CN101024818B - 用于高产谷胱甘肽与其前体的酿酒酵母菌株及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YA02032或YA03083的生物纯培养物，所述培养物具有能够产生谷胱甘肽及其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的特征性质。也提供一种包含所述培养物的组合物和一种产生谷胱甘肽和/或其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的方法。

Description

用于高产谷胱甘肽与其前体的酿酒酵母菌株及其使用方法

技术领域

本发明涉及用于高产谷胱甘肽与谷氨酰半胱氨酸的酿酒酵母菌株和方法。 

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是包含L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的小肽，并且是一种天然抗氧化剂。其首先于1888年分离得到，并且于1921年正式命名。谷胱甘肽广泛存在于包括动物、植物和微生物的生物体内。许多文献(Tateishi N.等人，1974.J.B.75：93-103；Issels R.等人，1988.Biochem Pharmacol.37：881-888；及Meister，A.等人，1983.Ann.Rev.Biochem.52：711-60)证明其在动物细胞内的代谢和生理功能及其高产方法。谷胱甘肽已经用于肝脏保护剂、毒素清除剂和眼药水中。其也是功能性健康食品中的一个有前途的成分。 

产生谷胱甘肽的工业方法包括化学合成、提取、酶产生和发酵，其中优选发酵，因为其易于操作。此外，通过使用酵母发酵产生的谷胱甘肽在用于食品时比通过使用其它微生物发酵方法产生的相同化合物更安全，所述的其它微生物例如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。正因为这个原因，因此酵母被广泛用于制备用于功能性饮料和健康食品的谷胱甘肽。也已经报导(JP60248199)通过诱变剂产生的酵母突变体可以改善谷胱甘肽的产生，所述诱变剂例如酰胺和吲哚酚类。 

产物γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)是合成方法中谷胱甘肽的前体。据报导γ-谷氨酰半胱氨酸有效降低CCl₄对小鼠肝脏的损害。所述产物与谷胱甘肽具有相似的功能，并且当其与谷胱甘肽合成酶共存时，可以调节细胞中谷胱甘肽的含量。此外，γ-谷氨酰半胱氨酸是人奶中的一种重要内容物，并且可以增强受检者的免疫发生能力。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供微生物菌株的生物纯培养物，所述微生物菌株包含选自由YA02032和YA03083组成群组的酿酒酵母菌株的所有特征。所述培养物具有能够产生谷胱甘肽及其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的特征性质。 

本发明的另一个目的在于提供包含根据本发明的培养物的组合物。 

本发明的又一个目的在于提供产生谷胱甘肽和/或其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的方 法，其特征在于培养本发明的生物纯培养物。 

附图说明

图1从野生型酿酒酵母1-12(CCRC21727)获得谷胱甘肽高产菌株的系谱。N：叠氮化钠。T：1，2，4-三唑。M：甲基乙二醛。B：苄基氯。 

图2不同世代下产生谷胱甘肽的突变体的稳定性测试结果。 

图3YA02032培养时添加不同氨基酸对胞内含硫化合物的影响的对比。空心柱：开始时添加。实心柱：15h时添加。 

图4添加单一氨基酸对产生谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的影响。 

图5谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的影响。 

图65L发酵罐中谷胱甘肽分批发酵的结果。(Ο)：OD₆₆₀。(●)：谷胱甘肽浓度(mg/ml)。(◆)：胞内谷胱甘肽含量(mg/g干细胞重量)。( 

)：葡萄糖浓度(％)。 

图75L发酵罐中谷胱甘肽补料分批发酵的结果。(●)：谷胱甘肽浓度(mg/ml)。(■)：胞内谷胱甘肽含量(mg/g干细胞重量)。 

具体实施方式

酵母能够产生谷胱甘肽。本发明提供能够高产谷胱甘肽及其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的新颖并且稳定的酿酒酵母菌株。本发明也说明产生谷胱甘肽和/或其前体的方法。 

本发明提供微生物菌株的生物纯培养物，所述微生物菌株包含选自由YA02032和YA03083组成群组的酿酒酵母菌株的所有特征，所述培养物具有能够产生谷胱甘肽及其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的特征性质。 

YA02032和YA03083都是源于保藏在食品工业发展研究所(Food Industry Researchand Development Institute，FIRDI)，Hsinchu，Taiwan，R.O.C．的酿酒酵母1-12，其登录号为CCRC21727。根据本发明，在检验中菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)产生5至8mg/g谷胱甘肽干细胞。用30至300μg/mL N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)使酿酒酵母1-12(CCRC21727)发生突变15至20min，并且所获得的经突变菌株经含有氧化剂和/或毒素(例如叠氮化钠(NaN₃)，1，2，4-三唑和甲基乙二醛)的筛选培养基筛选。当用具有高浓度氧化剂的筛选培养基培养经突变的菌株时，可以逐世代筛选出具有高产谷胱甘肽和/或其前体能力的菌株。根据本发明，三个世代的突变发生和筛选后获得YA02032菌株，其稳定地产生25至26mg/g干细胞重量的谷胱甘肽。通过突变YA02032并且筛选经突变的菌株，进一步获得YA03083，其稳定地产生32至34mg/g干细胞重量的谷胱甘肽。来自YA03083的谷胱甘肽产量比野生型菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)的产量高四倍。 

根据本发明的菌株是极为稳定的，并且甚至在若干继代和长期存储之后还可以保持高产量产生谷胱甘肽及其前体的能力。在本发明的检验中，YA02032和YA03083保持遗传稳定性，并且甚至在30世代后还可以高产量产生谷胱甘肽及其前体。此外，甚至存储3年之后，YA02032和YA03083也具有高产谷胱甘肽及其前体的活性。根据本发明的菌株同样也可以用于工业发酵。 

YA02032和YA03083的形态学特征与野生型菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)相似。普通用于培养酵母的培养基也适于培养YA02032和YA03083。在本发明的一个实施例中，用于培养本发明菌株的培养基是含有3g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、5g/L蛋白胨和10g/L右旋糖的YA培养基(pH5.1)。在本发明的一个实施例中，YA02032和YA03083在需氧条件下20至40℃下培养。 

本发明也提供包含本发明培养物的组合物。 

酿酒酵母已经被人类消费了数千年，并且其被认为是一种可被人类安全消费的微生物。本发明组合物包含根据本发明的微生物菌株的生物纯培养物。根据本发明的组合物优选是医药组合物或食物组合物。在本发明一个优选实施例中，所述组合物是功能性饮料或健康食品。 

本发明进一步提供产生谷胱甘肽及其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的方法，其特征在于在一种合适培养基中培养本发明微生物的生物纯培养物。 

优选地，培养基包含氨基酸。谷胱甘肽包含L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸。因此，向培养基中添加氨基酸有益于产生谷胱甘肽及其前体。优选地，氨基酸选自由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的群组。氨基酸最优选为半胱氨酸。添加甘氨酸或半胱氨酸有益于产生γ-谷氨酰半胱氨酸。此外，添加半胱氨酸也有益于产生谷胱甘肽。将半胱氨酸和甘氨酸组合有益于产生谷胱甘肽，并且几乎所有的γ-谷氨酰半胱氨酸都转化成谷胱甘肽。将半胱氨酸和谷氨酸组合有益于产生谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸。氨基酸优选浓度为0.1％至0.75％。 

添加氨基酸的时间选择不同程度影响产量。优选地，氨基酸从开始发酵后15至48小时添加至培养基中。 

可以用所属领域的技术人员所熟知的方式进行发酵。培养优选为分批培养或补料分批培养。所述培养更优选为补料分批培养。分批培养中谷胱甘肽产量和干细胞重量均令人满意。此外，补料分批培养所获得的谷胱甘肽产量和干细胞重量比分批培养所获得的好。 

根据本发明的方法的温度与使用酵母的普通发酵相似。优选地，微生物在20至40℃ 温度范围内培养。最优选地，微生物在30℃下培养。 

根据本发明的培养的pH值是酸性至中性。优选地，微生物在3至7的pH值范围内培养。更优选地，微生物在pH值为7下培养。 

谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸存在于微生物中或培养基中。根据本发明的方法进一步包含一个从液体培养基中回收谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸的步骤。可以用所属领域的技术人员所熟知的方式进行回收。 

所给出的以下实例仅为说明的目的，并且并不倾向于限制本发明的范畴。 

菌株：实例中所使用的菌株是酿酒酵母1-12(CCRC21727)及其突变体。 

振摇烧瓶培养：将存储于甘油中的CCRC21727涂于琼脂板上，并且在30℃下培养两天。然后将新鲜的单菌落接种至4.75mL YM培养基(3g/L酵母提取物、3g/L麦芽提取物、5g/L蛋白胨、10g/L右旋糖、pH5.1)中，并且以150rpm的摇动速度培养24小时。5％的培养物另外接种至筛选培养基(60g/L葡萄糖、30g/L蛋白胨、30g/L酵母提取物、pH 5.1)中，并且以相同条件培养24至48小时。 

发酵罐培养：将一个新鲜单菌落接种至50mL YM培养基中。培养24小时后，在相同条件下将3至5％的培养物接种至100mL活性培养基(60g/L葡萄糖、12g/L蛋白胨、12g/L酵母提取物、1g/L MgSO₄·7H₂O、pH5.1)中。5％的培养物另外接种至含有主培养基(55g/L葡萄糖、8.3g/L糖蜜、7g/L玉米浆、4g/L(NH₄)₂SO₄、6g/L KH₂PO₄、2.9g/L(NH₄)H₂PO₄、1.5g/L MgSO₄·7H₂O、pH5.1)的5L发酵罐中。普通发酵程序是30℃温度，500rpm摇动速度和1L/min通风。 

突变发生：用无菌磷酸盐缓冲液清洗在30℃新鲜培养3小时的培养物两次并接着添加30至300μg/mL NTG。混合细胞和NTG并且保持15min。将经两次磷酸盐缓冲液清洗的细胞涂于含有1，2，4-三唑、NaN₃、苄基氯和甲基乙二醛的筛选板上。30℃下培养板3至7天，用以筛选突变的菌株。 

用于估计谷胱甘肽的颜色反应：离心1mL培养物以收集细胞沉淀。以和0.1N乙酸相同的体积添加沉淀用以酸提取。将所提取的细胞在水中煮沸10min后放置于冰上。另外进行离心以获得上清液。向上清液中添加3mL反应溶液(0.6mM 5，5’-二硫双-2-硝基苯甲酸、DTNB、0.1M磷酸盐缓冲液、pH7)并充分混合。反应10min后，检验溶液的OD₄₁₂ 吸收率以估计其硫含量。 

高效液相色谱法(HPLC)用以分析谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸：上述酸提取溶液经HPLC检验。0.5mL 上清液中添加0.1mL 40mM碘乙酸和0.2mL 1M NaHCO₃。黑暗中反应混合物1小时，然后添加作为着色剂的0.5mL 1.5％1-氟-2，4-二硝基-苯(FDNB) 并且反应过夜。然后12,000rpm下离心反应溶液5min并且过滤。HPLC的条件列举如下(Schofield，J.D.和X.Chen.1995.J.Cereal Science.21：127-136)： 

流动相：缓冲液A：80％甲醇；缓冲液B：200mL乙酸钠溶液(122mL水中的272g三水合乙酸钠和378mL冰乙酸)和800mL缓冲液A 

色谱柱：Lichrosorb^TM NH₂柱 

流速：1mL/min 

检测器：365nm下UV检测器 

实例1：菌株突变发生和筛选

酿酒酵母1-12(CCRC21727)经历NTG突变发生，并且通过氧化剂和/或毒素(1，2，4-三唑、NaN₃、苄基氯和甲基乙二醛)对突变体进行筛选。所利用的NTG和氧化剂和/或毒素的量越多，所获得的谷胱甘肽的产量越高。野生型菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)的谷胱甘肽产量为5至8mg/g干细胞。四世代突变发生和筛选之后，从约8,000突变体获得具有25至26mg/g干细胞的谷胱甘肽产量的YA02032和具有34mg/g干细胞的谷胱甘肽产量的YA03083。可见本发明菌株的谷胱甘肽产量约高四倍。图1显示所述方法和系谱。 

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YA02032和YA03083于2005年12月12日保藏在德国不伦瑞克市马舍罗德路1b(Mascheroder Weg 1b，D38124，Braunschweig，Germany)的德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，其登录号分别是DSM 17789和DSM 17790。 

实例2：稳定性

野生型菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)及YA02032和YA01176连续继代30世代，并且估计其产量。 

结果显示在图2中。如图所示，本发明的菌株具有良好的稳定性。 

野生型菌株酿酒酵母1-12(CCRC21727)及YA02032和YA03083分别经历长期存储检验。结果说明于表1中。谷胱甘肽产量、干细胞重量和4℃存储3年的冻干细胞存活率与新鲜细胞相似，而无显著改变。同样，存储稳定性也令人满意。 

表1： 

实例3：培养基修改

为了改善谷胱甘肽的产生，在开始发酵时或者在YA02032培养15小时后，向培养基中添加L-半胱氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、酪蛋白氨基酸和蛋白胨。图3显示412 nm下吸收率的结果。结果显示当在开始时添加氨基酸时，胞内硫含量稍许有所改善。然而，硫含量极大地提高。应该注意添加半胱氨酸的效果最好。 

进一步利用HPLC分析谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的分布。结果显示于图4中。发现添加甘氨酸抑制谷胱甘肽的产生，而添加半胱氨酸则引起γ-谷氨酰半胱氨酸的积累而不增加谷胱甘肽。单独添加谷氨酸既不诱导γ-谷氨酰半胱氨酸也不诱导谷胱甘肽的产生。 

因为半胱氨酸改善γ-谷氨酰半胱氨酸的积累，所以也检验半胱氨酸和其它氨基酸的组合，并且结果在图5中加以说明。可见，将半胱氨酸和甘氨酸组合有益于产生谷胱甘肽，并且几乎所有的γ-谷氨酰半胱氨酸都转化成谷胱甘肽。将半胱氨酸和谷氨酸组合有益于产生谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸。 

实例4：在5升发酵罐中培养

本实例中利用YA03083。分批培养的结果显示于图6中。分批培养后40小时，每干细胞重量的谷胱甘肽产生和每细胞溶液体积的谷胱甘肽浓度都达到满意的阶段。每升干细胞重量约为15g；谷胱甘肽浓度为0.3g/L；每干细胞重量的谷胱甘肽重量为30mg/g干细胞重量；另一方面，γ-谷氨酰半胱氨酸的产生稍许有所提高。 

补料分批培养的结果显示于图7中。向培养基中添加半胱氨酸和甘氨酸。细胞密度达到60g/L，其比分批发酵中所测量的15g/L和所报导的25g/L(美国专利第4,582,801号)高很多。尽管15mg/g干细胞重量的每干细胞重量的谷胱甘肽重量低于分批发酵中的30mg/g干细胞重量，但总谷胱甘肽浓度达到1.0mg/mL，其比分批发酵的0.3g/L高很多。 

另一方面，补料分批培养中也产生γ-谷氨酰半胱氨酸。细胞中的含量为10mg/g干细胞重量，并且培养基中的含量为0.5mg/g干细胞重量。谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的产生都得到了改善。证实连续添加氨基酸改善谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的产生以及酵母细胞密度。 

虽然已经说明并且描述了本发明的实施例，但是所属领域的技术人员仍然可以进行多种修改和改善。希望本发明并不限制于所说明的特殊形式，并且所有不悖离本发明精神与范畴的修改在如附加权利要求书所定义的范畴内。 

Claims (19)

1.一种经纯化的微生物菌株，其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YA02032或YA03083菌株；其中YA02032保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D38124，Braunschweig，Germany，登录号为DSM 17789；且YA03083保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D38124，Braunschweig，Germany，登录号为DSM 17790。

2.根据权利要求1所述的经纯化的微生物菌株，其中所述菌株是YA03083。

3.根据权利要求1所述的经纯化的微生物菌株，其中所述菌株是YA02032。

4.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的经纯化的微生物菌株。

5.根据权利要求4所述的组合物，其是医药组合物或食物组合物。

6.一种产生谷胱甘肽和/或其前体γ-谷氨酰半胱氨酸的方法，其特征在于在培养基中培养根据权利要求1所述的经纯化的微生物菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述微生物是酿酒酵母YA03083。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述微生物是酿酒酵母YA02032。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养基包含氨基酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基酸是选自由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的群组。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述氨基酸是半胱氨酸。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基酸具有0.1％至0.75％范围内的浓度。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基酸在开始发酵后15至48小时添加至所述培养基中。

14.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养是分批培养。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养是补料分批培养。

16.根据权利要求6所述的方法，其中所述微生物在20至40℃范围内的温度下培养。

17.根据权利要求6所述的方法，其中所述微生物在3至7范围内的pH值下培养。

18.根据权利要求6所述的方法，其中所述微生物在需氧条件下培养。

19.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含从所述培养基中回收谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸的步骤。

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