司，法国)对纯化好的酵母菌进行鉴定。ID 32C是由32个标准化、微量化的同化试验与相应的数据库组成的适于酵母菌的鉴定系统。32个小孔中含有不同的脱水碳水化合物。化学纯的半固体培养基与菌悬液一起被接种到小孔中。培养24-48h后由ATB阅读器观察孔中酵母菌的生长情况，然后系统自动根据API LAB ID32软件得到鉴定结果。NJZSC5与标准对照菌株CICC 1450的鉴定相似率(id％)达到100％。

4、5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析鉴定

酵母的核糖体5.8S rDNA及两侧的转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)具有显著的种间差异性，可作为鉴别酵母菌种的分类依据。在对待测酵母菌株进行常规表型鉴定和自动化鉴定的同时，还采用5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析两种分子生物学方法对菌株进行鉴定，对几种分类鉴定方法的试验结果的统一性和可靠性作验证。

具体方法如下：

①酵母菌基因组DNA的提取：首先采用酵母菌基因组DNA提取试剂盒(明日百傲公司，北京)提取酵母菌的基因组DNA。

②酵母菌株5.8S-ITS rDNA的PCR扩增：PCR扩增所用引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR扩增条件为95℃×5min；94℃×1min，55.5℃×2min，72℃×2min，35个循环；72℃×10min；PCR扩增体系(50μL)的组成为：模板DNA 3-5μL，10×PCR反应缓冲液5.0μL，10μM引物0.5μL，10mM dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶1U，ddH₂O补充体系至50μl，混匀。随后对PCR扩增产物进行检测：取5μL PCR扩增产物点样于1.4％琼脂糖凝胶上，电泳缓冲液为1×TAE，100V电压下，电泳40min，溴化乙锭(EB)染色后，由凝胶成像系统对电泳图谱拍照并进行分析，采用100-bp DNA Marker判断PCR扩增产物的大小。

③酵母菌株5.8S-ITS rDNA的RFLP分析：5.8S-ITS rDNA的PCR扩增产物分别用CfoI、HaeIII和Hinf I(Fermentas，American)三种限制性内切酶37℃酶切16h；20μL的酶切体系内含10μL PCR产物，2μL 10×Buffer和10U内切酶；酶切后取10μL酶切产物于3％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳1h，EB染色后，凝胶照相，最后与标准酶切图谱对照，在种的水平上鉴定待测酵母菌株。

④酵母菌株5.8S-ITS rDNA的序列分析：5.8S-ITS rDNA PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒(明日百傲公司，北京)纯化后，由上海生物工程技术服务有限公司进行测序，测序引物同PCR引物ITS1或ITS4；根据测序结果，利用BLAST软件从GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，比较供试菌株与已知酵母菌株相应序列的相似程度。

使用引物ITS1和ITS4对分离的代表性菌株的5.8S-ITS rDNA区扩增，所得的产物大多为450-880bp之间。使用CfoI、HaeIII和HinfI进行酶切，所得酶切图谱共有20个类型，将酶切图谱与Guillamon和Esteve-Zarzoao等人建立的标准酶切图谱进行对照鉴定。对酵母菌株NJZSC5和CICC1450的5.8S-ITS rDNA-RFLP方法鉴定的酵母菌株的酶切数据如表2所示，5.8S-ITS rDNA序列分析结果如表3所示。

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；序列1；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；序列2。

表2 酵母菌株5.8S-ITS rDNAPCR扩增产物大小及限制性内切酶酶切图谱

表3 葡萄酒相关酵母菌株5.8S-ITS rDNA测序结果

RFLP酶切类型(菌株编号)	参考菌株基因库接受号	同源性(％)	鉴定结果
				CICC1450	AM900396	100	S.cerevisiae
NJZSC5	AM900396	100	S.cerevisiae

根据目前酵母菌分子系统学研究领域所流行的观点，即具有相同或相似ITS序列(序列同源性≥99％)的菌株属于同一物种，根据序列分析发现标准菌株CICC1450和测试菌株NJZSC5与基因库参考菌株5.8S-ITS rDNA的序列同源性为100％。

5、酿造特性

依据国际上常用的葡萄酒酿造用酿酒酵母菌株筛选指标(Nikolaou E.，Soufieros E.H.，Bouloumpasi E.，et al.Selection of indigenous Saccharomyces cerevisiae strainsaccording to their oenological characteristics and vinification results.Food Microbiol.2006，23：205-211)对该NJZSC5各种酿造特性进行系统研究，该菌株在模拟葡萄汁培养基中以1×10⁶CFU/mL的接种量接种，25℃模拟发酵静置培养20d，然后经过4L高酸葡萄汁发酵小试和400L发酵中试，所有指标测定采用标准分析方法，并对中试生产干红葡萄酒进行专家感官评定。指标包括：发酵活力、发酵速率、絮凝能力、产泡沫能力、挥发酸产量、降酸能力、主要酸类物质含量、甘油产量、乙醛产量、尿素产量、SO₂抗性、酒精抗性、温度抗性、挥发性香气物质(酯类和高级醇)产量等。

NJZSC5具有如下优点：发酵活力旺盛，发酵启动迅速，泡沫产量适中，发酵结束絮凝能力强，发酵残糖低而酒精度高，甘油产量高，利用柠檬酸和苹果酸能力较强而积累琥珀酸能力较弱，乙醛和尿素等对葡萄酒品质具有不良影响的物质产量低；对SO₂、酒精和高糖度所造成的高渗透压等逆境生存条件具有良好抗性；经NJZSC5酿造的葡萄酒具有良好的香气结构和组成，主要二次挥发香气物质(酯类、高级醇、羰基化合物、小分子有机酸等)产量较对照菌株F15高或近似，而种类较对照菌株F15多；经过专家评定一致认为用NJZSC5发酵高酸度葡萄汁酿造所得的干红葡萄酒从色泽和气味上均接近于对照菌株F15以相同条件生产的干红葡萄酒，而其口味较对照菌株F15更为清爽和柔和，入口后平衡感更佳，而F15所酿干红稍显艰涩。

以上鉴定结果表明，菌株NJZSC5为来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的一株新菌，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3732。

实施例2、NJZSC5的酿造特性研究

在模拟葡萄汁培养基中对酿酒酵母菌株进行酿造特性研究可以在与天然葡萄汁非常相似的营养组成条件下完全排除野生杂酵母对发酵特性的影响。比较NJZSC5和另一株菌株CGMCC No.3284(专利申请号：200910238147.3)和标准菌株CICC1450在模拟葡萄汁中的酿造特性。

1、活化

挑取菌株(NJZSC5、CGMCC No.3284或CICC 1450)接入含10mL液体YEPD培养基的试管中，28℃静置培养12h；然后吸取1mL转接于含100mL YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养12h。

2、制备模拟葡萄酒

将活化的菌株按照10⁶CFU/mL的接种量接种于模拟葡萄汁培养基中，25℃静置培养至残糖量＜4g/L，得到模拟葡萄酒。

3、检测模拟葡萄酒的特性

NJZSC5、CGMCC No.3284和CICC1450发酵得到的模拟葡萄酒的特性见表4。

表4 各菌株的发酵性能的比较

菌株	72hCO₂失重(g/100mL)	总糖含量(g/L)	酒精度(％，v/v)	总酸含量(g/L)	pH
						NZJSC5	6.31±0.01c	1.06±0.02c	10.49±0.02	8.28±0.02c	3.59±0.01b
CGMCC3284	6.01±0.02b	1.96±0.02b	10.58±0.02	9.19±0.06b	3.51±0.01a
						CICC1450	6.52±0.01a	1.19±0.03a	10.29±0.02	8.95±0.05a	3.53±0.01a
显著性	*	*	NS	**	*
						菌株	甘油含量(g/L)	乙醛含量(mg/L)	苹果酸含量(g/L)	柠檬酸含量(g/L)	琥珀酸含量(g/L)
NZJSC5	4.22±0.01	0.84±0.02c	1.69±0.07c	3.46±0.12c	1.38±0.00b
						CGMCC3284	4.33±0.02	1.16±0.01b	2.44±0.04b	5.88±0.08b	2.10±0.02a
CICC1450	4.16±0.02	1.37±0.02a	2.31±0.04a	5.40±0.05a	2.01±0.01a
						显著性	NS	***	**	**	***
菌株	发酵天数(d)	总酯含量(mg/L)	总高级醇含量(mg/L)	挥发酸含量(g/L)	尿素含量(mg/L)
						NZJSC5	26	55.64±1.09b	72.98±2.97b	0.17±0.08	3.32±0.20a
CGMCC3284	31	60.31±1.34a	71.47±3.12b	0.18±0.05	2.97±0.10b
						CICC1450	28	51.89±0.98b	83.58±0.79a	0.17±1.08	3.62±0.10a
显著性	-	***	***	NS	**

a、b、c：不同字母代表以上直方图内数据之间经邓氏多变域测验法(Duncan s multiple range test)在显著差异群p≤0.05时差异显著；*、**、***和NS：分别代表利用邓氏多变域测验法在p≤0.05、p≤0.01和p≤0.001时显著，NS代表不显著(p＞0.05)。

NJZSC5、CGMCC No.3284和CICC 1450在模拟发酵状态的发酵力接近，其72hCO₂产生量和酒精产量适中，而总糖含量略低。对葡萄酒品质和风味具有不利影响的产物，如乙醛含量、挥发酸含量和尿素含量，NJZSC5发酵得到的模拟葡萄酒中均较低。对葡萄酒风味和口感具有积极影响的物质如甘油含量，三株菌无明显差异。在产酯类物质能力上，NJZSC5强于CICC 1450，略低于CGMCC No.3284。在主要酿造特性方面，三株菌差异最为明显的是总酸含量和pH值；NJZSC5总酸含量明显低于CICC1450与CGMCC No.3284，pH值的结果则相反。三种模拟葡萄酒中苹果酸和柠檬酸含量的差异显著，琥珀酸的含量具有极显著差异。NJZSC5所酿模拟葡萄酒中琥珀酸、苹果酸和柠檬酸的含量明显低于CICC1450和CGMCC No.3284，而后两者之间差异不显著。由于在模拟发酵体系中没有添加琥珀酸，因此造成此差异的主要因素是酿酒酵母本身代谢差异造成的。

实施例3、NJZSC5和F15在赤霞珠葡萄汁中的酿造特性比较(小试)

商业化活性干酵母Zymaflora F15(简称F15)：购自法国LAFFORT公司。

实验原料：2007年甘肃武威产赤霞珠葡萄；理化指标：还原糖含量，208.7±2.1g/L；总酸含量，10.12±0.61g/L；pH＝3.22±0.01。甘肃武威地区气候冷凉干燥，年活动积温2800-3000℃，年降水量110mm，由于热量不足，冬季较长，葡萄糖份积累没有中温地带高，故该地区的葡萄含酸量往往较高。

1、葡萄汁的制备

将葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到的葡萄汁。

2、菌种活化

挑取菌株NJZSC5接入含10mL液体YEPD培养基的试管中，28℃静置培养12h；然后吸取1mL转接于含100mL YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养12h。将保存于7℃的F15进行复水活化。

3、制备葡萄酒

(1)酒精发酵

取活化的菌株(NJZSC5或F15)接种到装有4L步骤1制备的葡萄汁的5L玻璃容器中(接种量为10⁶CFU/mL)，添加亚硫酸至游离硫含量达到60mg/L，室温静态发酵，每天监测发酵液的温度和比重，当比重不再下降时视为酒精发酵结束。酒精发酵结束后取发酵液进行步骤4的各项指标测定。

(2)苹乳发酵

酒精发酵结束后于15℃的低温条件下浸提3-4d，然后接入商业化酒类酒球菌B16(购自法国LAFFORT公司)，接种量为10⁶CFU/mL，室温静态发酵，发酵过程中利用纸色谱层析法监测苹果酸转化为乳酸的情况，直至在纸色谱上检测不到苹果酸时视为苹乳发酵结束(纸色谱层析法，参见文献：常伟，刘延林.葡萄酒的有机酸层析方法研究.中外葡萄与葡萄酒.1999，3：9-12)。发酵液即为干红葡萄酒，进行步骤4的各项指标测定。

4、各项指标比较

(1)对酒精发酵结束的发酵液的各项指标进行比较

酒精发酵结束的发酵液各项指标的测定结果见表5。

表5 各菌株酒精发酵的发酵液的理化指标

菌株	72hCO₂失重(g/100mL)	总糖含量(g/L)	酒精度(％，v/v)	pH	总酸含量(g/L)
						NJZSC5	7.9±0.1	2.96±0.18	12.07±0.07	3.37±0.02	9.22±0.07
F15	7.1±0.1	3.35±0.04	12.00±0.06	3.26±0.02	10.78±0.06
						显著性	**	NS	NS	*	***
菌株	甘油含量(g/L)	挥发酸含量(g/L)	总SO₂含量(mg/L)	游离SO₂含量(mg/L)	酒精发酵时间(d)
						NJZSC5	3.63±0.24	0.17±0.01	56.4±1.2	32.4±1.0	9

F15	3.46±0.28	0.23±0.03	54.7±0.9	29.2±0.9	10
						显著性	NS	*	NS	NS	-
菌株	酒石酸含量(g/L)	苹果酸含量(g/L)	柠檬酸含量(g/L)	琥珀酸含量(g/L)	乳酸含量(g/L)
						NJZSC5	4.17±0.02	2.41±0.17	1.01±0.03	0.66±0.05	0.23±0.03
F15	4.15±0.02	3.37±0.06	1.38±0.05	1.20±0.04	0.11±0.02
						显著性	NS	**	*	***	***

*、**、***和NS：分别代表利用邓氏多变域测验法在p≤0.05、p≤0.01和p≤0.001时显著，NS代表不显著(p＞0.05)。

NJZSC5发酵液的72h CO₂失重高于F15发酵液，总糖含量低于F15发酵液，这表明NJZSC5的发酵能力高于F15。NJZSC5发酵液的甘油含量、总SO₂含量和游离SO₂含量略高于F15发酵液，总酸含量和挥发酸含量低于F15发酵液。NJZSC5发酵液和F15发酵液的酒石酸含量无显著差异，苹果酸和柠檬酸含量有显著差异，琥珀酸和乳酸的含量有极显著差异，表明在酒精发酵过程中由于菌株代谢和积累不同酸类物质的能力差异显著而导致酸含量差异显著。NJZSC5代谢苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的能力很强，这意味着在其旺盛生长细胞中负责TCA循环的酶类活性较高，因而导致这些酸类中间产物积累较难。

(2)对干红葡萄酒的各项指标进行比较

干红葡萄酒的各项指标测定结果见表6。综合感官评定由5位评委进行。

表6 干红葡萄酒的理化指标

菌株	苹乳发酵时间(d)	总糖含量(g/L)	酒精度(％，v/v)	甘油含量(g/L)	挥发酸含量(g/L)
						NJZSC5	15	1.46±0.08	14.00±0.07	6.76	0.43±0.03
F15	19	1.92±0.04	13.91±0.06	6.40	0.47±0.01
						显著性	-	**	NS	NS	NS
菌株	pH	总酸含量(g/L)	总高级醇含量(mg/L)	总酯含量(mg/L)	综合感官评定得分
						NJZSC5	3.68±0.02	7.49±0.17	177.63±5.23	101.13±2.73	87
F15	3.61±0.02	8.78±0.26	209.18±4.17	91.91±5.83	84
						显著性	*	***	***	***	**
菌株	酒石酸含量(g/L)	苹果酸含量(g/L)	柠檬酸含量(g/L)	琥珀酸含量(g/L)	乳酸含量(g/L)
						NJZSC5	3.91±0.10	0.18±0.09	0.12±0.02	0.68±0.03	1.76±0.05
F15	3.95±0.14	0.24±0.05	0.10±0.04	1.19±0.04	2.10±0.04
						显著性	NS	*	NS	***	***

NJZSC5苹乳发酵的时间远少于F15，这证明NJZSC5可以缩短发酵周期。苹乳发酵后，NJZSC5制备的干红葡萄酒的总糖含量、总酸含量和总高级醇含量低于F15制备的干红葡萄酒，其甘油含量、总酯含量高于F15制备的干红葡萄酒，酒精度、挥发酸含量无显著差异，这说明NJZSC5主要酿造特性优于或接近于F15。与F15相比，NJZSC5制备的干红葡萄酒的酒石酸和柠檬酸含量无差异，而琥珀酸、乳酸含量差异极显著，苹果酸含量差异显著。综合感官评定中，NZJSC5制备的干红葡萄酒的得分高于F15，主要原因在于NJZSC5制备的干红葡萄酒的酸感更为柔和和爽利，而F15制备的干红葡萄酒稍显尖酸，NJZSC5与F15制备的干红葡萄酒酸感差异的主要因素是琥珀酸和乳酸。

实施例4、NZJSC5、CGMCC No.3284、CICC1450和F15在赤霞珠葡萄汁中的酿造特性比较(中试)

实验场地：中粮华夏长城葡萄酒有限公司。

实验原料：2009年沙城产赤霞珠葡萄；理化指标：还原糖含量，240.06±2.00g/L；总酸含量，7.67±0.62g/L；pH＝3.39±0.01。

1、葡萄汁的制备和理化指标测定

将葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁，得到葡萄汁。将葡萄汁分装至500L不锈钢罐中(每罐400L)，分3次逐量添加亚硫酸(至游离硫含量达到60mg/L)，添加20mg/L果胶酶，打循环混匀后得到原料液。

2、菌种的活化和扩大培养

将保存于-80℃的菌株(NJZSC5、CGMCC No.3284或CICC1450)接入含10mL液体YEPD培养基的试管中，28℃静置培养12h；然后吸取1mL转接于含100mL YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养12h。将保存于7℃的F15进行复水活化。

将活化的菌株(NJZSC5、CGMCC No.3284、CICC1450或F15)以3％(体积百分含量)接种量加入到30L葡萄汁中，进行扩大培养。

3、制备葡萄酒

(1)酒精发酵

将菌株(NZJSC5、CGMCC No.3284、CICC1450或F15)接种到步骤1的发酵罐中(每500L罐含400L原料液)；所有菌种的接种量均为10⁶CFU/mL。用泵打循环3min使原料液与酵母菌株充分混合均匀，室温静态发酵；每日分早、中、晚三次打循环，并在循环后取样监控发酵液的温度和比重，当比重不再下降时视为酒精发酵结束。酒精发酵结束后取发酵液进行步骤4的各项指标测定。

(2)苹乳发酵

酒精发酵结束后于15℃的低温条件下浸提3-4d；然后接入商业化酒类酒球菌B16(购自法国LAFFORT公司)，接种量为10⁶CFU/mL，进行苹乳发酵室温静态发酵，每日取样利用纸色谱层析法监测苹果酸转化为乳酸的情况(方法同实施例2的步骤3)，直至在纸色谱上检测不到苹果酸时视为苹乳发酵结束。发酵液即为干红葡萄酒，进行步骤4的各项指标测定。

4、各项指标比较

(1)对酒精发酵结束的发酵液的各项指标进行比较

酒精发酵结束的发酵液各项指标的测定结果见表7。

表7 各菌株酒精发酵的发酵液的理化指标

菌株	NJZSC5	CICC1450	CGMCC No.3284	F15	显著性
						酒精度(％，v/v)	14.16±0.12	14.18±0.04	14.08±0.17	14.17±0.09	NS
总糖含量(g/L)	3.03±0.08a	3.01±0.06a	4.02±0.16b	3.28±0.09c	*
						甘油含量(g/L)	3.87±0.02a	4.01±0.01c	3.85±0.03a	3.40±0.01b	**
pH	3.57±0.01d	3.51±0.01c	3.39±0.01b	3.46±0.01a	**
						总酸含量(g/L)	6.64±0.04d	7.47±0.11c	9.01±0.03b	7.39±0.04a	***
总SO₂含量(mg/L)	54.1±1.3c	49.8±1.1a	47.1±1.8a	50.7±1.4b	*
						游离SO₂含量(mg/L)	10.8±0.4d	9.5±0.4c	9.3±0.2b	12.0±0.7a	**
挥发酸含量(g/L)	0.23±0.01	0.19±0.03	0.24±0.02	0.19±0.01	NS
						总酯含量(mg/L)	59.2±5.8c	65.0±6.9a	74.8±4.7b	63.4±9.8a	***
总高级醇含量(mg/L)	181.9±4.1d	211.2±14.0c	165.5±7.1b	259.2±14.7a	***
						酒精发酵天数	6	6	7	7	-
酒石酸含量(g/L)	2.64±0.41	2.44±0.21	2.54±0.44	2.54±0.18	NS
						苹果酸含量(g/L)	0.88±0.08c	1.36±0.22a	2.14±0.10b	1.52±0.03a	***
柠檬酸含量(g/L)	1.00±0.12c	1.42±0.10b	1.46±0.05b	1.14±0.06a	*
						琥珀酸含量(g/L)	1.12±0.04d	1.53±0.07c	1.64±0.05b	1.38±0.06a	***
乳酸含量(g/L)	0.18±0.02c	0.15±0.01c	0.02±0.00b	0.23±0.01a	**

a、b、c、d：不同字母代表以上直方图内数据之间经邓氏多变域测验法(Duncan`s multiple range test)在显著差异群P≤0.05时差异显著；*、**、***和NS：分别代表利用邓氏多变域测验法在p≤0.05、p≤0.01和p≤0.001时显著，NS代表不显著(p＞0.05)。

各菌株的发酵液中：酒精度和挥发酸含量无差异；总糖含量、甘油含量、pH、总SO₂含量和游离SO₂含量具有显著差异；总酸含量、总酯含量和总高级醇含量有极显著差异。NJZSC5总酸含量最低(6.64±0.04g/L)，大大低于最高含量的CGMCC No.3284(9.01±0.03g/L)和原葡萄中的总酸含量(7.67±0.62g/L)。这证明NJZSC5是一株可以显著降低葡萄汁酸度的酿酒酵母菌株。各菌株的发酵液中：酒石酸含量无显著差异；柠檬酸和乳酸含量具有显著差异；苹果酸和琥珀酸含量具有极显著差异。NJZSC5在TCA循环中的主要有机酸中间产物(苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等)产物含量均较其它菌株低，这意味着该菌株可能具有更为高效的TCA循环路径，其主要代谢酶类的活性可能更高，因此导致酸类物质积累难于其它菌株。代谢物组和主成分分析结果见图3和图4。在PC1方向主要区分物质为琥珀酸(ppm＝2.62)、苹果酸(ppm＝2.66、2.83和4.50)和柠檬酸(ppm＝2.74、2.86)。

(2)对干红葡萄酒的各项指标进行比较

干红葡萄酒的各项指标测定结果见表8。

表8 干红葡萄酒的理化指标

	NJZSC5	CICC1450	CGMCC No.3284	F15	P
						总糖含量(g/L)	1.3±0.1c	1.4±0.0c	2.0±0.1b	1.7±0.0a	*
pH	3.90±0.01c	3.85±0.01b	3.78±0.01a	3.84±0.01b	***
						总酸含量(g/L)	5.31±0.10d	5.77±0.04c	7.43±0.06b	5.85±0.04a	***
挥发酸含量(g/L)	0.46±0.01	0.48±0.01	0.40±0.02	0.35±0.01	NS
						总酯含量(mg/L)	27.6±4.1d	29.8±6.8c	43.7±5.3b	39.1±8.8a	***
总高级醇含量(mg/L)	211.2±14.1c	253.6±14.6a	193.7±8.7b	251.7±11.9a	**
						苹乳发酵天数	20	22	27	25	-
酒石酸含量(g/L)	2.10±0.21	2.36±0.30	2.14±0.33	2.24±0.23	NS
						苹果酸含量(g/L)	0.02±0.00	0.01±0.00	0.02±0.01	0.01±0.00	NS
柠檬酸含量(g/L)	0.12±0.00	0.17±0.02	0.19±0.01	0.15±0.04	NS
						琥珀酸含量(g/L)	1.09±0.06d	1.41±0.02c	1.69±0.04b	1.32±0.04a	***
乳酸含量(g/L)	1.79±0.10c	2.35±0.09a	3.34±0.06b	2.24±0.21a	***

挥发酸含量无显著差异；总糖含量、总酯含量和总高级醇含量有显著差异；pH、总酸含量具有极显著差异。这表明用不同酿酒酵母菌株所酿的葡萄酒在经过苹乳发酵后仍然具有非常不同的酸度。根据HPLC测定结果，酒石酸含量仍无显著差异，但含量均略有下降；苹果酸和柠檬酸由于乳酸菌的代谢作用含量大大降低，虽略有不同，但均无显著差异；在苹乳发酵后各菌株所酿葡萄酒中琥珀酸和乳酸的含量差异仍及其显著，但琥珀酸含量与酒精发酵结束后变化不大，乳酸有显著升高，最终含量差异极大。NJZSC5制备的干红葡萄酒乳酸含量仅为1.79±0.10g/L，而CGMCC No.3284制备的干红葡萄酒却高达3.34±0.06g/L。谢物组和主成分分析结果见图5和图6。在苹乳发酵后各菌株所酿葡萄酒中的主要区分物质在PC1方向上为乳酸(ppm＝1.38)，而在PC2方向上为琥珀酸(ppm＝2.62)，而苹果酸和柠檬酸几乎检测不到。这很可能是由于NJZSC5在之前的酒精发酵过程中由于旺盛的碳源代谢而导致苹乳发酵中留给乳酸菌的碳源物质较少造成的。

(3)干红葡萄酒的感官评定

专家评审组：来自企业的高级工程师(一位)，助理工程师(一位)，国家级葡萄酒品酒师(一位)，来自国内高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授(四位，教授两位)，外籍酿酒酵母研究专家一人(教授，荷兰瓦格宁根大学)，葡萄酒专业博士研究生(二位)。专家评审组兼顾企业、教学、专业品评和科研人员，具有较高的权威性和合理性。评审专家组给出的评分结果见表9所示。

表9 发酵中试葡萄酒感官评定结果(专家盲评)

菌株	NJZSC5	CICC 1450	CGMCC No.3284	F15
					综合得分	90	83	90	87

绝大多数专家(9位)对酵母菌株NJZSC5和CGMCC No.3284发酵酒样的评价比较高，认为比F15和CICC1450发酵酒样更具特色。绝大多数专家认为经过NJZSC5菌株降酸酿造而成的葡萄酒酸感更加细腻、清爽和柔和，酸甜口味更为平衡，果香更为突出；入口柔顺，无艰涩和粗糙感。因此经大量试验和感官评定认为NJZSC5是一株优良葡萄酒降酸酿酒酵母菌株。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用

<130>CCGNARY102308

<160>2

<220>

<223>

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5 CGMCC No.3732。

2.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5 CGMCC No.3732在生产葡萄酒中的应用。

3.一种生产葡萄酒的方法，是利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5CGMCC No.3732发酵葡萄原料，得到葡萄酒。