CN105219667A - 用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法。所述菌株为蜡样芽孢杆菌S1株和圆滑短波单胞菌Z1株，这些菌株是基于木糖降解筛选获得，具有较高的产氢能力。所述制氢方法以木糖为底物，采用蜡样芽孢杆菌S1株和/或圆滑短波单胞菌Z1株进行发酵培养制氢，工艺简单，产氢效率高，可以用于工业化生产；尤其是采用菌株混合物进行发酵制氢时菌间具有很好的协同作用，产氢效率更高；而菌种固定化发酵可以一定程度的增加菌体的活性及稳定性，实现菌种的多批次连续使用，极大的降低了生产成本。

Description

用于木糖发酵制氢的菌株及制氢方法

技术领域

本发明属于木糖发酵制氢技术领域，涉及用于木糖发酵制氢的菌株及其制氢方法。

背景技术

H₂作为一种环境友好的可再生的清洁新能源已经引起人们的广泛关注和深入研究。氢气的制备方法中，生物制氢技术以可再生的生物质原料来制取清洁能源氢气，是最有前景的制氢技术。相对于光解水制氢和光合细菌制氢，暗发酵制氢不需要提供光源，反应器简单，底物利用范围广泛，可以利用能源作物或者是农业废弃物作为发酵底物。

暗发酵制氢是利用产氢微生物转化生物质的生物制氢技术，目前已知的暗发酵产氢细菌主要有：肠杆菌(Enterobactersp.)、芽孢杆菌(Bacillussp.)和梭菌(Clostridiumsp.)。但是大多数的研究都集中在梭菌和肠杆菌。目前发酵产氢的底物来源主要有葡萄糖和淀粉等粮食作物，为了避免发生与人争粮的现象，同时践行变废为宝的理念，工业废水、农业废弃物或市政餐厨垃圾等高有机质含量的废弃物成为了发酵产氢的底物，这些底物在单一菌种或者混合微生物菌群的作用下被降解。但是地球上含量最丰富的纤维素类物质由于其中含有的木质素的难生物降解性而成为纤维素类物质开发使用的瓶颈。

木质纤维素中含有35％-45％的纤维素、25％-40％的半纤维素(己糖和木糖的杂聚物)和20％-35％的木质素。木质纤维素经水解后的产物主要有葡萄糖和木糖，前者是微生物菌种广泛应用的底物，但是能够利用木糖的微生物种类少之又少。

基于上述分析，本发明的发明人认为目前存在的问题是需要筛选出能够使木糖降解产氢的菌株，尤其是能够使木糖降解并大量产氢的菌株以及利用所筛选的菌株进行木糖发酵制氢的方法，以使得纤维素类物质能够完全被利用的同时得到大量的氢。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了用于木糖发酵制氢的菌株，所述菌株为蜡样芽孢杆菌S1株和圆滑短波单胞菌Z1株，这些菌株是基于木糖降解筛选获得，具有较高的产氢能力。

本发明还提供了一种木糖发酵制氢方法，该方法以木糖为底物，采用蜡样芽孢杆菌S1株和/或圆滑短波单胞菌Z1株进行发酵培养制氢，工艺简单，产氢效率高，尤其是采用菌株混合物进行发酵制氢时菌间具有很好的协同作用，产氢效率更高，可以用于工业化生产。

为此，本发明第一方面提供了一种用于木糖发酵制氢的菌株，其中，所述菌株为蜡样芽孢杆菌S1株(Bacilluscereus,StrainS1)，其保藏编号为：CGMCCNO.9035，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2014年4月11日。

本发明第二方面提供了一种用于木糖发酵制氢的菌株，其中，所述菌株为圆滑短波单胞菌Z1株(Brevundimonasnaejangsanensis,StrainZ1)，其保藏编号为：CGMCCNO.9036，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2014年4月11日。

本发明第三个方面提供了一种木糖发酵制氢方法，包括将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养的步骤，其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。发酵菌种包括菌种M和/或菌种N。

制备菌种M相应的菌株M为与本发明第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株；优选所述发酵菌株M为与本发明第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选所述发酵菌株M为如本发明第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株。所述蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA序列如序列表中的SEQNO.1所示。

制备菌种N相应的菌株N为与本发明第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株；优选所述发酵菌株N为与本发明第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选所述发酵菌株N为如本发明第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株。所述圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA序列如序列表中的SEQNO.2所示。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16SRibosomalRNA(16SrRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16SrRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的发酵菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株，16srRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16SrRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。

因此，本发明中，菌株M为与本发明第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株。优选菌株M为与第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株。进一步优选的是，菌株M为如本发明第一方面所述的蜡样芽孢杆菌S1株。即在不改变蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的蜡样芽孢杆菌S1株，获得与本发明蜡样芽孢杆菌S1株16SrRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似的木糖发酵产氢功能的菌株种子液的混合物。

类似地，本发明中，菌株N为与本发明第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株。优选菌株N为与第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株。进一步优选的是，菌株N为如本发明第二方面所述的圆滑短波单胞菌Z1株。即在不改变圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的圆滑短波单胞菌Z1株，获得与本发明圆滑短波单胞菌Z1株16SrRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似的木糖发酵产氢功能的菌株种子液的混合物。

在本发明的一个实施例中，所述发酵培养步骤中，还包括收集发酵过程中所产生的气体的操作。

根据本发明，所述发酵培养为兼氧或厌氧发酵培养。优选所述发酵培养为厌氧发酵培养。木糖发酵产氢必须是兼氧或厌氧发酵，如果采用有氧发酵就无法很好的实现产氢。

根据本发明方法，所述发酵培养为菌种游离发酵培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基。所述种子液的接种的量以体积计为2％-30％。优选所述种子液的接种的量以体积计为10％-20％。

所述种子培养是将菌株接种至种子培养基，培养后获得含有菌种的种子液。在含有菌种M的种子液中，菌种M的含量为0.001-0.1g/mL。在含有菌种N的种子液中，菌种N的含量为0.001-0.1g/mL。

在本发明的一些实施例中，当发酵菌种为菌种M和菌种N时，在所接种的种子液中，含有菌种M的种子液与含有菌种N的种子液的体积比为10∶0.01-0.01∶10。优选含有菌种M的种子液与含有菌种N的种子液的体积比为0.1∶1-10∶1。

根据本发明方法，所述发酵培养为菌种固定化发酵培养，发酵菌种以负载于载体的形式接种到发酵培养基。

根据本发明方法，所述载体包括吸附载体和包埋载体，所述吸附载体选自大孔树脂、硅藻土、多孔玻璃、活性炭、木屑、陶瓷、沸石、丝瓜络、秸秆、玉米芯和人工纤维材料中至少一种；所述包埋载体选自海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚乙烯醇凝胶中至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述菌种在载体上的负载量为0.010-0.05g/g。

在本发明的一些实施例中，负载有菌种的载体的接种量为2-10g/L。

在本发明的一些实施例中，菌种负载于载体的操作，包括将菌株接种到分散有载体的种子培养基中，在10-60℃下，搅拌转速在10-300rpm之间，培养24-108h，制得载有菌种的载体，其中所述菌株包括酵菌株M和/或菌株N。

在本发明的一些实施例中，菌种负载于载体的操作，包括将载体分散于含有菌种的种子液中，在10-60℃下，搅拌转速在10-300rpm之间，放置24-108h，制得载有菌种的载体。所述含有菌种的种子液是将菌株接种至种子培养基进行种子培养后获得，其中所述菌株包括酵菌株M和/或菌株N。

目前已经得到了一些降解木糖的真菌和细菌，用来生产乙醇、丁酸和木糖醇等产物。也有一些研究者筛选出了降解木糖产氢气的菌株，木糖发酵产氢的代谢途径有两种类型，乙酸型发酵型式(1)和丁酸型发酵型式(2)，木糖产氢的副产物如果是乙酸，则最大理论得率是3.33molH₂/molxylose，如果是丁酸，则最大理论得率为1.67molH₂/molxylose，但是现有利用菌株进行木糖发酵的实际产氢水平均只能达到0.3-1.3molH₂/molxylose。

3C₅H₁₀O₅+5H₂O→5CH₃COOH+5CO₂+10H₂··········································式(1)

6C₅H₁₀O₅→5C₃H₇COOH+10CO₂+10H₂·················································式(2)

本发明的发明人以活性污泥为原料，基于木糖进行了木糖降解产氢菌的筛选。首先利用选择性培养基筛选出多株产酸细菌，然后在厌氧的环境下，利用木糖选择性培养基筛选出多株能够在厌氧环境中代谢木糖的产酸菌，接着进一步筛选出多株能够利用木糖发酵产氢的菌株，最后通过各条件的优化筛选出几株产氢能力较高的菌。最终经过两年半的时间，通过几十轮的筛选，得到两株能够在厌氧环境中代谢木糖高效产酸产氢的细菌A和B，并对菌种进行了鉴定和生理生化分析。在对两株菌的16SrDNA进行测序后经过同源比对以及进化树分析，得到了两株菌分别为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和圆滑短波单胞菌属(Brevundimonasnaejangsanensis)。并且得出两株菌均为杆状菌，前者为革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。经本发明的发明人研究，本发明中的两个菌种均属于丁酸型发酵型，其发酵途径如式(2)所示。将筛选到的两株细菌Bacilluscereus和Brevundimonasnaejangsanensis分开培养在液体培养基中，待菌种生长至对数生长期时，300μL50％的甘油中加入700μL的菌悬液，混合于1.5mL的离心管中。得到发酵用两株菌甘油管，之后于-80℃冰箱进行单一菌种超低温保藏。

本发明所述用语“人工纤维”是指以天然的聚合物为原料，经化学方法制成的在化学组成上与原聚合物基本上相同的化纤丝或由该化纤丝制成的绳子。

本发明的发明人利用自主筛选的木糖降解Bacilluscereus和Brevundimonasnaejangsanensis进行了单一菌株和混合菌株发酵木糖产氢，对比了纯菌和复合微生物菌剂发酵木糖的产氢效果，具体步骤如下：

1.种子液的制备

配置种子培养基，Bacilluscereus和Brevundimonasnaejangsanensis两株菌的甘油管均按照2％--30％的接种量分别接种至灭菌后的种子培养基中，微生物培养箱中10-60℃培养24-108h，得到两株菌的种子液。

2.发酵培养

配置发酵用的木糖培养基，根据设定的两株Bacilluscereus和Brevundimonasnaejangsanensis混合配比10∶0.01-0.01∶10，将上述得到的种子液按照2％-30％的接种量，在超净台中或以火焰封口接种法分别接种到灭菌后的发酵培养基中，最后得到1L体积的发酵液(发酵培养基+含有菌株的种子液最终体积为1L)。调节初始pH值在4.0-9.5之间，向发酵罐中持续通入氮气或氩气以排除发酵液中及发酵罐中发酵液液面上方空气，制造厌氧的环境，之后在10-60℃恒温磁力搅拌水浴锅中发酵，搅拌转速调节在10-300rpm。用抽真空的集气袋收集发酵过程中产生的气体。

3.发酵产物的测定

收集发酵过程产生的气体，用排水法或流量计测定所收集气体的体积，之后气相色谱分析气体中氢气的含量，从而得到总累积产氢量。定时测定发酵液的pH变化以及定时取样，测定发酵液中底物消耗情况以及液相末端产物的变化情况。

本发明研究不同菌种配比发酵产氢的效果，发现混合菌种和单一菌种均有氢气生成，混合培养的产氢速度一直都高于单独培养的产氢速度，并且呈一次函数直线上升。对比最终的累计产氢量，混合培养高于S1单独培养高于Z1单独培养。计算纯培养和混合培养的氢气得率，S1、Z1培养的氢气得率分别为1.20molH₂/molxylose和1.01molH₂/molxylose，混合培养的氢气氢气得率高于纯培养的氢气得率，尤其出人意料的是两株菌种混合培养的氢气得率在1.33-1.54molH₂/molxylose之间，明显高于两个菌种纯培养的氢气得率，这说明S1和Z1两个菌种存在着某种积极的相互作用，这种相互作用可能是类似食物链的依存作用。通过分析末端产物发现，本技术方案菌种的产氢代谢途径属于丁酸型发酵，混合培养的氢气得率与理论得率相差20％。本技术方案提出的混合菌种协同发酵的工艺，是将两株发酵木糖产氢菌的代谢融合在同一个反应器中，发现两株菌之间存在着某种依存作用，使得产氢效果得到了提高，通过将两株菌种固定化，最高产氢得率可达到1.54molH₂/molxylose，并且固定有菌体的载体可实现多批次连续使用。工艺简单，成本低廉，可以用于工业化生产。

由此可见，本发明的菌株是基于木糖降解筛选获得的具有较高的产氢能力的蜡样芽孢杆菌S1株和圆滑短波单胞菌Z1株。根据本发明方法以木糖为底物，采用蜡样芽孢杆菌S1株和/或圆滑短波单胞菌Z1株进行发酵培养制氢，工艺简单，产氢效率高，可以用于工业化生产；尤其是采用菌株混合物进行发酵制氢时菌间具有很好的协同作用，产氢效率更高；而菌种固定化发酵可以一定程度的增加菌体的活性及稳定性，实现菌种的多批次连续使用，极大的降低了生产成本。

菌种保藏

蜡样芽孢杆菌S1株(BacilluscereusstrainS1)，由北京化工大学分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏，保藏日期：2014年04月11日，保藏编号：CGMCCNO.9035。

圆滑短波单胞菌Z1株(BrevundimonasnaejangsanensisstrainZ1)，由北京化工大学分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏，保藏日期：2014年04月11日，保藏编号：CGMCCNO.9036。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：

步骤1：种子液的制备

种子培养基的配方为：牛肉浸粉3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，去离子水余量。

配置种子培养基，并将所配置的种子培养基灭菌后将菌种保藏甘油管中的菌液以10％的接种量接种至种子培养基中，37℃恒温培养箱中培养72h。

步骤2：发酵培养基制备及接种

用1.25L发酵瓶进行1L体积的发酵实验，发酵培养基的初始底物浓度均为10g/L。在配置好培养基之后灭菌，将步骤1中制备的两株菌的种子液按照设定的菌种配比以10％的接种量接种至发酵培养基中。

发酵培养基配方：木糖10g/L，蛋白胨2g/L，氯化钠5g/L，去离子水余量。

步骤3：发酵产氢

将瓶口的胶塞旋紧并向瓶中持续充氮气，目的是排除发酵瓶液面上部的空气以制造厌氧环境。通完氮气之后接入抽真空的集气袋。定时取样并测定发酵液的pH，收集发酵产生的气体，排水法测定气体体积，之后气相色谱测定产物气体中氢气的含量。发酵液pH测定用pH计测定，并且测定发酵液中总糖和液相末端产物的变化。

累积产氢体积测定使用下式计算：

$V_{H_2,i}=V_{H_2,i-1}+V_W{C}_{H_2,i}+V_{\mathrm{Ri}}{C}_{H_2,i}-V_{R,i-1}{C}_{H_2,i-1}$ 式(3)

其中，和指的是i时和之前的累积产氢体积(ml)；

V_W指代排水法测量的总产气体积(ml)；

指代i时所收集气体中的H₂含量(％)；

V_R,i和V_R,i-1指的是i时和前次反应器上部气体体积(ml)；

和分别是指i时和前次所收集气体中的H₂含量(％)；

所收集气体中的H₂含量等于反应器上部气体中的H₂含量。

气相色谱条件是使用氩气作为载气，进样口的温度为160℃，柱温160℃，TCD检测器温度180℃。使用恒流泵进样，流速为50rpm。

底物木糖浓度是用DNS法测定。

液相末端产物的测定是用气相色谱法进行，条件为二阶升温，进样口温度250℃，初始柱温120℃。通过峰面积-浓度的标准曲线方程，由图谱中的峰面积便可计算出样品中各个小分子脂肪酸的浓度。

实施例2到实施例10操作过程同实施例1，所有实施例的操作方法及其操作参数与结果见表1。

表1

本发明的发酵产氢水平与其他文献相比较的结果如表2。

表2

实施例11：

菌种负载于人工纤维材料载体

将裁剪好的4.5g纤维材料放入到250mL种子培养基中，在121℃下灭菌20min，冷却后接入菌种S1或Z1。在37℃的生化培养箱中培养5天。分别将吸附有S1和Z1的纤维材料接入到1L发酵液中混合发酵。

菌种负载于活性炭载体

将称好的4.5g活性炭放入到100mL种子培养基中，在121℃下灭菌20min，冷却后接入菌种S1或Z1。在37℃的生化培养箱中培养5天。分别将4.5g吸附有S1和4.5g吸附有Z1的活性炭混合加入到1L发酵液中混合发酵。

菌种负载于秸秆载体

将去皮的秸秆切成小块，称取9g秸秆加入到灭菌后的发酵培养基中，将提前培养好的S1和Z1的种子液加入到1L发酵液中混合发酵，在发酵过程中使S1和Z1菌吸附到玉米秸秆上。

菌种负载于硅藻土载体

将称好的4.5g硅藻土放入到100mL种子培养基中，在121℃下灭菌20min，冷却后接入菌种S1或Z1。在37℃的生化培养箱中培养5天。分别将4.5g吸附有S1和4.5g吸附有Z1的硅藻土混合加入到1L发酵液中混合发酵。

菌种负载于沸石载体

将称好的4.5g沸石放入到100mL种子培养基中，在121℃下灭菌20min，冷却后接入菌种S1或Z1。在37℃的生化培养箱中培养5天。分别将4.5g吸附有S1和4.5g吸附有Z1的沸石混合加入到1L发酵液中混合发酵。

菌种负载于海藻酸钠载体

将培养好的种子液在4℃条件下6000rpm离心10min，菌体沉淀用灭菌水洗一次。将菌体沉淀悬于1-5mL无菌水，制成浓悬液。向菌悬液中加入5mL6％海藻酸钠溶液，充分混匀，吸入灭菌针筒内，插上针头。将针头通过棉塞插入装有50mL灭菌的0.05mol/LCaCl₂溶液的小三角瓶内，一手匀速摇动三角瓶，另一手轻推注射器，令液滴匀速滴入CaCl₂溶液中。滴完后将三角瓶移入22℃水浴，放置1小时。倾去溶液，加入100mL无菌去离子水，洗一次。重新加入50mL0.05mol/LCaCl₂溶液，4℃平衡过夜。

表3吸附载体参数比较

表4游离发酵与固定化发酵的比较

实施例12到实施例28的固定化方法同实施例11，所有实施例的操作温度为35℃，搅拌转速为100rpm，其他操作参数及结果见表4。

从上述实施例可以看出：本发明的两株菌都可以以木糖为底物发酵产氢，从液相末端产物分析两株菌均为丁酸型发酵。混合培养发酵比单菌发酵效果好，说明两株菌之间存在着积极的相互协同作用。固定化后菌种的产氢得率有所升高，说明固定化可以一定程度的增加菌体的活性及稳定性。固定化使得两株菌实现了连续使用木糖发酵，不再局限于批次发酵。跟污泥发酵相比，无其他杂菌的干扰，产氢效率有所提高；跟单菌株发酵相比，混合菌株发酵过程中不易染菌、变异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于木糖发酵制氢的菌株，其中，所述菌株为蜡样芽孢杆菌S1株(Bacilluscereus,StrainS1)，其保藏编号为：CGMCCNO.9035。

2.一种用于木糖发酵制氢的菌株，其中，所述菌株为圆滑短波单胞菌Z1株(Brevundimonasnaejangsanensis,StrainZ1)，其保藏编号为：CGMCCNO.9036。

3.一种木糖发酵制氢方法，包括将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养的步骤，其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；

发酵菌种包括菌种M和/或菌种N；

制备菌种M的相应的菌株M为与权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株；优选所述发酵菌株M为与权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌S1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选所述发酵菌株M为如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌S1株；

制备菌种N的相应的菌株N为与权利要求2所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为90％的菌株；优选所述发酵菌株N为与权利要求2所述的圆滑短波单胞菌Z1株的16SrRNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选所述发酵菌株N为如权利要求2所述的圆滑短波单胞菌Z1株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为兼氧或厌氧发酵培养；优选所述发酵培养为厌氧发酵培养。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

所述发酵培养为菌种游离发酵培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基；

所述种子培养是将菌株接种至种子培养基，培养后获得含有菌种的种子液；

在含有菌种M的种子液中，菌种M的含量为0.001-0.1g/mL；

在含有菌种N的种子液中，菌种N的含量为0.001-0.1g/mL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

当发酵菌种为菌种M和菌种N时，在所接种的种子液中，含有菌种M的种子液与含有菌种N的种子液的体积比为10∶0.01-0.01∶10；优选含有菌种M的种子液与含有菌种N的种子液的体积比为0.1∶1-10∶1。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，

所述发酵培养为菌种固定化发酵培养，发酵菌种以负载于载体的形式接种到发酵培养基；

所述载体包括吸附载体和包埋载体，所述吸附载体选自大孔树脂、硅藻土、多孔玻璃、活性炭、木屑、陶瓷、沸石、丝瓜络、秸秆、玉米芯和人工纤维材料中的至少一种；所述包埋载体选自海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚乙烯醇凝胶中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述菌种在载体上的负载量为0.010-0.050g/g；

负载有菌种的载体的接种量为2-10g/L。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，菌种负载于载体的操作，包括将菌株接种到分散有载体的种子培养基中，在10-60℃下，搅拌转速在10-300rpm之间，培养24-108h，制得载有菌种的载体，其中所述菌株包括酵菌株M和/或菌株N。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，

菌种负载于载体的操作，包括将载体分散于含有菌种的种子液中，在10-60℃下，搅拌转速在10-300rpm之间，放置24-108h，制得载有菌种的载体；

所述含有菌种的种子液是将菌株接种至种子培养基进行种子培养后获得，其中所述菌株包括酵菌株M和/或菌株N。