KR950006950B1

KR950006950B1 - 셀렌화이스트의 제조방법

Info

Publication number: KR950006950B1
Application number: KR1019910022989A
Authority: KR
Inventors: 오태광; 고영희; 이동규
Original assignee: 주식회사대성미생물연구소; 이동규
Priority date: 1991-12-14
Filing date: 1991-12-14
Publication date: 1995-06-26
Also published as: KR930013122A

Abstract

내용 없음.

Description

셀렌화이스트의 제조방법

본 발명은 셀렌화 이스트(Selenized Yeast)의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 한국의 코지(Koji)에서 분리한 사카로 마이세스 우바리움(Saccharomyces Uvarium)을 생산균주로 이용하여 여기에다 셀레늄 염(Selenium Salt)과 영양액을 공급하므로서 고수율의 셀렌화 이스트를 제조하는 방법과, 이 과정에서 생기는 발효폐액을 효과적으로 처리하는 방법에 관한 것이다.

셀레늄(Selenium)은 오래전부터 확실한 작용기전이 밝혀지지 않은 상태에서 동물체내의 간괴사증(hepatic liver necrosis)이나 항암(anticancer) 효과 및 순환게 조절작용등의 효과가 인정되어 왔고, 근래에는 강장제 및 영양원으로서 인축에 이용되고 있다.

최근 연구에서는 가축이나 사람의 영양학적, 생리학적 차원에서 구체적인 연구가 확립되면서 필수 영양소로서 셀레늄의 위치가 점차 부각되고 있으며, 셀레늄의 결핍은 돼지, 양, 송아지 등의 근육백화병(white muscle disease), 닭의 췌장 괴사증(pancreatic necrosis), 사람의 심장병 및 소화기계에서 영양흡수 이상등을 유발시킨다고 보고되고 있다.

또한, 일정량의 셀레늄을 계속 공급받은 사람은 질병에 대한 방어력이 높아지고, 가축의 경우 셀레늄은 질병에 대한 방어력과 영양흡수능력, 사료효율, 증체율, 번식율, 산란율 등의 향상으로 축산 생산성을 높여준다.

이와같이, 셀레늄은 인축에서 여러가지 용도로 유효하게 이용될 수 있다. 그러나 셀레늄을 무기물 형태인 셀렌화물이나 셀렌산염의 형태로 인축에 공급하게 되면 과량투여시 독성에 의한 부작용이 유발될 수 있으며, 그 이용율 역시 상당한 수준으로 떨어지게 된다. 때문에 셀레늄을 셀렌화 이스트 내에 존재하는 셀레노메티오닌(Selenomethionine)이나 셀레노시스테인(Seleno cystein)형태로 공급하는 것이 인축에 안전하고, 그 이용율도 월등히 높은 것이며, 이에 대하여는 많은 연구에 의하여 이미 입증된 바 있다.

이와 같은 셀렌화이스트는 이미 일본, 미국 등지에서 제조되고 있으며, 그 제조방법은 주로 다음과 같이 세가지로 분류된다.

첫째, 폐자원인 맥주발효후의 찌꺼기(맥주박) 속에 존재하는 살아있는 이스트를 셀레늄염에 침지하여 혼입시키는 방법.

둘째, 이스트 발효시 초기배지에 셀레늄염을 첨가시켜서 발효시키는 방법.

셋째, 이스트 발효시 발효중간에 셀레늄염을 첨가시켜서 발효시키는 방법.

상기의 방법중 첫째방법은 세포내 비독성 형태의 셀레늄보다는 독성인 셀레늄이 많이 생기기 때문에 인축에 사용하기 부적합하고, 둘째방법은 미처 이스트가 생육하지 못하고 사멸되기 때문에 생산량이 극히 적은 단점이 있다.

그리고, 셋째 방법은 미국특허 제4530846호(1985), 일본특허 공개 소58-929954호 등에 알려진 제조방법으로서 앞의 두가지 방법보다 개선된 방법이긴 하지만 이는 초기의 이스트 접종량이 너무 많다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 식용가능한 이스트중에서 셀레늄의 축적이 가장 양호한 한국의 코지(Koji)에서 분리된 사카로마이세스 우바리움을 생산균주로 선정하고, 셀레늄이 가장 잘 혼입(incorporation)되는 배지조성을 선정하였으며, 이스트 셀 자체의 물질대사가 가장 활발한 로가리움 페이스(logarium phase)에서 셀레늄염과 50g/ ℓ의 글루코오스 영양액을 동시에 투여하며, 발효초기에 셀레늄으로 적응된 이스트를 극소량 접종하는 방법을 개발하므로서 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 생산성이 높고, 이스트셀 표면에 붙어있는 셀레늄보다 셀 내부에 존재하는 셀레늄의 양이 많아서 경제적 유효성이 높을 뿐만 아니라, 특히 발효폐액중에 남아서 환경오염의 주요 원인이 되는 잔류셀레늄을 효과적으로 처리, 제거해낼 수 있는 셀렌화 이스트의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 미생물 발효에 의해 셀렌화이스트를 제조함에 있어서, 셀레늄이 0.1ppm이상 포함되어 있는 YM배지상에 사카로마이세스 우바리움을 접종한 후, 이를 30℃, 1vvm, 500rpm으로 8시간 동안 발효시키고, 여기에다 셀레늄염(Selenium Salt)과 영양액을 공급하여 다시 27~28℃, 1vvm, 500rpm 에서 16시간동안 배양한 다음, 수확, 세척하고, 60℃에서 2~3시간동안 자기 건조하여서 되는 것을 특징으로 하는 셀렌화 이스트의 제조 방법인 것이다.

여기서, 셀레늄염과 함께 공급하는 영양액으로는 50g/ℓ의 글루코오스를 사용한다.

또한, 이때 상기 수확후 남게되는 발효폐액중에 포함되어 있는 셀레늄과 세척시 발생되는 잔류 셀레늄은 0.1% 아크릴아마이드와 0.5% 폴라카르콜(Polar Charcoal)로 동시처리한후, 침전시키거나 폴라카르콜 컬럼을 통과시켜서 제거한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[생산균주의 선정]

본 발명에서는 셀렌화 이스트의 생산에 가장 적당한 균주를 선정하기 위해 우선 한국한 탁주제조시에 사용되는 Saccharomyces cerevisiae(KCTC 1199), Saccharomyces corlsbergensis(KCTC 7223), Saccharomyces ellipsodeus(IFO 0251), Saccharomyces uvarium(KCTC 1555)을 대상균주로 하고, 셀레늄이 포함된 YM배지에서 소규모 쉐이킹인큐베이터(Shaking incubator)로 상기 대상균주를 배양한 후, 각 대상균주의 셀 생산량과 셀레늄 회수율을 비교하여 셀 생산량과, 셀레늄 회수율이 가장 높게 나타난 사카로마이세스 우바리움(Saccharomyces uvarium KTCT 1555)을 생산균주로 선정하였다.

이때 사용된 사카로마이세스 우바리움의 균주특성은 J.Loeder의 “The Yeasts” P703-706(1971)에 나타낸 바와 같다.

[셀렌화이스트의 제조 및 잔류 셀렌의 제거]

선정된 균주 사카로마이세스 우바리움을 이용하여 셀렌화 이스트를 제조하는 과정을 설명해 보면,

가) 선정된 균주 사카로마이세스 우바리움을 셀레늄이 0.1ppm이상 포함된 YM배지상에 훈양한 후 다음과 같은 제조공정으로 생산한다.

나) 생산폐액에 포함된 셀레늄과 세척시 발생된 셀레늄은 아크릴아마이드 0.1%와 폴라 카르콜(polar charcoal) 0.5%를 동시처리후, 이를 침전시키거나 폴라카르콜 컬럼(polar charcoal column)을 통과시켜서 제거한다.

셀렌화 이스트 제조시 이스트셀 내부에 흡착되지 않고 남은 셀레늄은 발효 폐액에 남아서 이를 처리하지 않고 배출시키면 중요한 환경오염원이 된다.

본 발명에서는 이를 처리하기 위하여 우선 제조과정에서 투여된 셀레늄이 이스트 셀 내부에 높은 비율로 흡착되게 하여 발표폐액에 남는 셀레늄의 양을 최대한 줄여줌으로써 폐수처리해야 할 폐액의 농도를 낮추어줌과 동시에 얻고자 하는 셀렌화 이스트의 생산성을 높여준다.

그러나, 발표폐액에는 적은양의 셀레늄이지만 남아았게 되므로 이를 완전히 처리해야만 환경오염에 문제가 되지 않는다.

본 발명에서의 발표폐액 처리법은 아크릴아마이드, 폴리카르콜, 간이흡착제인 폴리카르콜컬럼 등을 이용하여 폐액내의 셀레늄은 물론 단백질과 같은 고분자 물질까지 흡착제에 흡착시키는 방법으로서, 이때 오염물질이 흡착된 간이흡착제는 건조후 소각시키면 된다.

본 발명의 상세한 제법을 실시예를 통하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실험예 1]

[균주선정]

한국의 탁주 제조균인 Saccharomyces cerevisiae(KCTC 1199), Saccharomyces carlsbergensis(KCTC 7223), Saccharomyces ellipsodeus(IFO 0251) 및 Saccharomyces uvarium (KCTC 1555)을 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0ppm의 셀레늄이 각각 함유된 YM배지 (조성 ; ℓ당 효모추출물 3g, 맥아추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g)에서 각각 훈양시킨후, 50mg/ℓ농도의 YM 액체배지상에서 30℃, 1vvm, 500rpm으로 소규모 진탕배양을 한후 각 균주의 이스트 생산량과 셀레늄 회수율을 비교한 결과 사카로마이세스 우바리움이 배양액 ℓ당 48g의 이스트 생산과 생산된 이스트 g당 1050㎍의 셀레늄을 획득하여 대상균주중에서 가장 나은 성적을 나타냈다.

또한, 초기균주 훈양시의 TM 배지내의 셀레늄 농도는 0.1ppm부터 10ppm까지 별다른 차이가 없었다.

그러나, 0.05ppm에서는 각 균주 공히 성적이 좋지 못하여 균주훈양시 셀레늄의 농도는 0.1ppm이상이 되어야 함을 알 수 있었다.

[실시예 1]

[셀렌화이스트의 생산(1)]

효모추출물(yeast extract) 15g, 맥아추출물(Malt extract) 15g, 펩톤(Proteose peptone) 25g, 포도당 50g을 1ℓ의 수도물에 녹인 배지(Ph 6.5)에 0.1ppm 수준으로 셀레늄을 첨가 (0.219mg Na₂S₂O₃/ℓ)한후 121℃에서 15분간 멸균하였다.

이를 다시 30℃로 식힌다음 이 배양액 1ℓ에 동일배지에서 미리 30℃ 12시간 배양된 사카로마이세스 우바리움의 종배양액 10ml를 접종하여 30℃에서 8시간 배양하였다.

이때 배양은 발효조(Fermentor)를 사용하였고, 배양조건은 1vvm, 500rpm이었다. 이와 같이 8시간 발효후 배양액 ℓ당 50g의 포도당과 484mg의 Na₂S₂O₃를 첨가하고 온도는 27.5℃로 낮춘다음 16시간 동안 발효를 계속하였다.

발효종료후 세척하여 건조하였을때 배지 1ℓ당 70g의 셀렌화 이스트가 생산되었고, 생산된 셀렌화 이스트 g당 2150㎍의 셀레늄이 축적되었으며, 총생산된 셀렌화이스트 내의 셀레늄 함량을 투입된 셀레늄 함량으로 나누어 백분율로한 셀레늄 회수율은 86.3%였다.

그 결과를 미국특허 제4530846호의 방법과 항목별로 비교하여 셀레늄회수율을 비교한 결과는 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 미국특허 방법은 65.6%인데 비해 본 발명의 방법은 86.3%로 현저하게 개선된 회수율을 나타내었다.

[표 1]

즉, 상기 표 1의 결과로부터 확인되듯이 본 발명의 방법에 따르면 종래의 방법(미국특허 제4530846호)에 비해 건조이스트 생산량이 월등히 우수하고, 단위 g당 건조이스트내의 셀레늄 함량도 좋기 때문에 전체적인 셀레늄회수율이 높은 것을 알 수 있으며, 특히 이스트접종량에 비교하여 총셀레늄 생산량이 거의 2배 가까이 향상된 것임을 알 수 있다.

[실시예 2]

[셀렌화이스트의 생산(2)]

사탕수수 또는 사탕무우 폐액 200g, 대두박 100g, K₂HOP₄3g, MgCO₄0.5g, ZnSO₄15mg을 1ℓ의 수도물에 녹인 배지에 (pH 6.5) 0.1ppm 수준의 셀레늄을 첨가한후, 121℃, 15분간 멸균한 다음 무균처리된 티아민을 배지 ℓ당 15mg 첨가하고 30℃로 식혔다.

이 배양액 1ℓ에 동일 배지에서 미리 30℃, 12시간 배양된 사카로마이세스 우바리움 종배양액 10ml를 접종하여 30℃에서 8시간 배양하였으며, 이때 발효조의 배양조건은 실시예 2와 같았다.

8시간 발효후 배양액 ℓ당 사탕수수 또는 사탕무우폐액 50g과 Na₂S₂O₃484mg, 티아민 15mg을 첨가하여 16시간동안 발효를 계속하였다. 발효종료 후 세척, 건조하여 셀렌화이스트를 생산하고 생산량 및 셀레늄 회수율을 조사하였다. 셀렌화이스트의 생산량과 셀레늄 회수율은 실시예 1과 비슷한 수준이었다.

[실시예 3]

[셀렌화이스트의 세척 및 처리]

생산된 셀렌화이스트 함유 배양액을 5000rpm에서 10분간 원심분리한후 최종 침전액에 3배의 물을 재혼탁시키고 다시 5000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이와 같은 방법을 3회 반복하여 이스트 표면에 묻어있는 무기 셀레늄을 완전히 제거한후 사용목적에 따라 달리 생산하기 위하여 동결건조하거나 자기소화후 분말화하였다.

동결건조는 -70℃로 냉동시킨후 4℃에서 수분을 승화시키는 방법으로 제조하였고, 자기소화후 분발화의 세척후는 셀렌화이스트를 60℃에서 3~4시간 자기 소화시킨후 저온감압 건조기를 이용하여 제조하였다.

[실시예 4]

[발효폐액 및 세척액의 처리]

발효폐액 및 세척액에는 미 이용된 무기셀레늄이 남아있으며, 이는 일반적인 폐수처리 방법인 활성오니법으로 할 경우 폐수처리가 안되거나 폐수처리 공정 자체를 망치게 된다.

본 실시예에서는 발효폐액 및 세척액에 폴리아크릴아마이드 0.1%를 첨가한후 폴리카르콜 컬럼(숯 : 활성탄=1 : 1비율)에 통과시켜서 잔류셀레늄을 완전히 처리하였다.

이러한 방법은 셀레늄 뿐만 아니라 폐액내의 단백질등 다른 고분자 물질도 흡착시키는 것이기 때문에 폐액의 정화처리 방법으로 매우 적합하였다.

본 실시예에서 알게된 컬럼의 크기는 폐액부피의 0.5%이상 수준이면 가능하였고, 처리후 여과된 물의 셀레늄 잔존여부를 조사하기 위하여 MBRT(Methylene Blue Reduction Test)를 한 결과 셀레늄이 완벽하게 제거되었음을 알 수 있었다.

이와 같이 본 발명은 한국산 탁수 제조시 사용되는 여러종류의 효모균 중에서 셀렌화이스트의 생산에 가장 적합한 사카로카이세스 우바리움을 이스트 생산 균주로 선정하고, 이를 이용한 발효과정에서 초기에 셀레늄으로 이스트를 순양(馴養)시킨후, 적기에 셀레늄염과 영약액을 공급하고, 셀레늄 회수율이 가장 높은 온도로 셀렌화이스트를 생산하고 그 생산과정에서 생기는 발효폐액을 폴리카르콜등의 간이 흡착제를 이용하여 처리하므로서 종래에 비해 효율적이면서도 고수율로 셀렌화이스트를 제조할 수가있는 것이다.

Claims

미생물 발효에 의해 셀렌화이스트를 제조함에 있어서, 셀레늄이 0.1ppm이상 포함되어 있는 YM배지상에 사카로마이세스 우바리움을 접종한후, 이를 30℃, 1vvm, 500rpm으로 8시간동안 발효시키고, 여기에다 셀레늄염(Selenium Salt)과 영양액을 공급하여 다시 27~28℃, 1vvm, 500rpm에서 16시간 동안 배양한 다음, 수확, 세척하고, 60℃에서 2~3시간동안 자기 건조하여서 되는 것을 특징으로 하는 셀렌화 이스트의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 영양액으로는 50g/ℓ의 글루코오스를 사용함을 특징으로하는 셀렌화이스트의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 수확후 남게되는 발효폐액중에 포함되어 있는 셀레늄과 세척시 발생되는 잔류 셀레늄은 0.1% 아크릴아마이드와 0.5% 폴라카르콜(Polar charcoal)로 동시 처리한후, 이를 침전시키거나 폴라카르콜 컬럼을 통과시켜서 제거하는 것을 특징으로 하는 셀렌화이스트의 제조방법.