CN102137922B - 从硒代羟酸化合物开始富集了硒的光合微生物,其在营养学、美容学和药学中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使光合微生物从硒代羟酸化合物,尤其是以D或L形式的2-羟基-4-甲基硒代丁酸,这些化合物的对映异构体、盐、酯衍生物或酰胺衍生物开始富集有机硒;以及经历如此富集过程的微生物在动物或人的营养学中、在美容学中或在药学中的用途。

Description

从硒代羟酸化合物开始富集了硒的光合微生物,其在营养学、美容学和药学中的应用
本发明涉及使光合微生物富集有机硒,尤其是通过使用硒代羟酸类型的化合物,和更具体而言,通过使用以(D,L)形式的2-羟基-4-甲基硒代丁酸,或该化合物的对映异构体、盐、酯衍生物或酰胺衍生物;以及经历如此富集过程的光合微生物在动物或人的营养学中、在美容学中或在药学中的用途。
硒是必需的微量营养物,尤其对于人和哺乳动物来说(Wendel,A.;Phosphorus,Sulfur Silicon Relat Elem.,1992,67,1-4,405-415)。特别地,它以L(+)-硒代半胱氨酸或L(+)-硒代甲硫氨酸的形式(Muller,S.等人,Arch.Microbiol.,1997,168,421)参与含硒蛋白质例如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶和硒蛋白P的生物合成。
在人中,硒缺乏已有报道,尤其是处于在长的时间段期间经受通过肠胃外途径进行进食的患者的情况下(Von Stockhausen,H.B.,Biol.Trace Elem.Res.,1988,15:147-155)。每日补充200μg硒被认对于具有平均体重的成年人来说是安全的和适当的(Schrauzer,G.N.,J.Am.Col.Nutr.,2001,20:1-14)。
硒在自然界中以两种形式存在:有机的和无机的。
无机化合物最经常地为盐,例如亚硒酸钠和硒酸钠。这些化合物对于人和大多数动物是非常有毒的。
有机化合物(有机硒化合物)在活生物体中尤其由L(+)-硒代甲硫氨酸、L(+)-甲基硒代半胱氨酸和L(+)-硒代半胱氨酸这些氨基酸来代表。
在人和动物中,L(+)-硒代甲硫氨酸是有机硒的主要来源。然而,人和动物对于该氨基酸来说是营养缺陷的,其仅可以通过膳食来获得。
因此,理想地,应当以该有机形式将硒掺入到旨在治疗或预防缺硒的食品补充剂中。
因此,已可以证明,给膳食补充以L(+)-硒代甲硫氨酸比以亚硒酸钠形式进行摄取具有小得多的毒性并且呈现出更好的生物利用率(Mony,M.C.等人,J.of Trace Elem.Exp.Med.,2000,13:367-380)。
目前,除了将无机硒(主要以亚硒酸钠的形式)和硒代甲硫氨酸用作底物的那些代谢途径之外,还不知道活生物体捕集硒的其他代谢途径。
在高等植物(尤其是小麦、玉米、大豆)中可以发现有机硒的合适供应,其中大于80%的硒由L(+)-硒代甲硫氨酸构成(Schrauzer,G.N.,J.Am.Coll.Nutrit.,2001,20(1):1-4)。然而,这些植物的硒浓度不足以能够容易地且以较少的花费制成食品添加剂。
为了获得富含硒代甲硫氨酸的组合物而探索的方法之一在于使某些微生物从无机硒开始富集有机硒。一但经历富集,这些微生物就可以充当原料以用于制备食物产品或美容学产品。
许多出版物描述了,例如,制备富集了硒的酵母,更特别地酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Oh Tae-Kwang等人,1995年6月26日的专利KR950006950),以便就这样使用它们或者将它们掺入到食品组合物中(Moesgaard S.等人,2003年9月16日的专利DK200200408);或者获得富集了硒的衍生产品,例如富集了硒的面包(Wang Boaquan,2006年8月16日的专利CN 1817143)、乳(Jeng Chang-Yi,2003年12月11日的专利TW565432)、蛋(Cui Li等人,2007年3月7日的专利CN1302723C)、巧克力(In GyeongSuk等人,2004年11月8日的专利KR20040101145)或啤酒(Jakovleva L.G.等人,2003年7月27日的专利RU2209237)。在健康食品领域中,包含富集了硒的酵母的制剂也被推荐用于孕妇(Wang Weiyi,2006年5月31日的专利CN1778199),或者用于改善低血糖患者的肠微环境(Li Tao Zhao,2006年8月2日的专利CN1810161)。在皮肤美容领域中,已开发出了包含富集了硒的酵母的组合物,以便减少脱发(Kasik Heinz,2000年6月21日的专利DE19858670)或预防光老化(Kawai Norihisa等人,1995年11月14日的专利JP07300409)。已将包含富集了硒的酵母的药物制剂用于预防和治疗炎性病理学状况例如与糖尿病有关的视网膜病变(Crary Ely J.,1997年6月17日的专利US5639482),或心血管病理学状况(Nagy P.L.等人,1992年9月28日的专利HUT060436)。
细菌,更特别地益生菌,它们也成为硒富集的目标(Calomme M.等人,Biol.Trace Elem.Res.,1995,47,379-383)。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),还有路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、Lactobacillusferintoshensis、布氏/类布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri/parabuchneri),已被描述为富集了硒的食品补充剂(Andreoni V.等人,专利US0258964)。已制备了由酵母和乳杆菌构成的益生菌混合物,以便加强免疫系统和对疾病的抵抗力(Huang Kehe Qin,2006年11月8日的专利CN1283171C)。
然而,在所有这些制剂中,仅从无机硒开始来制备富集了硒的微生物。因此,最经常使用的硒来源由溶解在微生物培养基中的亚硒酸钠或硒酸钠组成。经历如此富集过程的微生物,尽管已经合成了令人满意的量的可被人生物体同化的有机硒,但经常具有高的未转化的无机硒的残留水平,这经证实对于消费者可以是危险的。
在以WO 2006/008190公布的先前的一个专利申请中,一种硒代羟酸类型的新型有机化合物被描述为可以充当前体以用于在人和动物中合成L(+)-硒代甲硫氨酸。
令人惊讶地,申请人观察到,可以将硒代羟酸类型的有机化合物,例如在申请WO 2006/008190中描述的那些,掺入到培养基中,以便使各种不同的光合微生物富集有机硒。所获得的结果揭示,这些化合物使得此类微生物能够非常有效地富集,尤其是L(+)-硒代甲硫氨酸,其中产率等于甚至高于借助于通常使用的无机化合物而获得的产率。
因此看来,光合微生物从硒代羟酸类型的有机化合物开始富集有机硒使得能够产生没有无机硒的有机硒,并因此解决了与现有技术的方法相关的毒性问题。
在预防或治疗缺硒的背景下,可以在食品商业中直接使用经历如此富集过程的光合微生物,尤其是以便生产药学、营养学或美容学产品和组合物。
发明详述
本申请旨在获得光合微生物,即其生长依赖于光能源的微生物。
“微生物”意指属于下列界之一的任何单细胞活生物:原核生物(monères)、原生生物(protistes)、真菌(mycètes)或原生动物(protozoaires),其呈现出显微或超显微大小的真核或原核细胞结构,具有代谢和繁殖的潜力。所述单细胞生物可以牵涉丝状体或生物膜的形成。
优选地,根据本发明的光合微生物为真核显微藻类,更优选地小球藻属(Chlorella)的绿藻;或者原核显微藻类,例如蓝细菌,优选地螺旋藻属(Spirulina)或节旋藻属(Arthrospira)的蓝细菌(螺旋藻)。本领域技术人员熟知后者用作食品补充剂,尤其在发展中国家中。
“有机硒”意指所有这样的分子,其包含至少一种能够由活生物体产生的、在其化学结构中具有至少一个硒原子的化合物,例如尤其是硒代甲硫氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代半胱氨酸这些氨基酸,包含它们的肽或蛋白质。
如此富集了硒的光合微生物可以就这样进行使用,或者作为食品添加剂进行使用。可以将它们例如进行脱水以形成稳定的粉末,其可以掺入到充当用于制备转化产品的基质的组合物中,但也可以将它们在食物产品的转化过程中作为益生菌活地进行使用,以便获得例如发酵的乳或饮料。
因此,本发明的目标在于使光合微生物富集硒代甲硫氨酸和/或硒代半胱氨酸的新方法,其特征在于,在包含硒代羟酸类型的化合物的培养基中培养所述光合微生物。
优选地,所述硒代羟酸类型的化合物是通式(I)的化合物,其前体、盐或者酯衍生物或酰胺衍生物:
Figure BPA00001350442300041
其中:
n等于0、1或2;
R1为OH、OCOR3、OPO3H2、OPO3R4R5或OR6基团;
R2为OH、R3、NHR7、S-半胱氨酸基或S-谷胱甘肽基基团;
应当理解,当n=1并且R2为OH时,那么R1不可以为OH;
R3为烷氧基、神经酰胺1、神经酰胺2、神经酰胺3、神经酰胺4、神经酰胺5、神经酰胺6a和6b、S-半胱氨酸基、S-谷胱甘肽基基团,或选自下列的基团:
Figure BPA00001350442300051
优选地,R3为烷氧基、S-半胱氨酸基、S-谷胱甘肽基基团;
OR4为(C1-C26)烷氧基、神经酰胺1、神经酰胺2、神经酰胺3、神经酰胺4、神经酰胺5、神经酰胺6a和6b基团,或选自下列的基团:
优选地,OR4为(C1-C26)烷氧基基团;
OR5为(C1-C26)烷氧基、神经酰胺1、神经酰胺2、神经酰胺3、神经酰胺4、神经酰胺5、神经酰胺6a和6b基团,或选自下列基团的基团:
Figure BPA00001350442300061
优选地,OR5为(C1-C26)烷氧基基团;
OR6为丙酮酸酯、乳酸酯、柠檬酸酯、富马酸酯、马来酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、棕榈油酸酯、油酸酯、亚油酸酯、天然脂肪酸或13-顺视黄酸酯基团;
R7为H基团、(C1-C26)烷基基团、天然氨基酸或天然胺。
在上面的式(I)中:
-“烷基”意指线性或环状的包含1至26个碳原子的基团,其任选地是支化的,任选地是氟化或多氟化的,和任选地包含一个或多个碳-碳双键,例如甲基、乙基、异丙基、三氟甲基、亚油基、亚麻基、棕榈基;
-“烷氧基”意指线性或环状的、包含1至26个碳原子的、衍生自伯醇、仲醇或叔醇的基团,其任选地是支化的,任选地是氟化或多氟化的,和任选地包含一个或多个碳-碳双键,例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、亚油氧基、亚麻氧基、棕榈氧基;
-神经酰胺类型的基团的结构尤其描述在“Cosmetic Lipids and the SkinBarrier”,Thomas
Figure BPA00001350442300071
(编辑)2002,Marcel Dekker,Inc.,第2页,图2中;
-“天然的”意指在植物、动物世界的生物的代谢中以及在人的代谢中发现的任何相应的化合物(Steglich W.,
Figure BPA00001350442300072
Encyclopedia Natural Products,G.Thieme(编辑));
-“寡聚物”意指由具有2至15个通过酯类型的键彼此相连的单体的链串构成的任何化合物;
-“聚合物”意指由具有多于15个通过酯类型的键彼此相连的单体的链串构成的任何化合物。
根据本发明,所述式(I)的化合物优选地以钙盐、锌盐或镁盐的形式进行使用,这通常使得能够获得更好的在培养基中的溶解度,以及被所述光合微生物更好地同化。
在本发明的一个优选的实施方案中,所述光合微生物选自蓝藻和绿藻。因此,有利地,所述光合微生物选自自蓝藻或绿藻,优选地选自小球藻属的绿藻以及螺旋藻属或节旋藻属的蓝藻。
更特别地,本发明旨在使用选自(或取自)下列的式(I)的化合物:
-L-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
-D-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
-DL-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
或这些化合物的盐。
这些化合物描述在申请WO 2006/008190中。
本发明的目标还在于可根据本发明的方法来获得的富集了有机硒的光合微生物。这样的微生物通常具有大于500ppm,优选地大于1000ppm,更优选地大于2000ppm的有机硒含量,以硒当量计;和小于0.5%,优选地小于0.2%,和更优选地小于0.1%的无机硒含量,以所述微生物的干重计。优选地,本发明涉及其中所述光合微生物包含,相对于总硒而言,小于1.5质量%,优选地小于0.5质量%,更优选地小于0.1质量%的无机硒的情况。
换而言之,在根据本发明的方法经历了富集过程的光合微生物中存在的以无机形式的硒的残留物通常占存在于所述微生物中的总硒的小于1.5%,这通常代表了所述微生物的总干生物量(干重)的小于0.5%。
十分特别地,本发明旨在富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述微生物的以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量为,相对于存在于所述光合微生物中的总硒而言,大于50质量%,优选地大于70质量%,更优选地大于80质量%,和更加优选地大于90质量%的硒。这样的硒代甲硫氨酸的比例代表了,在存在于所述微生物中的有机硒的数量和品质方面,相对于在现有技术中所获得的那种而言重大和特别有利的改善。
特别地,本发明旨在这样的情况,其中所述微生物的特征在于,它为富集了硒的绿藻这样的显微藻类,优选地小球藻属的绿藻;并且所述微生物所包含的硒代甲硫氨酸含量为通常大于50微克硒当量/克(μgSe/g),优选地大于70μgSe/g,和更优选地大于100μgSe/g,以所述微生物的干重计。
将以有机分子(硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸或其他)或无机分子(硒盐)的形式固定在微生物内的硒的量表示为“硒的质量/克微生物干重”(μgSe/g)。换而言之,通过计算相对于微生物的总干生物量而言的存在于这些有机或无机分子中的硒的质量来确定所述光合微生物的硒含量。此外,还确定以有机和无机形式存在的硒的质量比例,并且表示为以相对于总硒质量而言的百分比。
可以在离心和冻干微生物后,分别通过矿化和酶促消化来测定根据本发明的光合微生物的总硒的含量和以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量,例如依照在Mester,Z.等人,(2006)Annal.Bioanal.Chem.385:168-180中所描述的根据Lobinsky等人的方法。
在本申请的实施例中所举例说明的根据本发明获得的结果显示,所述光合微生物,更特别地绿藻和蓝藻这样的显微藻类,以硒代甲硫氨酸形式积累硒,以通常大于100微克硒当量/克(μgSe/g),优选地大于200μgSe/g,更优选地大于500μgSe/g,更加优选地大于1000μgSe/g干重,和甚至大于1400μgSe/g这些显微藻类的干重的含量。
因此,更特别地,本发明旨在富集了有机硒的绿藻或蓝藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为通常大于100μgSe/g干重,优选地大于200μgSe/g干重,更优选地大于500μgSe/g干重,和更加优选地大于1000μgSe/g干重。
通常,这样的富集了有机硒的绿藻或蓝藻的特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的总硒的大于50%,优选地大于70%,更优选地大于80%,更加优选地大于90%,甚至大于95%,并且它的无机硒的残留含量为其所包含的总硒的通常小于1.5%,优选地小于0.5%,更优选地小于0.1%。通常,它的无机硒的残留含量为以干重计的所述绿藻的总生物量的小于1%,优选地小于0.5%,更优选地小于0.2%,和更加优选地小于0.1%。
此外,本发明还旨在从所述依照本发明的方法富集了硒的光合微生物开始来制备食物产品、美容学产品或药学产品。该制备利用本领域技术人员已知的技术。
根据本发明的光合微生物还可以在动物营养中是有用的,尤其是为了获得富集了有机硒的次级衍生物,例如鱼、乳或蛋。
如此获得的衍生分子或产品在各种不同应用中是有用的,其中包括在序言中提及的那些,尤其是作为美容学、药学或营养学试剂。
本发明的目标还在于,根据本发明的富集了硒的光合微生物作为美容学、药学(或治疗性)或营养学产品(或试剂)的用途。
本发明还旨在包含所述光合微生物的组合物,通常为美容学、药学或营养学细合物。
本发明还旨在用于光合微生物的培养基,其特征在于,它包含一种或多种上面所定义的式(I)的化合物。这样的培养基对于实施根据本发明的使光合微生物富集硒的方法来说是有用的。
特别地,本发明旨在固体或液体培养基,其包含至少一种式(I)的化合物,优选地2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐,浓度为0.5至2000mg/L,优选地1至1000mg/L,更优选地2至500mg/L,即分别地大约0.2至800mg/L的所述化合物(以硒当量计),优选地0.4至400mg/L的所述化合物(以硒当量计),更优选地0.8至200mg/L的所述化合物(以硒当量计)。
对于海洋来源的显微藻类,可以将式(I)的化合物在无菌的经过滤的海水中或在例如从Aquarium Systems Inc.公司的“Reef Crystal”介质制备的合成海水中进行稀释,以形成基本培养基。
根据本发明的显微藻类的制备方法尤其可以包括一个或多个下述步骤:
-制备培养基,优选地基本培养基,其包含对于显微藻类的生长来说必需的化学元素;
-在该培养基中引入式(I)的化合物,优选地2-羟基-4-甲基硒代丁酸,以作为硒的有机来源;
-将混合物的pH调节至在6和10之间的值;
-在12至45℃的温度下,在100至500rpm的轨道式摇动下,和在可以包含0至20%的氧和0.3至20%的二氧化碳的气氛中,在如此构成的混合物中培养所述显微藻类的预培养的接种物,优选地进行24至120小时;
-在4000和10000rpm之间离心该混合物数分钟,或在0.2微米的滤器上过滤该混合物并在该滤器上用生理水进行漂洗;
-将细胞粒状沉淀接纳在生理水中;
-在4000和10000rpm之间再次离心数分钟;
-回收湿的细胞粒状沉淀,其中存在有富集了硒的显微藻类。
可以将该湿的细胞粒状沉淀进行冻干或风干。
本发明的其他特征和优点在下面的实施例中给出。下面的实施例仅作为举例说明而提供,但无论如何不应认为限制了本发明的范围。
实施例
实施例1:在自养下在包含2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177)的培养基中生产富集了硒的普通小球藻(Chlorella vulgaris)这种显微藻类
实验条件
在光自养下所使用的藻株为普通小球藻SAG211-11B:来源于格廷根大学的SAG保藏的无污染的藻株(SAG:Sammlung von Algenkulturen der
Figure BPA00001350442300101
Figure BPA00001350442300102
)。
将该藻株在由[Stanier RY等人,1971 Bacteriol.Rev.35:171-205]所描述的BG-11培养基(Blue-Green培养基)中进行培养,所述BG-11培养基的组成如下(对于1L而言):
(1)NaNO3:1.5g
(2)K2HPO4:0.04g
(3)MgSO4·7H2O:0.075g
(4)CaCl2·2H2O:0.036g
(5)柠檬酸:0.006g
(6)柠檬酸铁铵:0.006g
(7)EDTA-Na2:0.001g
(8)Na2CO3:0.02g
(9)蒸馏水:1.0L
(10)痕量元素溶液:1mL/L
H3BO3:2.86g
MnCl2·4H2O:1.81g
ZnSO4·7H2O:0.222g
Na2MoO4·2H2:0.39g
CuSO4·5H2O:0.08g
Co(NO3)2·6H2O:0.05g。
将pH调节至7.1,并且将该培养基在121℃下高压灭菌15分钟。
在轨道式摇动(80rpm)下,在25℃和2400+/-200勒克司下,将该藻株在光自养下培养2至7天,ODintit660nm=0.05。藻株的OD660nm在48小时内到达0.5。
培养条件
以下述浓度来施用硒的有机来源,即2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177,Tetrahedron SAS,France,CAS:873660-49-2):0.5mg/L至100mg/L(以硒当量计),即1.25mg/L至250mg/L的2-羟基-4-甲基硒代丁酸。在培养开始时一次性地(即对于100ml的培养物而言,0.125mg至25mg的量)添加,或者以有规律的时间间隔(其持续时间为6至24小时的间隔)多次地添加含硒化合物,其中将该培养物维持2至7天的持续时间。
实施例2:在兼养下(在培养基中存在光和碳水化合物——葡萄糖),在包含2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177)的培养基中(根据本发明的实施例)或者在包含亚硒酸钠的培养基中(比较实施例)生产富集了硒的普通小球藻这种显微藻类
在这些试验中,所使用的藻株为普通小球藻SAG211-11B藻株:来源于格廷根大学的SAG保藏的无污染的藻株(SAG:Sammlung von Algenkulturen der
Figure BPA00001350442300121
),其在下述培养基中在兼养下进行培养:
酵母提取物...............................0.33g
牛肉膏...................................0.33g
胰蛋白
Figure BPA00001350442300122
.................................0.66g
FeSO4....................................0.66mg
葡萄糖...................................3.3g
蒸馏水...................................对于1.0L来说足量。
将pH调节至7.2,并且将该培养基在121℃下高压灭菌15分钟。
以下述浓度来施用硒的有机来源,即2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177,Tetrahedron SAS,France,CAS:873660-49-2):20mg/L(以硒当量计),即50mg/L的2-羟基-4-甲基硒代丁酸。
以下述浓度来施用无机硒的来源(SeNa,亚硒酸钠):20mg/L(以硒当量计),即43.9mg/L的亚硒酸钠。
在该普通小球藻藻株的指数生长期(即接种后3天)中一次性地添加含硒化合物。
用于分析的样品的制备
在接种7天后,将培养基在0.2微米的Nalgene膜(Ref a-PES,直径90mm)上进行过滤,并且用生理水漂洗细胞截留物。将湿的细胞物料进行冻干以分析含硒组分(总硒、硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠)。
普通小球藻的含硒组分的分析
在进行样品的矿化后,通过与质量检测相联用的ICP来测定总硒的量。根据在Mester,Z.等人,(2006)Annal.Bioanal.Chem.385:168-180中由Lobinsky等人所描述的方法,在进行样品的酶促消化后,通过与质量-质量检测相联用的高效液相色谱法来进行硒的种类形成(spéciation)。
结果
下面的表1显示了,对于7天的温育时间来说,以三次重复而获得的以硒当量计的平均值。
表1
普通小球藻这种显微藻类的含硒组分的分析
Figure BPA00001350442300131
所获得的结果显示,对于以THD177或SeNa的形式添加的相同剂量的硒(在此为20mgSe/L)而言:
-如果以THD177的形式进行添加,所检测到的总Se为以SeNa的形式进行添加时的九倍;
-通过添加THD177而获得的以硒代甲硫氨酸形式在细胞内积累的硒的水平为通过以SeNa形式进行添加而获得的那种水平的44倍;
-相比于用SeNa时的20%的水平而言,如果以THD177的形式进行添加,以硒代甲硫氨酸形式在细胞内积累的硒的水平达到细胞内的含硒形式的几乎100%(98.5%);和
-如果添加THD177,检测到在总硒中仅0.4%的Se(IV),而在添加SeNa的情况下,在总硒中检测到2.7%的Se(IV)。
实施例3:在自养下,在包含2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177)的培养基中(根据本发明的实施例)或者在包含亚硒酸钠的培养基中(比较实施例)生产富集了硒的钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)这种显微藻类
在这些试验中,所使用的藻株为于2009年8月4日以编号CNCM I-4218保藏于国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM),Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux 75724Paris Cedex 15)的钝顶节旋藻3054-E0001藻株。
将3054-E0001藻株在下述培养基中在自养下进行培养:
酵母提取物...............................0.33g
牛肉膏...................................0.33g
胰蛋白
Figure BPA00001350442300141
........................................0.66g
FeSO4....................................0.66mg
蒸馏水...................................对于1.0L来说足量。
将pH调节至7.2,并且将该培养基在121℃下高压灭菌15分钟。
以下述浓度来施用硒的有机来源,即2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177,Tetrahedron SAS,France,CAS:873660-49-2):25mg/L(以硒当量计),即62.5mg/L的2-羟基-4-甲基硒代丁酸。
以下述浓度来施用无机硒的来源(SeNa,亚硒酸钠):25mg/L(以硒当量计),即54.4mg/L的亚硒酸钠。
紧在该钝顶节旋藻藻株的接种之后(即T=0),一次性地添加含硒化合物。
用于分析的样品的制备
在接种10天后,将细胞粒状沉淀在0.2微米的Nalgene膜上进行过滤,并且用生理水漂洗细胞截留物。将湿的细胞物料进行冻干以分析含硒组分(总硒、硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠)。
钝顶节旋藻的含硒组分的分析
在进行样品的矿化后,通过与质量检测相联用的ICP来测定总硒的量。根据在Mester,Z.等人,(2006)Annal.Bioanal.Chem.385:168-180中由Lobinsky等人所描述的方法,在进行样品的酶促消化后,通过与质量-质量检测相联用的高效液相色谱法来进行硒的种类形成。
结果
下面的表2显示了,对于10天的温育时间来说,以三次重复而获得的以硒当量计的平均值。
表2
钝顶节旋藻这种显微藻类的含硒组分的分析
Figure BPA00001350442300151
所获得的结果显示,对于以THD177或SeNa的形式添加的相同剂量的硒(在此为25mgSe/L)而言:
-对于以THD177的形式进行添加,所检测到的总Se为以SeNa的形式进行添加时的八倍;
-通过添加THD177而获得的以硒代甲硫氨酸形式在细胞内积累的硒的水平为通过以SeNa形式进行添加而获得的那种水平的108倍;
-相比于用SeNa时的7%的水平而言,如果以THD177的形式进行添加,以硒代甲硫氨酸形式在细胞内积累的硒的水平达到细胞内的含硒形式的98%;和
-如果添加THD177,检测到在总硒中仅1.2%的Se(IV),而在添加SeNa的情况下,在总硒中检测到2.9%的Se(IV)。
实施例4:在包含2-羟基-4-甲基硒代丁酸(THD-177)的培养基中(根据本发明的实施例)生产富集了硒的钝顶节旋藻这种显微藻类
在这些试验中,所使用的藻株为钝顶节旋藻3054-E0001藻株。将下列实验的结果进行比较:
-前一个实施例(实施例3),在其期间,紧在该钝顶节旋藻藻株的接种之后一次性地根据本发明添加含硒化合物THD-177,和
-新的实验,其中在所述钝顶节旋藻藻株的培养的指数期中根据本发明添加含硒化合物THD-177,如在实施例2中那样。
结果
下面的表3显示了,对于10天的温育时间来说,以三次重复而获得的以硒当量计的平均值。
表3
钝顶节旋藻这种显微藻类的含硒组分的分析
Figure BPA00001350442300161
结果显示,相对于“在指数期中添加”这一试验而言,在“在T0时添加”这一试验中,获得了多12%的总硒和多30%的以硒代甲硫氨酸形式的硒。该差异可能是在“在T0时添加”这一试验中比在“在指数期中添加”这另一试验中更长的生物量与THD177的接触时间的结果。
在这两种情况下,Se(IV)的细胞内水平一直是低的,处于总硒的1%。

Claims (38)

1.使光合微生物富集有机硒的方法,其特征在于,在包含通式(I)的硒代羟酸类型的化合物或者所述化合物的前体、盐、酯衍生物或酰胺衍生物的介质中培养所述光合微生物
Figure FSB00001081558500011
2.根据权利要求1的方法,其特征在于,所述式(I)的化合物选自:
-L-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
-D-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
-DL-2-羟基-4-甲基硒代丁酸,
或这些化合物的盐。
3.根据权利要求2的方法,其特征在于,所述式(I)的化合物以钙盐、锌盐或镁盐的形式。
4.根据权利要求1的方法,其特征在于,所述光合微生物选自蓝藻和绿藻。
5.根据权利要求1的方法,其特征在于,所述光合微生物选自小球藻属的绿藻以及螺旋藻属或节旋藻属的蓝藻。
6.富集了有机硒的光合微生物,其可根据权利要求1的方法来获得,其中所述微生物的以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量为,相对于存在于所述光合微生物中的总硒而言,大于50质量%的硒。
7.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其中所述微生物的以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量为,相对于存在于所述光合微生物中的总硒而言,大于70质量%的硒。
8.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其中所述微生物的以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量为,相对于存在于所述光合微生物中的总硒而言,大于80质量%的硒。
9.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其中所述微生物的以硒代甲硫氨酸形式的硒的含量为,相对于存在于所述光合微生物中的总硒而言,大于90质量%的硒。
10.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述光合微生物包含,相对于总硒而言,小于1.5质量%的无机硒。
11.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述光合微生物包含,相对于总硒而言,小于0.5质量%的无机硒。
12.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述光合微生物包含,相对于总硒而言,小于0.1质量%的无机硒。
13.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述微生物包含,相对于所述微生物的总干重而言,小于0.5质量%的无机硒。
14.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物,其特征在于,所述微生物包含,相对于所述微生物的总干重而言,小于0.1质量%的无机硒。
15.富集了有机硒的绿藻,其可根据权利要求1的方法来获得,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的硒的总质量的大于50%。
16.根据权利要求14的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的硒的总质量的大于70%。
17.根据权利要求14的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的硒的总质量的大于80%。
18.根据权利要求14的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的硒的总质量的大于90%。
19.富集了有机硒的绿藻,其可根据权利要求1的方法来获得,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为大于1000μgSe/g干重。
20.根据权利要求15的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于2质量%。
21.根据权利要求15的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于1.5质量%。
22.根据权利要求15的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于1质量%。
23.根据权利要求19的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量确定为,相对于以干重计的所述绿藻的总生物量而言,小于0.5质量%的无机硒。
24.根据权利要求19的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量确定为,相对于以干重计的所述绿藻的总生物量而言,小于0.2质量%的无机硒。
25.根据权利要求19的富集了有机硒的绿藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量确定为,相对于以干重计的所述绿藻的总生物量而言,小于0.1质量%的无机硒。
26.富集了有机硒的蓝藻,其可根据权利要求1的方法来获得,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的总硒质量的大于50%。
27.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的总硒质量的大于70%。
28.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的总硒质量的大于80%。
29.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为其所包含的总硒质量的大于90%。
30.富集了有机硒的蓝藻,其可根据权利要求1的方法来获得,其特征在于,它的以硒代甲硫氨酸形式的有机硒的含量为大于1000μgSe/g干重。
31.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于2质量%。
32.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于1.5质量%。
33.根据权利要求26的富集了有机硒的蓝藻,其特征在于,它的无机硒的残留含量为,相对于其所包含的总硒而言,小于1质量%。
34.根据权利要求26的蓝藻,其特征在于,它属于螺旋藻属或节旋藻属。
35.根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物在制备美容学、药学或营养学试剂中的用途。
36.包含至少一种根据权利要求6的富集了有机硒的光合微生物的组合物。
37.根据权利要求36的组合物,其特征在于,所述组合物是美容学的、药学的或营养学的组合物。
38.用于光合微生物的培养基,其特征在于,它包含一种或多种式(I)的硒代羟酸类型的化合物或者所述化合物的前体、盐、酯衍生物或酰胺衍生物
Figure FSB00001081558500051
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Selenium from selenium-rich Spirulina is less bioavailable than selenium from sodium selenite and selenomethionine in selenium-deficient rats;Cases J等;《J Nutr.》;200109;第131卷(第9期);2343-2350 *
钝顶螺旋藻富集转化硒及硒在藻体中的分布;黄峙等;《植物生理学通讯》;200102;第37卷(第1期);12-14 *
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