JP4307456B2 - グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ならびにその使用プロセス - Google Patents
グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ならびにその使用プロセス Download PDFInfo
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Description
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、ならびにグルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するためのプロセスに関する。
（１．発明の分野）
本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、ならびにグルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するためのプロセスに関する。
（２．関連技術の説明）
グルタチオン（ＧＳＨ）は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびグリシンから構成される低分子ペプチドであり、天然の抗酸化物質である。グルタチオンは、１８８８年に初めて単離され、１９２１年に正式に命名された。グルタチオンは、動物、植物および微生物を含む生物において広く見出されている。動物細胞におけるその代謝および生理学的機能、ならびにグルタチオンを過剰生成するためのプロセスは、詳しく報告されている（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。グルタチオンは、肝臓保護剤（ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）、毒素のスカベンジャーおよび点眼剤において使用されてきた。グルタチオンは、機能性健康食品製品の有望な成分でもある。
グルタチオン（ＧＳＨ）は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびグリシンから構成される低分子ペプチドであり、天然の抗酸化物質である。グルタチオンは、１８８８年に初めて単離され、１９２１年に正式に命名された。グルタチオンは、動物、植物および微生物を含む生物において広く見出されている。動物細胞におけるその代謝および生理学的機能、ならびにグルタチオンを過剰生成するためのプロセスは、詳しく報告されている（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。グルタチオンは、肝臓保護剤（ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）、毒素のスカベンジャーおよび点眼剤において使用されてきた。グルタチオンは、機能性健康食品製品の有望な成分でもある。
グルタチオンを生成するための産業的プロセスとしては、化学合成、抽出、酵素的生成、および醗酵が挙げられ、その中でも、その操作が容易であるので、醗酵が好ましい。さらに、酵母を使用して醗酵によって生成されるグルタチオンは、食品において使用されるには、他の微生物（例えば、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を使用する醗酵方法により生成される同じ化合物よりも安全である。理由として、酵母は、機能性飲料および健康食品製品中で使用するためのグルタチオンを調製するために広く利用されているからである。アミドおよびインドフェノールのような変異原（これは、グルタチオン生成を改良する）によって生成される酵母変異株もまた、報告されている（特許文献１）。
生成物であるγ−グルタミルシステイン（γ−ＧＣ）は、グルタチオン合成プロセスにおけるグルタチオンの前駆体である。γ−グルタミルシステインは、マウスにおいて、肝臓に対するＣＣｌ４による損傷を低下させるにあたって有効であることが報告されている。この生成物は、グルタチオンと同様の機能を有し、グルタチオンシンセターゼと同時に存在する場合、細胞中のグルタチオン含有量を調節し得る。さらに、γ−グルタミルシステインは、ヒト乳汁中の重要な要素であり、被験体の免疫発生能力を高め得る。
特開昭６０−２４８１９９号公報
Ｔａｔｅｉｓｈｉ Ｎ．ら，Ｊ．Ｂ．１９７４．７５：９３−１０３
Ｉｓｓｅｌｓ Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８８．３７：８８１−８８８
Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３．５２：７１１−６０
（発明の要旨）
本発明の１つの課題は、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の全ての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物を提供することである。上記培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成し得る特徴的な性質を有する。
本発明の１つの課題は、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の全ての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物を提供することである。上記培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成し得る特徴的な性質を有する。
本発明の別の課題は、本発明に従う培養物を含む組成物を提供することである。
本発明のさらに別の課題は、グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスを提供することである。このプロセスは、本発明の生物学的に純粋な培養物を培養することによって特徴づけられる。
上記の課題を解決するために、本発明は、具体的には以下を提供する：
（項目１） ＹＡＯ２０３２株およびＹＡＯ３０８３株からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のすべての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有し、該ＹＡＯ２０３２株は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ １７７８９として受託されており、該ＹＡＯ３０８３は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に受託番号ＤＳＭ １７７９０として受託されている、培養物。
（項目２） 項目１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ３０８３株である、培養物。
（項目３） 項目１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ２０３２株である、培養物。
（項目４） 項目１に記載の培養物を含む、組成物。
（項目５） 項目４に記載の組成物であって、該組成物は、薬学的組成物または食品組成物である、組成物。
（項目６） グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスであって、該プロセスは、項目１に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物を培養する工程によって特徴付けられる、プロセス。
（項目７） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ３０８３である、プロセス。
（項目８） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２である、プロセス。
（項目９） 項目６に記載のプロセスであって、培養培地が、アミノ酸を含む、プロセス。
（項目１０） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システイン、グリシン、およびグルタミン酸からなる群より選択される、プロセス。
（項目１１） 項目１０に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システインである、プロセス。
（項目１２） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、０．１％〜０．７５％の範囲の濃度を有する、プロセス。
（項目１３） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、醗酵開始から１５時間目〜４８時間目に前記培養培地に添加される、プロセス。
（項目１４） 項目６に記載のプロセスであって、前記培養は、バッチ培養または流加培養である、プロセス。
（項目１５） 項目１４に記載のプロセスであって、前記培養は、流加培養である、プロセス。
（項目１６） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、２０℃〜４０℃の範囲にある温度にて培養される、プロセス。
（項目１７） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、３〜７の範囲にあるｐＨ値にて培養される、プロセス。
（項目１８） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、好気性条件下で培養される、プロセス。
（項目１９） 項目６に記載のプロセスであって、グルタチオンおよび／またはγ−グルタミルシステインを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、プロセス。
（項目１） ＹＡＯ２０３２株およびＹＡＯ３０８３株からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のすべての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有し、該ＹＡＯ２０３２株は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ １７７８９として受託されており、該ＹＡＯ３０８３は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に受託番号ＤＳＭ １７７９０として受託されている、培養物。
（項目２） 項目１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ３０８３株である、培養物。
（項目３） 項目１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ２０３２株である、培養物。
（項目４） 項目１に記載の培養物を含む、組成物。
（項目５） 項目４に記載の組成物であって、該組成物は、薬学的組成物または食品組成物である、組成物。
（項目６） グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスであって、該プロセスは、項目１に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物を培養する工程によって特徴付けられる、プロセス。
（項目７） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ３０８３である、プロセス。
（項目８） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２である、プロセス。
（項目９） 項目６に記載のプロセスであって、培養培地が、アミノ酸を含む、プロセス。
（項目１０） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システイン、グリシン、およびグルタミン酸からなる群より選択される、プロセス。
（項目１１） 項目１０に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システインである、プロセス。
（項目１２） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、０．１％〜０．７５％の範囲の濃度を有する、プロセス。
（項目１３） 項目９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、醗酵開始から１５時間目〜４８時間目に前記培養培地に添加される、プロセス。
（項目１４） 項目６に記載のプロセスであって、前記培養は、バッチ培養または流加培養である、プロセス。
（項目１５） 項目１４に記載のプロセスであって、前記培養は、流加培養である、プロセス。
（項目１６） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、２０℃〜４０℃の範囲にある温度にて培養される、プロセス。
（項目１７） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、３〜７の範囲にあるｐＨ値にて培養される、プロセス。
（項目１８） 項目６に記載のプロセスであって、前記微生物は、好気性条件下で培養される、プロセス。
（項目１９） 項目６に記載のプロセスであって、グルタチオンおよび／またはγ−グルタミルシステインを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、プロセス。
（発明の詳細な説明）
酵母は、グルタチオンを生成し得る。本発明は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを過剰生成し得る、新規かつ安定なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を提供する。グルタチオンおよび／またはその前駆体を生成するためのプロセスもまた、本発明において例示されている。
酵母は、グルタチオンを生成し得る。本発明は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを過剰生成し得る、新規かつ安定なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を提供する。グルタチオンおよび／またはその前駆体を生成するためのプロセスもまた、本発明において例示されている。
本発明は、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の全ての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物を提供する。この培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成し得る特徴的な性質を有する。
ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３はともに、フード インダストリー リサーチ アンド デベロップメント インスティテュート（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＦＩＲＤＩ）（Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）で、受託番号ＣＣＲＣ２１７２７の下で受託されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２に由来する。このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２株（ＣＣＲＣ２１７２７）は、本発明に従うアッセイにおいて５〜８ｍｇ／ｇ 乾燥細胞のグルタチオンを生成する。このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）株は、３０〜３００μｇ／ｍＬのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いた変異誘発に１５分間〜２０分間供され、得られた変異株は、酸化剤および／または毒素（例えば、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、１，２，４−トリアゾールおよびメチルグリオキサール）を含むスクリーニング培地でスクリーニングされる。高濃度の酸化剤を含有するスクリーニング培地で変異株を培養すると、グルタチオンおよび／またはその前駆体を過剰生成する能力を有する株が、代々引き続いてスクリーニングされ得る。本発明に従って、ＹＡＯ２０３２株は、変異誘発およびスクリーニングの３世代後に得られ、この株は、２５〜２６ｍｇ／ｇ 乾燥細胞重量のグルタチオンを安定に生成する。ＹＡＯ３０８３は、ＹＡＯ２０３２を変異させ、その変異株をスクリーニングすることにより、さらに得られ、この株は、３２〜３４ｍｇ／ｇ 乾燥細胞重量のグルタチオンを安定に生成する。ＹＡＯ３０８３によるグルタチオンの収量は、野生型株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）より４倍高い。
本発明に従う株は、非常に安定で、数回の継代および長期間の保存の後ですら、高収量でグルタチオンおよびその前駆体を生成する能力を保持する。本発明のアッセイにおいて、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３は、遺伝的安定性を保持し、３０世代後ですら、高収率でグルタチオンおよびその前駆体を生成する。加えて、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３はまた、３年間の保存の後ですら、グルタチオンおよびその前駆体を過剰生成するにおいて活発である。よって、本発明に従う株は、産業的醗酵中で使用するために提供される。
ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３に形態的特徴は、野生型株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）の形態的特徴に類似している。酵母を培養するために一般に使用される培地は、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３の培養に適している。本発明の一実施形態において、本発明の株を培養するための培地は、ＹＡ培地（ｐＨ５．１）（３ｇ／Ｌ 酵母抽出物、３ｇ／Ｌ 麦芽抽出物、５ｇ／Ｌ ペプトン、および１０ｇ／Ｌ デキストロースを含有する）である。本発明の一実施形態において、ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３は、好気条件下で２０〜４０℃で培養される。
本発明はまた、本発明の培養物を含む組成物を提供する。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、数千年もの間ヒトによって消費されてきており、ヒトの消費について安全な微生物であると考えられている。本発明の組成物は、本発明に従う微生物株の生物学的に純粋な培養物を含む。好ましくは、本発明に従う組成物は、薬学的組成物または食品組成物である。本発明の好ましい一実施形態において、この組成物は、機能性飲料または健康食品製品である。
本発明は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスをさらに提供し、本発明の微生物の生物学的に純粋な培養物を適切な培地中で培養する工程によって特徴づけられる。
好ましくは、この培養培地は、アミノ酸を含む。グルタチオンは、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびグリシンから構成される。従って、アミノ酸を培養培地に添加すると、グルタチオンおよびその前駆体の生成に利益をもたらす。好ましくは、このアミノ酸は、システイン、グリシンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるものである。最も好ましくは、このアミノ酸はシステインである。グリシンまたはシステインを添加すると、γ−グルタミルシステインの生成に利益をもたらす。さらに、システインを添加すると、グルタチオンの生成にも利益をもたらす。システインとグリシンとを組み合わせると、グルタチオンの生成に利益をもたらし、γ−グルタミルシステインのほぼ全てが、グルタチオンに変換される。システインとグルタミン酸とを組み合わせると、グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインの両方の生成に利益をもたらす。好ましくは、このアミノ酸は、０．１％〜０．７５％の範囲の濃度を有する。
このアミノ酸を添加するタイミングは、種々の程度にまで収量に対して影響を及ぼす。好ましくは、このアミノ酸は、醗酵開始から１５〜４８時間後に、培養培地に添加される。
醗酵は、当業者に周知の様式で行われ得る。好ましくは、培養は、バッチ培養または流加培養である。より好ましくは、培養は、流加培養である。バッチ培養法におけるグルタチオン収量および乾燥細胞重量は、ともに十分である。さらに、流加培養において得られるグルタチオン収量および乾燥細胞重量は、バッチ培養において得られるものより良好である。
本発明に従うプロセスの温度は、酵母を使用する一般的な醗酵の温度に類似している。好ましくは、この微生物は、２０〜４０℃の範囲の温度で培養される。より好ましくは、この微生物は、３０℃の温度で培養される。
本発明に従う培養物のｐＨ値は、酸性から中性である。好ましくは、この微生物は、３〜７の範囲のｐＨ値で培養される。より好ましくは、この微生物は、ｐＨ値７で培養される。
グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインは、微生物中に存在するかまたは培養培地中に存在する。本発明に従うプロセスは、グルタチオンおよび／またはγ−グルタミルシステインを液体培養培地から回収する工程をさらに包含する。この回収は、当業者に周知の様式で行われ得る。
以下の実施例は、例示目的で提供されるにすぎず、本発明の範囲を限定するとは意図されない。
（株）
実施例において使用される株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）およびその変異株である。
実施例において使用される株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）およびその変異株である。
（振盪フラスコ培養）
グリセロールストックされたＣＣＲＣ２１７２７を、寒天プレート上に配置して、３０℃にて２日間培養した。その後、新しい単一コロニーを、４．７５ｍＬのＹＭ培地（３ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／Ｌの麦芽抽出物、５ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌのデキストロース、ｐＨ５．１）中に接種し、３０℃にて攪拌速度１５０ｒｐｍで２４時間培養した。その培養物のうちの５％を、スクリーニング培地（６０ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌペプトン、３０ｇ／Ｌ酵母抽出物、ｐＨ５．１）中にさらに接種し、同じ条件下で２４時間〜４８時間培養した。
グリセロールストックされたＣＣＲＣ２１７２７を、寒天プレート上に配置して、３０℃にて２日間培養した。その後、新しい単一コロニーを、４．７５ｍＬのＹＭ培地（３ｇ／Ｌの酵母抽出物、３ｇ／Ｌの麦芽抽出物、５ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／Ｌのデキストロース、ｐＨ５．１）中に接種し、３０℃にて攪拌速度１５０ｒｐｍで２４時間培養した。その培養物のうちの５％を、スクリーニング培地（６０ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌペプトン、３０ｇ／Ｌ酵母抽出物、ｐＨ５．１）中にさらに接種し、同じ条件下で２４時間〜４８時間培養した。
（醗酵槽培養）
新たな単一コロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地中に接種した。２４時間培養した後、その培養物のうちの３％〜５％を、１００ｍＬの活性培地（６０ｇ／Ｌのグルコース、１２ｇ／Ｌのペプトン、１２ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．１）中に、同じ条件下で接種した。その培養物のうちの５％を、主要培地（５５ｇ／Ｌのグルコース、８．３ｇ／Ｌの糖蜜、７ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｉｄ）、４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．１）を含む５Ｌ醗酵槽中にさらに接種した。一般的な醗酵条件は、温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、曝気１Ｌ／分であった。
新たな単一コロニーを、５０ｍＬのＹＭ培地中に接種した。２４時間培養した後、その培養物のうちの３％〜５％を、１００ｍＬの活性培地（６０ｇ／Ｌのグルコース、１２ｇ／Ｌのペプトン、１２ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．１）中に、同じ条件下で接種した。その培養物のうちの５％を、主要培地（５５ｇ／Ｌのグルコース、８．３ｇ／Ｌの糖蜜、７ｇ／Ｌのコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｉｄ）、４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．９ｇ／Ｌの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．１）を含む５Ｌ醗酵槽中にさらに接種した。一般的な醗酵条件は、温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、曝気１Ｌ／分であった。
（変異誘発）
３０℃にて３時間新たに培養した培養物を、滅菌リン酸緩衝液で２回洗浄し、その後、３０μｇ／ｍＬ〜３００ｇ／ｍＬのＮＴＧを添加した。その細胞とＮＴＧとを混合して、１５分間そのままにした。リン酸緩衝液で２回洗浄した後の細胞を、１，２，４−トリアゾールと、ＮａＮ３と、塩化ベンジルと、メチルグリオキサールとを含む、スクリーニングプレート上に配置した。そのプレートを、変異株をスクリーニングするために、３０℃にて３日間〜７日間培養した。
３０℃にて３時間新たに培養した培養物を、滅菌リン酸緩衝液で２回洗浄し、その後、３０μｇ／ｍＬ〜３００ｇ／ｍＬのＮＴＧを添加した。その細胞とＮＴＧとを混合して、１５分間そのままにした。リン酸緩衝液で２回洗浄した後の細胞を、１，２，４−トリアゾールと、ＮａＮ３と、塩化ベンジルと、メチルグリオキサールとを含む、スクリーニングプレート上に配置した。そのプレートを、変異株をスクリーニングするために、３０℃にて３日間〜７日間培養した。
（グルタチオンを評価するための発色反応）
１ｍＬの培養物を、細胞ペレットを収集するために遠心分離した。そのペレットに、酸抽出用の０．１Ｎ酢酸を同体積添加した。抽出された細胞を、水中にて１０分間煮沸し、氷上に放置した。その上清を得るために、さらに遠心分離を実施した。その上清に、３ｍＬの反応溶液（０．６ｍＭの ５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７）を３ｍＬ添加し、充分に混合した。１０分間反応させた後、その溶液のＯＤ４１２吸光度を、その反応物のイオウ含有量を評価するためにアッセイした。
１ｍＬの培養物を、細胞ペレットを収集するために遠心分離した。そのペレットに、酸抽出用の０．１Ｎ酢酸を同体積添加した。抽出された細胞を、水中にて１０分間煮沸し、氷上に放置した。その上清を得るために、さらに遠心分離を実施した。その上清に、３ｍＬの反応溶液（０．６ｍＭの ５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７）を３ｍＬ添加し、充分に混合した。１０分間反応させた後、その溶液のＯＤ４１２吸光度を、その反応物のイオウ含有量を評価するためにアッセイした。
（グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを分析するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））
上記のような酸抽出溶液を、ＨＰＬＣアッセイに供した。上記の上清０．５ｍＬに、０．１ｍＬの４０ｍＭヨード酢酸および０．２ｍＬの１Ｍ ＮａＨＣＯ３を添加した。この混合物を、暗中にて１時間反応させ、その後、一晩反応のために、着色剤である０．５ｍＬの１．５％ １−フルオロ−２，４−ジニトロ−ベンゼン（ＦＤＮＢ）を添加した。その後、その反応溶液を、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して濾過した。ＨＰＬＣ条件を、下記に列挙した（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｄ．およびＸ．Ｃｈｅｎ．１９９５．Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１：１２７−１３６）：
移動相：緩衝液Ａ：８０％メタノール；
緩衝液Ｂ：２００ｍＬの酢酸ナトリウム溶液（１２２ｍＬの水と３７８ｍＬの氷酢酸との中にある２７２ｇの酢酸ナトリウム三水和物）および８００ｍＬの緩衝液Ａ
クロマトグラフィーカラム：ＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂＴＭ ＮＨ２カラム
流量：１ｍＬ／分間
検出器：ＵＶ検出器（３６５ｎｍ）。
上記のような酸抽出溶液を、ＨＰＬＣアッセイに供した。上記の上清０．５ｍＬに、０．１ｍＬの４０ｍＭヨード酢酸および０．２ｍＬの１Ｍ ＮａＨＣＯ３を添加した。この混合物を、暗中にて１時間反応させ、その後、一晩反応のために、着色剤である０．５ｍＬの１．５％ １−フルオロ−２，４−ジニトロ−ベンゼン（ＦＤＮＢ）を添加した。その後、その反応溶液を、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して濾過した。ＨＰＬＣ条件を、下記に列挙した（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｄ．およびＸ．Ｃｈｅｎ．１９９５．Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１：１２７−１３６）：
移動相：緩衝液Ａ：８０％メタノール；
緩衝液Ｂ：２００ｍＬの酢酸ナトリウム溶液（１２２ｍＬの水と３７８ｍＬの氷酢酸との中にある２７２ｇの酢酸ナトリウム三水和物）および８００ｍＬの緩衝液Ａ
クロマトグラフィーカラム：ＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂＴＭ ＮＨ２カラム
流量：１ｍＬ／分間
検出器：ＵＶ検出器（３６５ｎｍ）。
（実施例１：株の変異誘発およびスクリーニング）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）を、ＮＴＧ変異誘発に供し、その変異株を、酸化剤および／または毒素（１，２，４−トリアゾール、ＮａＮ３、塩化ベンジル、およびメチルグルオキサール）によってスクリーニングした。ＮＴＧと、酸化剤および／または毒素の量が多く使用されるほど、グルタチオンの収量が高かった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２の野生株（ＣＣＲＣ２１７２７）のグルタチオン収量は、５ｍｇ／ｇ乾燥細胞〜８ｍｇ／ｇ乾燥細胞であった。４世代の変異誘発およびスクリーニングの後、グルタチオン収量が２５ｍｇ／ｇ乾燥細胞〜２６ｍｇ／ｇ乾燥細胞であるＹＡＯ２０３２と、グルタチオン収量が３４ｍｇ／ｇ乾燥細胞であるＹＡＯ３０８３を、約８，０００個の変異株から得た。理解され得るように、本発明の株のグルタチオン収量は、約４倍高かった。このプロセスおよび系統図を、図１に示す。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）を、ＮＴＧ変異誘発に供し、その変異株を、酸化剤および／または毒素（１，２，４−トリアゾール、ＮａＮ３、塩化ベンジル、およびメチルグルオキサール）によってスクリーニングした。ＮＴＧと、酸化剤および／または毒素の量が多く使用されるほど、グルタチオンの収量が高かった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２の野生株（ＣＣＲＣ２１７２７）のグルタチオン収量は、５ｍｇ／ｇ乾燥細胞〜８ｍｇ／ｇ乾燥細胞であった。４世代の変異誘発およびスクリーニングの後、グルタチオン収量が２５ｍｇ／ｇ乾燥細胞〜２６ｍｇ／ｇ乾燥細胞であるＹＡＯ２０３２と、グルタチオン収量が３４ｍｇ／ｇ乾燥細胞であるＹＡＯ３０８３を、約８，０００個の変異株から得た。理解され得るように、本発明の株のグルタチオン収量は、約４倍高かった。このプロセスおよび系統図を、図１に示す。
ＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ３８１２４，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に、それぞれ受託番号ＤＳＭ １７７８９およびＤＳＭ １７７９０として受託された。
（実施例２：安定性）
野生型株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）、ならびにＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ１１７６を、３０世代にわたって連続継代し、それらの収量を評価した。
野生型株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）、ならびにＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ１１７６を、３０世代にわたって連続継代し、それらの収量を評価した。
その結果を、図２に示す。示されるように、本発明の株は、良好な安定性を有する。
別に、野生型株であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １−１２（ＣＣＲＣ２１７２７）、ならびにＹＡＯ２０３２およびＹＡＯ３０８３を、長期保存アッセイに供した。その結果を、表１に示す。４℃において３年間保存した凍結乾燥細胞のグルタチオン収量、乾燥細胞重量、および生存率は、新鮮な細胞と同様であり、有意な変化はなかった。このように、その保存安定性は、満足がいくものであった。
（表１）
グルタチオン生成を改良するために、Ｌ−システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、カザミノ酸、およびペプトンを、ＹＡＯ２０３２の醗酵開始時または培養１５時間目に、培養培地に添加した。４１２ｎｍでの吸光度の結果を、図３に示す。この図は、細胞内イオウ含有量が、開始時に上記アミノ酸を添加した場合に少し改善されたことを示す。しかし、これらのイオウ含有量は、非常に増加した。システインを添加することにより最良の効果が得られることに、注意すべきである。
ＨＰＬＣを、グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインの分布を分析するために、さらに利用した。その結果を、図４に示す。グリシンを添加すると、グルタチオン生成を阻害し、システインを添加すると、グルタチオンが増加することなくγ−グルタミルシステインが蓄積されることが、見出された。グルタミン酸の添加だけが、γ−グルタミルシステイン生成もグルタチオン生成も誘導しない。
システインは、γ−グルタミルシステインの蓄積を改善するので、システインと他のアミノ酸とを組み合わせることもまた、アッセイした。その結果を、図５に示す。理解され得るように、システインとグリシンとを組み合わせると、グルタチオン生成に利益をもたらし、ほぼすべてのγ−グルタミルシステインが、グルタチオンへと変換される。システインとグルタミン酸とを組み合わせると、グルタチオン生成およびγ−グルタミルシステイン生成の両方に利益をもたらす。
（実施例４：５Ｌ醗酵槽における培養）
ＹＡＯ３０８３を、本実施例において利用した。そのバッチ培養における結果を、図６に示す。４０時間のバッチ培養の後、乾燥細胞重量当たりのグルタチオン生成および細胞溶液の体積当たりのグルタチオン濃度の両方を、定常期において得た。１Ｌ当たりの乾燥細胞重量は、約１５ｇであった。グルタチオン濃度は、０．３ｇ／Ｌであった。乾燥細胞重量当たりのグルタチオン重量は、３０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量であった。一方、γ−グルタミルシステイン生成が、少し増加した。
ＹＡＯ３０８３を、本実施例において利用した。そのバッチ培養における結果を、図６に示す。４０時間のバッチ培養の後、乾燥細胞重量当たりのグルタチオン生成および細胞溶液の体積当たりのグルタチオン濃度の両方を、定常期において得た。１Ｌ当たりの乾燥細胞重量は、約１５ｇであった。グルタチオン濃度は、０．３ｇ／Ｌであった。乾燥細胞重量当たりのグルタチオン重量は、３０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量であった。一方、γ−グルタミルシステイン生成が、少し増加した。
流加培養の結果を、図７に示す。システインおよびグリシンを、培養培地に添加した。細胞密度が、６０ｇ／Ｌに達した。この細胞密度は、バッチ醗酵において測定された１５ｇ／Ｌよりもかなり大きく、報告されている２５ｇ／Ｌ（米国特許第４，５８２，８０１号）よりもかなり大きい。１５ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量という乾燥細胞重量当たりのグルタチオン重量は、バッチ醗酵における３０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量よりも小さかったが、全グルタチオン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬに達した。この濃度は、バッチ醗酵における０．３ｇ／Ｌよりもかなり大きかった。
別の局面において、γ−グルタミルシステインもまた、流加培養において生成された。上記細胞中の量は、１０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量であった。培地中の量は、０．５ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量であった。グルタチオンの生成およびγ−グルタミルシステインの生成の両方が、改善された。これによって、上記アミノ酸を連続添加すると、グルタチオン生成およびγ−グルタミルシステイン生成ならびに酵母細胞密度を改善することが、確認された。
（摘要）
本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２株またはＹＡＯ３０８３株の生物学的に純粋な培養物を提供する。この培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有する。この培養物を含む組成物もまた、提供される。グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスもまた、提供される。
本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２株またはＹＡＯ３０８３株の生物学的に純粋な培養物を提供する。この培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有する。この培養物を含む組成物もまた、提供される。グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスもまた、提供される。
本発明の実施形態が例示され記載されているが、種々の改変および改良が、当業者によってなされ得る。本発明は、例示されている特定の形態には限定されないことが、意図される。本発明の趣旨および範囲から逸脱しない改変すべてが、添付の特許請求の範囲において規定される範囲内にあることが、意図される。
Claims (18)
- Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２株またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ３０８３株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有し、該ＹＡＯ２０３２株は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ １７７８９として受託されており、該ＹＡＯ３０８３は、ドイツ連邦共和国のＤ３８１２４、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク１ｂにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）に受託番号ＤＳＭ １７７９０として受託されている、培養物。
- 請求項１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ３０８３株である、培養物。
- 請求項１に記載の培養物であって、前記株は、ＹＡＯ２０３２株である、培養物。
- 請求項１に記載の培養物を含む、薬学的組成物または食品組成物。
- グルタチオンおよび／またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスであって、該プロセスは、請求項１に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物を培養する工程によって特徴付けられる、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ３０８３である、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＡＯ２０３２である、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、培養培地が、アミノ酸を含む、プロセス。
- 請求項８に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システイン、グリシン、およびグルタミン酸からなる群より選択される、プロセス。
- 請求項９に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システインである、プロセス。
- 請求項８に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、０．１％〜０．７５％の範囲の濃度を有する、プロセス。
- 請求項８に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、醗酵開始から１５時間目〜４８時間目に前記培養培地に添加される、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記培養は、バッチ培養または流加培養である、プロセス。
- 請求項１３に記載のプロセスであって、前記培養は、流加培養である、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記微生物は、２０℃〜４０℃の範囲にある温度にて培養される、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記微生物は、３〜７の範囲にあるｐＨ値にて培養される、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、前記微生物は、好気性条件下で培養される、プロセス。
- 請求項５に記載のプロセスであって、グルタチオンおよび／またはγ−グルタミルシステインを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、プロセス。
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