CN111557438B - 一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，酿酒酵母为酿酒酵母SS‑A‑1，保藏编号为CCTCC M 2018625，包括以下步骤：发酵原料的制备：一层水果或蔬菜一层白砂糖交替铺设，静置得到发酵原料；酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS‑A‑1接入液体培养基中进行活化得到酿酒酵母发酵剂；发酵培养：将酿酒酵母发酵剂接种到陶坛中，常温好氧或兼氧发酵得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵得到成熟发酵产物；将成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热发酵液以除去发酵液中的酒精得到酵素液。酵素液中的酿酒酵母菌体内含有大量的SOD，菌体外含有大量的GABA。
Description
技术领域
本发明涉及酿酒酵母发酵技术领域，尤其是涉及一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法。
背景技术
GABA(gamma-aminobutyric acid)是已知的60多种作为神经递质的化学物质中的一种，是最普通的脑内抑制性递质。全脑1/3的突触以GABA作为递质。对GABA敏感的神经元特别集中于丘脑、下丘脑和枕叶皮层等脑结构中。GABA在一些因神经活动抑制而引起的病理心理中具有重要作用。这种递质在脑内的浓度变低，病人就会体验到过强的神经活动出现，如焦虑情绪。
国内市场上的酵素产品复杂多样，但正规产品都是用有机蔬果、谷物，也有药食两用中草药做食材基料，通过微生物发酵产生的益生菌代谢物营养素，因此，酵素归属于发酵型功能食品。通常蔬果里的多种氨基酸、维生素、矿物微量元素等营养素分子化后，成为不需经人体消化系统即可以直接吸收的小分子营养物质。但目前酵素的制备过程过于简单，导致发酵产物中易于人体吸收的营养成分过低(特别是GABA)。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能得到具有高含量量GABA的酵素液的酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SS-A-1，保藏编号为CCTCC M 2018625(已于申请号为2019100134210的一株富含GABA的酿酒酵母及其鉴定方法中公开)利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法包括以下步骤：
1)发酵原料的制备：获得洗净并切成片状的水果或蔬菜，将所述水果或蔬菜铺设于陶坛中，一层水果或蔬菜一层白砂糖交替铺设，水果或蔬菜与白砂糖的重量比为0.4～0.6：1，静置4～6h得到发酵原料；
2)酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS-A-1接入液体培养基中，于25～45℃，转速为100～400rpm条件下恒温振荡培养16～24h，得到酿酒酵母培养液；
将所述酿酒酵母培养液进行离心分离，用无菌生理盐水对离心得到的沉淀清洗2～4次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌生理盐水，涡旋振荡重悬沉淀，得到酿酒酵母发酵剂，所述酿酒酵母发酵剂中的酿酒酵母的活菌数大于109cfu/mL；
3)发酵培养：按体积百分比计算，将0.1～1％的所述酿酒酵母发酵剂接种到所述陶坛中，常温好氧或兼氧发酵，每隔12～24h搅拌一次，发酵时间为10～20d，得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵2～12个月，发酵温度为10～50℃，得到成熟发酵产物；将所述成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热所述发酵液以除去所述发酵液中的酒精得到酵素液。
作为优选，所述水果为苹果、香蕉、菠萝、梨、葡萄、芒果、火龙果、哈密瓜、柑橘、柠檬、蓝莓或无花果；所述蔬菜为胡萝卜、黄瓜、土豆、洋葱、南瓜或丝瓜。
作为优选，所述液体培养基为PDB液体培养基。
作为优选，所述液体培养基的成分及其重量份为葡萄糖5～10份、蛋白胨4～8份、乙酸钠1～5份、硫酸镁0.01～0.03份、硫酸锰0.01～0.02份、硫酸亚铁0.001～0.002份和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.04～0.07份，初始pH为4.0～5.5。
作为优选，所述发酵培养步骤中的厌氧发酵过程中保持pH为4.0～5.0。
作为优选，所述发酵培养步骤中的厌氧发酵开始时添加补料，所述补料的成分及其重量份为葡萄糖8～15份、蛋白胨4～8份、乙酸钠1～5份、硫酸镁0.01～0.03份、硫酸锰0.01～0.02份、硫酸亚铁0.001～0.002份、异十八醇0.001～0.002份和生育酚乙酸酯0.001～0.002份。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的整个发酵过程遵循古法发酵，除水果或蔬菜、白砂糖以及菌种外不添加其他物质，有效保留了水果或蔬菜额各种营养成分和功效，改善了水果或蔬菜的口感，在提高其保健作用的同时，有效提高了水果或蔬菜的附加值，具有很高的经济效益和市场推广前景；
1、本发明的整个发酵过程遵循古法发酵，酿酒酵母SS-A-1在发酵过程中破坏水果或蔬菜细胞的细胞壁和细胞膜，水果或蔬菜细胞中的液泡结构被破坏，富含营养物质的细胞液流出。酿酒酵母SS-A-1以水果或蔬菜中的糖类物质为碳源进行生长繁殖产生小分子酵素。酿酒酵母SS-A-1在古法发酵过程中将人体难以消化吸收的大分子物质分解为小分子营养物质，且产生了对身体有益的小分子酵素；
2、酿酒酵母SS-A-1能耐受0.3％的醋酸，在pH值较低的条件下依旧能快速地生长繁殖；
3、酿酒酵母SS-A-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌均有较好的抑菌作用，在发酵过程中不需要添加具有抑制有害菌生长的化学药剂或抑菌菌株。防止古法发酵过程中化学药剂或其他抑菌菌株的存在对酿酒酵母的菌体生长和发酵产生负面影响。
附图说明
图1为Fe2+与OD593的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1：
一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SS-A-1，保藏编号为CCTCC M 2018625，利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法包括以下步骤：
1)发酵原料的制备：获得洗净并切成片状的胡萝卜，将胡萝卜铺设于陶坛中，一层胡萝卜一层白砂糖交替铺设，胡萝卜与白砂糖的重量比为0.4：1，静置4h得到发酵原料；
2)酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS-A-1接入液体培养基中，于25℃，转速为100rpm条件下恒温振荡培养16h，得到酿酒酵母培养液；
将酿酒酵母培养液进行离心分离，用无菌生理盐水对离心得到的沉淀清洗2次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌生理盐水，涡旋振荡重悬沉淀，得到酿酒酵母发酵剂，酿酒酵母发酵剂中的酿酒酵母的活菌数大于109cfu/mL；
3)发酵培养：按体积百分比计算，将0.1％的酿酒酵母发酵剂接种到陶坛中，常温好氧或兼氧发酵，每隔12h搅拌一次，发酵时间为10d，得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵2个月，发酵温度为50℃，得到成熟发酵产物；将成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热发酵液以除去发酵液中的酒精得到酵素液。
液体培养基的成分及其重量份为葡萄糖5份、蛋白胨4份、乙酸钠1份、硫酸镁0.01份、硫酸锰0.01份、硫酸亚铁0.001份和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.04份，初始pH为4.3。
实施例2：
一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SS-A-1，保藏编号为CCTCC M 2018625，利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法包括以下步骤：
1)发酵原料的制备：获得洗净并切成片状的胡萝卜，将胡萝卜铺设于陶坛中，一层胡萝卜一层白砂糖交替铺设，胡萝卜与白砂糖的重量比为0.6：1，静置6h得到发酵原料；
2)酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS-A-1接入液体培养基中，于45℃，转速为400rpm条件下恒温振荡培养24h，得到酿酒酵母培养液；
将酿酒酵母培养液进行离心分离，用无菌生理盐水对离心得到的沉淀清洗4次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌生理盐水，涡旋振荡重悬沉淀，得到酿酒酵母发酵剂，酿酒酵母发酵剂中的酿酒酵母的活菌数大于109cfu/mL；
3)发酵培养：按体积百分比计算，将1％的酿酒酵母发酵剂接种到陶坛中，常温好氧或兼氧发酵，每隔24h搅拌一次，发酵时间为20d，得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵12个月，发酵温度为10℃，得到成熟发酵产物；将成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热发酵液以除去发酵液中的酒精得到酵素液。
液体培养基的成分及其重量份为葡萄糖10份、蛋白胨8份、乙酸钠5份、硫酸镁0.03份、硫酸锰0.02份、硫酸亚铁0.002份和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.07份，初始pH为4.1。
实施例3：
一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SS-A-1，保藏编号为CCTCC M 2018625，利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法包括以下步骤：
1)发酵原料的制备：获得洗净并切成片状的胡萝卜，将胡萝卜铺设于陶坛中，一层胡萝卜一层白砂糖交替铺设，胡萝卜与白砂糖的重量比为0.5：1，静置5h得到发酵原料；
2)酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS-A-1接入液体培养基中，于35℃，转速为300rpm条件下恒温振荡培养24h，得到酿酒酵母培养液；
将酿酒酵母培养液进行离心分离，用无菌生理盐水对离心得到的沉淀清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌生理盐水，涡旋振荡重悬沉淀，得到酿酒酵母发酵剂，酿酒酵母发酵剂中的酿酒酵母的活菌数大于109cfu/mL；
3)发酵培养：按体积百分比计算，将0.6％的酿酒酵母发酵剂接种到陶坛中，常温好氧或兼氧发酵，每隔24h搅拌一次，发酵时间为15d，得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵6个月，发酵温度为40℃，得到成熟发酵产物；将成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热发酵液以除去发酵液中的酒精得到酵素液。
液体培养基的成分及其重量份为葡萄糖7份、蛋白胨7份、乙酸钠3份、硫酸镁0.02份、硫酸锰0.01份、硫酸亚铁0.001份和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.05份，初始pH为4.6。
实施例4：
与实施例3的不同之处在于：液体培养基为PDB液体培养基。
实施例5：
与实施例3的不同之处在于：发酵培养步骤中将初发酵产物转移至发酵罐中，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH，保持发酵罐内的发酵液在厌氧发酵额过程中保持pH为4.3，厌氧发酵6个月。
实施例6：
与实施例5的不同之处在于：发酵培养步骤中发酵培养步骤中将初发酵产物转移至发酵罐中，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH为4.3，进行厌氧发酵，每隔2个月往发酵罐中添加补料。补料的成分及其重量份为葡萄糖10份、蛋白胨6份、乙酸钠3份、硫酸镁0.02份、硫酸锰0.01份、硫酸亚铁0.001份、异十八醇0.001份和生育酚乙酸酯0.002份。
实施例7：
与实施例6的不同之处在于：发酵培养步骤中1/2体积的酿酒酵母发酵剂制备成菌体胶珠，菌体胶珠与剩余的酿酒酵母发酵剂一起接入陶坛中，菌体胶珠的制备方法为获得1/2体积的酿酒酵母发酵剂，干燥得到固体菌体，将固体菌体加入到15g/L海藻酸钠溶液中，混合均匀得到菌体混合液，将菌体混合液滴入20g/L氯化钙溶液中，搅拌反应30min，过滤得到菌体胶珠。
实施例8：
与实施例7的不同之处在于：菌种固化步骤中在所述海藻酸钠溶液中还加入纳米活性炭，纳米活性炭与所述固体菌体的体积比为1:15。
纳米活性炭的制备方法：椰壳高温碳化后研磨过纳米筛得到活性炭粉末，将所述活性炭粉末加入到0.1～1mol/L的盐酸溶液中，活化反应1～4h后，离心干燥得到活化后活性炭，用蒸馏水清洗所述活化后活性炭，干燥得到所述纳米活性炭。
椰壳高温碳化的方法为：椰壳350±20℃高温煅烧1.5h；700±20℃高温煅烧4h；200±20℃高温煅烧3h。
实施例9：
实施例1～8中的胡萝卜可替换为苹果、香蕉、菠萝、梨、葡萄、芒果、火龙果、哈密瓜、柑橘、柠檬、蓝莓、无花果、黄瓜、土豆、洋葱、南瓜或丝瓜。
实施例10：抑菌效果
将酿酒酵母SS-A-1以5％的接种量接入到YPD液体培养基中，于30℃、180rpm振荡培养24h，于8000rpm/min离心10min。将上清液加入到一次性平皿中，于-20℃放置过夜后，进行冷冻干燥，加入上清液体积的1/15的蒸馏水溶解，再采用0.45um的无菌滤器过滤除去细菌后置于4℃保存备用。
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌分别以5％的接种量接入到LB液体培养基中，在30℃、200r/min培养24h后，取出用无菌水稀释至106cfu/mL(一般大肠杆菌稀释10倍、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和藤黄微球菌稀释100倍)。
分别取100ul指示菌涂布到LB固体培养基上，放入牛津杯，再于牛津杯中加入200ul浓缩后的无菌上清液，4℃静置3h以便培养基吸收上清液，然后放入37℃恒温静置培养12-18h，取出观察抑菌圈的形态和测量大小。根据抑菌圈的大小来判断菌株对4株指示菌的生长抑制能力。测定结果如表1所示。
表1.抑菌效果
从表1可知，酿酒酵母SS-A-1对3株病原菌的抑菌效果均较好，其中对藤黄微球菌的抑菌效果最好。
实施例11：
胞内SOD酶活测定方法：
1)酵母菌液制备：将酿酒酵母SS-A-1斜面菌种无菌条件下接种于装有30mL液体YPD培养基的100mL三角瓶中，30℃，180rpm振荡培养18-20h，得到种子液。将种子液以2％接种量接入装有100mL液体YPD培养基的500mL三角瓶中，30℃，180rpm振荡培养18h，得到菌液。
2)酵母细胞壁的破碎：将得到的菌液于8000r/min离心5min，弃上清，用无菌水洗涤1次，弃上清，加入无菌磷酸盐缓冲液，使OD600＝1，加入2％蜗牛酶，37℃水浴酶解30min，将酶解液于超声破碎仪中，900W，破碎时间5s，间隔时间5s，共破碎20-30min。将破碎处理的菌液于8000r/min离心5min，收集上清，待测。
表2.SOD酶活测定(超氧化物歧化酶检测试剂盒BB-4710)
充分混匀，室温放置10min，于波长550nm处，用蒸馏水调零，96孔微孔板比色。
结果计算：
SOD活力(U/mL)＝(对照吸光度-测定吸光度)/对照吸光度÷50％×反应体系稀释倍数×样品测定前稀释倍数。
表3.SOD活力测定结果：
由表3可知，实施例5中，相对pH值不经调节的情况，在厌氧发酵过程中保持发酵罐内的pH为4.3的情况下，酿酒酵母的胞内SOD值从40.57u/mL降为39.25u/mL。实施例6中，在厌氧发酵过程中，添加补料的操作使得酿酒酵母的胞内SOD值从39.25u/mL升为53.42u/mL。实施例7中，将一半的酿酒酵母发酵剂固定化使得酒酵母的胞内SOD值从53.42u/mL升为60.29u/mL，可能是因为固定化后菌株长期处于生态环境稳定的状态下，菌落生长繁殖速度快，胞内SOD合成速度快。实施例8中，菌体胶珠内含有纳米活性炭使得酿酒酵母的胞内SOD值从60.29u/mL升为65.58u/mL，可能是因为纳米活性炭具有丰富的孔隙结构，该孔隙结构的存在加快了胶珠内外的物质传输速度。
实施例12：
酿酒酵母SS-A-1(Saccharomyces cerevisiae SS-A-1)胞外GABA含量测定：
1)溶液配制：
0.1mol/L四硼酸钠缓冲液：准确称取四硼酸钠9.53g，溶于蒸馏水中，并定容至250mL；
80％重蒸苯酚溶液：准确称取80.00g重蒸苯酚，并溶于20mL水中，避光搅拌使之充分溶解，可置4℃冰箱中避光保存备用；
6％重蒸苯酚溶液：准确量取7.5mL 80％重蒸苯酚，溶于蒸馏水中，定容至100mL，现用现配；
2)样品处理：
将酵母菌SS-A-1单菌落接种于装有50mL YPD液体培养基的300mL三角瓶中，于180rpm振荡培养18-20h。将培养液无菌条件下4000r/min离心10min，去上清，加无菌水洗涤2次，离心，弃上清液，得到酵母菌泥。
取1g酿酒酵母菌泥样品置于三角瓶中，加入50mL 60％的乙醇溶液，水浴振荡3h，4000r/min离心20min，上清液移入茄形瓶中，重复上述操作，合并上清液，混合，浓缩至10mL，备用；
取上述样品液20μL于样品瓶中，加入邻苯二甲醛衍生液100μL，涡旋振荡5s，静置2min后，过0.45μm滤膜，取10μL进样，进行过柱；
色谱条件：
色谱柱：Agilent C18 AQ 4.6mm*250mm*5um；
柱温：30℃；
进样量：10uL；
波长：254nm；
流速：0.5mL/min
流动相：乙酸钠-乙酸pH＝4：甲醇＝35:65
3)测定波长的选择：
取0.5mg/mL GABA标准溶液0.6mL，加入0.2mL 0.1mol/L四硼酸钠缓冲溶液，0.4mL6％重蒸苯酚溶液，混匀，加入0.6mL体积分数7.5％NaClO溶液，混匀，于沸水浴中加热10min，立即冰浴5min，待溶液出现篮绿色后，加入体积分数60％乙醇溶液2.0mL，在500～700nm进行波谱扫描。最后测得645nm处吸光值最大；
4)绘制标准曲线：
准确配制0.02、0.05、0.1、0.15、0.25、0.3、0.5、0.6mg/mL的GABA标准溶液，测定其吸光度。取GABA标准溶液0.6mL，加入0.2mL 0.1mol/L四硼酸钠缓冲溶液，6％重蒸苯酚溶液0.4mL，混匀，加入体积分数为7.5％NaClO溶液1mL，混匀，沸水浴加热10min，立即冰浴5min，待溶液出现蓝绿色后，加入60％乙醇溶液2mL，在645nm测定吸光值，以GABA浓度为横坐标，A645为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线为：y＝1.5303x-0.0257，R2＝0.9931，y为吸光度，x为GABA浓度，mg/mL；
5)测定样品GABA浓度：
将步骤2)处理得到的样品按照步骤4)的方法测定其吸光度，然后根据步骤4)制定的标准曲线算出样品中GABA的含量，测定结果如表4所示。样品分别取自实施例3～7中酵素液中的酿酒酵母。
表4.GABA浓度测定结果
由表4可知，实施例5中，相对pH值不经调节的情况，在厌氧发酵过程中保持发酵罐内的pH为4.3的情况下，酿酒酵母的胞外GABA含量从1345.42mg/L上升为1595.21mg/L。当酿酒酵母从好氧或兼氧发酵转变为厌氧发酵时，酿酒酵母菌体对数生长期结束，进入GABA合成期。发酵罐中的pH保持在4.3状态时，有助于谷氨酸脱羧酶保持较高的活力，进而提高GABA的合成量。实施例6中，在厌氧发酵过程中，添加补料的操作使得酿酒酵母的胞外GABA含量从1595.21mg/L上升为3524.64mg/L。补料中的异十八醇和生育酚乙酸酯对α-酮戊二酸脱氢酶具有活性抑制作用，抑制琥珀酰CoA转变为琥珀酸。TCA循环被截断，由谷氨酸转化得到的GABA就不会进一步与α-酮戊二酸作用生成琥珀酸。另一方面，TCA循环受阻后，要维持酿酒酵母生理活动所需的能量，只有通过GABA支路，通过谷氨酸的脱羧作用产生ATP来维持菌体能量的消耗，从而实现GABA的大量积累。
实施例7中，将一半的酿酒酵母发酵剂固定化使得酒酵母的胞外GABA含量从3524.64mg/L升为3624.58mg/L，固定化后菌株长期处于生态环境稳定的状态下，菌落生长繁殖速度快，胞外GABA含量合成速度快。实施例8中，菌体胶珠内含有纳米活性炭使得酿酒酵母的胞外GABA含量从3624.58mg/L升为4234.43mg/L，纳米活性炭具有丰富的孔隙结构，该孔隙结构的存在加快了胶珠内外的物质传输速度。
实施例12：
GABA含量、总抗氧化能力的测定方法
(1)实施例3中酵素液中GABA测定方法：
将实施例3中发酵12d的酵素液摇匀，取样100mL，取样10mL，按上述GABA测定方法进行样品预处理和HPLC法测定，重复3次。
测定结果(发酵12d酵素液)：
发酵12d的酵素液，经HPLC检测，酵素液中GABA平均含量为1.821g/L。
(2)总抗氧化能力测定方法(T-AOC检试剂盒)：
货号：BC1315
规格：100T/96S
产品内容：
提取液：液体100mL×1瓶，使用前预冷。
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
I.标准曲线绘制：将20umol/mL FeSO4标准溶液稀释至0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156umol/mL，吸取100ul标准溶液(蒸馏水做空白)加入100ul试剂二充分混匀，反应10min，双蒸水调零测定A593，计算A＝A标准-A空白，此时Fe2+终浓度为0.2、0.1、0.05、0.0125、0.0625、0.003125、0.00156、0.00078umol/mL。
II.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至593nm，蒸馏水调零。
III.操作表
IV.标准曲线绘制：如图1所示，以Fe2+终浓度为横坐标，以A为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝kx+b，将A’带入方程求得x(umol/mL)。标准曲线y＝9.6287x+0.0169，R2＝0.9995。x为Fe2+浓度，y为吸光值。
计算公式：
总抗氧化能力(U/mL)＝x*V反应总体积÷V样品体积＝34*x
V.测定结果(发酵12d酵素液)
发酵12d的胡萝卜酵素产品，经HPLC检测，发酵液中GABA平均含量为153.18U/mL。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (4)
1.一 种 利 用酿 酒 酵 母 制备 水 果 蔬 菜 酵 素的 方 法 ，所 述 酿 酒 酵母 为 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)SS-A-1，保藏编号为CCTCC M 2018625，其特征在于利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法包括以下步骤：
1)发酵原料的制备：获得洗净并切成片状的水果或蔬菜，将所述水果或蔬菜铺设于陶坛中，一层水果或蔬菜一层白砂糖交替铺设，水果或蔬菜与白砂糖的重量比为0 .4～0 .6：1，静置4～6h得到发酵原料；
2)酿酒酵母发酵剂的制备：将酿酒酵母SS-A-1接入液体培养基中，于25～45℃，转速为100～400rpm条件下恒温振荡培养16～24h，得到酿酒酵母培养液；
将所述酿酒酵母培养液进行离心分离，用无菌生理盐水对离心得到的沉淀清洗2～4次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌生理盐水，涡旋振荡重悬沉淀，得到酿酒酵母发酵剂，所述酿酒酵母发酵剂中的酿酒酵母的活菌数大于109 cfu/mL；
3)发酵培养：按体积百分比计算，将0 .1～1％的所述酿酒酵母发酵剂接种到所述陶坛中，常温好氧或兼氧发酵，每隔12～24h搅拌一次，发酵时间为10～20d，得到初发酵产物；将初发酵产物转移至发酵罐中，厌氧发酵2～12个月，发酵温度为10～50℃，并且每隔2个月往发酵罐中添加补料，补料的成分及其重量份为葡萄糖10份、蛋白胨6份、乙酸钠3份、硫酸镁0.02份、硫酸锰0 .01份、硫酸亚铁0 .001份、异十八醇0 .001份和生育酚乙酸酯0 .002份，得到成熟发酵产物；将所述成熟发酵产物过滤得到发酵液，加热所述发酵液以除去所述发酵液中的酒精得到酵素液；
1/2体积的酿酒酵母发酵剂制备成菌体胶珠，菌体胶珠与剩余的酿酒酵母发酵剂一起接入陶坛中，菌体胶珠的制备方法为获得1/2体积的酿酒酵母发酵剂，干燥得到固体菌体，将固体菌体加入到15g/L海藻酸钠溶液中，混合均匀得到菌体混合液，将菌体混合液滴入20g/L氯化钙溶液中，搅拌反应30min，过滤得到菌体胶珠；
在所述海藻酸钠溶液中还加入纳米活性炭，纳米活性炭与所述固体菌体的体积比为1:15；
纳米活性炭的制备方法：椰壳高温碳化后研磨过纳米筛得到活性炭粉末，将所述活性炭粉末加入到0 .1～1mol/L的盐酸溶液中，活化反应1～4h后，离心干燥得到活化后活性炭，用蒸馏水清洗所述活化后活性炭，干燥得到所述纳米活性炭， 椰壳高温碳化的方法为：椰壳350±20℃高温煅烧1 .5h；700±20℃高温煅烧4h；200±20℃高温煅烧3h。
2.根据权利要求1所述的一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，其特征在于，所述水果为苹果、香蕉、菠萝、梨、葡萄、芒果、火龙果、哈密瓜、柑橘、柠檬、蓝莓或无花果；所述蔬菜为胡萝卜、黄瓜、土豆、洋葱、南瓜或丝瓜。
3.根据权利要求1所述的一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，其特征在于，所述液体培养基为PDB液体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用酿酒酵母制备水果蔬菜酵素的方法，其特征在于，所述发酵培养步骤中的厌氧发酵过程中保持pH为4 .0～5 .0。
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