CN1330711A - 含有高叶绿素的耐盐性小球藻 - Google Patents

含有高叶绿素的耐盐性小球藻 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种叶绿素含量高的,且在海水中的生存期长的,适合于海面养殖饲料、水产饲料的含有高叶绿素的小球藻,作为养鱼用轮虫饵料的情况下,能够提供给养殖鱼类,使所述养殖鱼类被来自海水的以食物链浓缩的二噁英类等环境污染物质污染减少。在小球藻中,通过实施采用多次紫外线照射的变异处理以及实施采用甲磺酸酯或吖啶黄的变异处理,可以制备在含有1重量%以上氯化钠的培养基中能够生长发育且总叶绿素含量以干燥重量计为4%以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻属变异株。

Description

含有高叶绿素的耐盐性小球藻
技术领域
本发明涉及含有高叶绿素的耐盐性小球藻，它是食品着色材料，且高浓度含有具有抗胃溃疡作用、抗变态反应作用、抗脑血管性疾病作用、除臭作用、抗变异原作用、二噁英类排泄促进作用等功能的叶绿素，作为健康食品、功能性食品、医药原材料优异的，且在海水中存活期长的适用于海面养殖饲料、水产饲料等。
背景技术
小球藻是属于绿球藻目的单细胞绿藻，由于生长速度比较快，蛋白质含量高，含有较多的必须氨基酸即赖氨酸，以前作为健康食品源或养鱼用轮虫的饵料而大量培养。另外，小球藻中含有的叶绿素除了以前报道的抗胃溃疡作用、抗肝障碍作用、抗变态反应作用、抗脑血管性疾病作用、除臭作用之外，抗变异原作用或二噁英类排泄促进作用最近也有报道(《食品和开发》Vol.33，No.8，1998，p18-20)。根据该报道，人体吸收作为环境污染物质最成问题的二噁英类，90％以上是从食物摄取的，特别地，由从海水以食物链式浓缩的鱼类和贝类摄取60％，另外，二噁英类一般经小肠的吸收率高，由于很难被代谢，在脂肪组织或肝脏中蓄积。
另一方面，以前作为提高小球藻中的叶绿素含量的技术，已知以下技术：通过在0.5-6ppm的范围调节培养液中的溶解的氧浓度，调节培养液至pH5.5-7.5的范围，在0.1mg-0.5mg/培养基L的范围添加蛋白质的水解物或氨基酸，且连续调整培养液的葡萄糖的量至10-40mg/培养基L，不对小球藻进行光照，而在罐中培养的方法(特公昭58-40462号公报)，或者通过紫外线照射处理小球藻，经变异处理，制备总叶绿素含量以干重计为3％以上的含有高叶绿素的小球藻(特许第2620045号公报)。但是，该总叶绿素含有量以干燥重量计为3％以上的高叶绿素含有性的小球藻属变异株在含有氯化钠的培养基中不能生长。
发明概述
由于最近对环境激素的关心提高，一直在寻求不被二噁英类等环境污染物质污染的安全的食品或食品材料。对于以轮虫为饵料，在海水中养殖的鱼类也不例外，对被由海水经食物链浓缩的二噁英类等的环境污染物质污染少的鱼类的期望很大。为了提供这样的养殖鱼类，作为该饵料的轮虫等饵料的小球藻，使用具有抗变异原作用或二噁英类排泄促进作用的叶绿素含量高的小球藻是有效的。
另一方面，实际利用小球藻作为水产饲料的情况下，撒到海面上的小球藻虽然是褶皱臂尾轮虫等的活饵料，但如果将不具有耐盐性的小球藻撒到海面上，由于在海水中不能生长，就会逐渐死掉，作为养鱼用轮虫等饵料，不但在当初的期待以下，而且由于死掉的小球藻成为残饵料，使水质变坏的可能性高，为此，以前的小球藻即使叶绿素含量高一些，在作为水产饲料的有用性方面也不能满足。而且，使小球藻具有耐盐性，使之适应于海水以前是不知道的。
本发明的课题在于提供含有高叶绿素的耐盐性的小球藻，其叶绿素含量高，在作为养鱼用轮虫饵料的情况下，能够供给被从海水以食物链式浓缩的二噁英类等环境污染物质污染少的鱼类，且在海水中的存活期长，适合于海面养殖饲料，水产饲料等。
为了解决上述课题，摸索找到可以制备具有叶绿素含量高和耐盐性这2个性质的小球藻，本发明者发现通过在小球藻中实施紫外线和吖啶黄处理，能够重现性良好地制备在海水中能够生长发育，且高浓度含有叶绿素的小球藻，结果完成了本发明。
即，本发明涉及以在含有1重量％以上的氯化钠的培养基中能够生长发育且总叶绿素含量比亲代株高的含有高叶绿素的耐盐性小球藻，或者以在含有1重量％以上的氯化钠的培养基中能够生长发育且以干燥重量计总叶绿素含量为4％以上为特征的含有高叶绿素的耐盐性小球藻，或者以小球藻是属于小球藻属的变异株M-207A7为特征的上述含有高叶绿素的耐盐性小球藻，或者以通过实施变异处理得到的为特征的在含有1重量％以上的氯化钠的培养基中能够生长发育的耐盐性小球藻，或者以干燥重量计总叶绿素含量是4％以上为特征的含有高叶绿素的小球藻。
另外，本发明还涉及以通过异养培养方法培养上述小球藻，采集耐盐性和/或高叶绿素含量的小球藻藻体为特征的小球藻藻体的制造方法，或者以上述含有高叶绿素的耐盐性小球藻或耐盐性小球藻为有效成分为特征的水产饲料，或者以通过在小球藻中进行紫外线照射实施变异处理和通过甲磺酸酯或吖啶黄实施变异处理为特征的变异株的制备方法，或者以变异株是在含有1重量％以上的氯化钠的培养基中能够生长发育且以干燥重量计总叶绿素含量为4％以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻属变异株为特征的上述变异株的制备方法。
通过对小球藻亲代株实施变异处理，可以制备本发明的含有高叶绿素的小球藻、耐盐性小球藻或含有高叶绿素的小球藻。作为这样的变异处理，可以例举紫外线照射和/或采用变异药剂的变异处理。
本发明的小球藻是指属于绿球藻目的小球藻(Chlorella)属的单细胞绿藻，作为被变异处理的小球藻亲代株，例如从湖泊沼泽采集的从水和泥沙中分离的小球藻野生株，或者保藏株也可以，这些属于小球藻属的小球藻，可以列举出C.sorokiniana、小球藻(C.vulgaris)、椭圆形小球藻(C.ellipsoidea)、C.luteoviridis、C.protothecoides、C.zopfingiensis、C.vaiegata、C.xanthella、嗜糖小球藻(C.saccharophilia)、C.miniata等。
另外，在有机物为碳源的异养繁殖下，优选亲代株和变异株可以一起培养的小球藻株。作为这样的小球藻株的培养用培养基和变异株的选择性培养用培养基，只要小球藻能够繁殖，任何培养基都可以。可以列举出YM肉汤液或表1所示组成的YM琼脂培养基(均为Difco公司制)或表2所示的小球藻培养用的培养基。表1(YM琼脂培养基；Difco公司制)酵母提取物     3.0g麦芽提取物     5.0g细菌蛋白胨     5.0g葡萄糖         10.0g琼脂           20.0g蒸馏水         1000ml表2(小球藻培养用培养基)KNO3          1.0gKH2PO4       1.0gMgSO4.7H2O   1.0g酵母提取物      5.0g葡萄糖          25.0gFeSO4·7H2O  100mgA5溶液(注)      5ml蒸馏水          1000mlPH              6.5(注)A5溶液H3BO3         2.86gMnSO4·7H2O   2.5gZnSO4·7H2O   0.222gCuSO4·5H2O   79.0mgNa2MO4        21.0mg蒸馏水           1000ml
采用紫外线照射的变异处理，只要能够从亲代株得到目的变异株，任何变异处理都可以，所述采用紫外线照射的变异处理，例如可以列举出采用具有254nm的紫外线灯照射的处理方法。如图1所示，采用紫外线照射所致变异，例如如果在4-10kerg/mm2紫外线照射量下进行，则比较容易得到目的变异株。另外，多次照射比一次照射效率高，能够得到目的变异株的情况多。
另外，采用变异药剂的变异处理，只要能够从亲代株得到目的变异株，任何变异处理都可以，采用这样的变异药剂的变异处理，例如可以列举出使用甲磺酸酯、吖啶黄、N甲基-N′-硝基-N硝基胍、5-溴尿嘧啶、羟胺等变异药剂的处理方法，其中，特别优选用甲磺酸酯或吖啶黄制备目的小球藻变异株。这些变异药剂的处理浓度或处理时间可以根据变异药剂的种类而相应设定，以便从亲代株效率高地得到目的变异株，通常在1-500ppm的浓度和10-60分钟的条件下处理。例如，甲磺酸酯或吖啶黄的处理浓度优选分别是20-200ppm和5-50ppm。
而且，特别优选将采用紫外线照射的变异处理和采用变异药剂的变异处理两者结合起来。例如，本发明的在含1重量％以上氯化钠的培养基中可以生长发育的耐盐性小球藻或在含1重量％以上氯化钠的培养基中可以生长发育且总叶绿素含量比亲代株高的含有高叶绿素的耐盐性小球藻，特别是在含1重量％以上氯化钠的培养基中可以生长发育且以干燥重量计总叶绿素含量是4％以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻，只经由紫外线照射处理要想以有重现性的制备几乎是困难的，但如果经过多次紫外线处理，通过合并甲磺酸酯或吖啶黄等的变异药剂的处理，就能够重现性良好地制备出来。另外，根据本发明者，这些耐盐性株的选择率经试验证实大约是1/106。
而且，通过将2次紫外线处理和采用吖啶黄变异处理结合起来，作为在含有1重量％以上的氯化钠的培养基中可以生长发育且以干燥重量计总叶绿素含量是4％以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻的一个实例，制备属于小球藻属的变异株M-207A7。该M-207A7株在群马县高崎市宫原町3麒麟麦酒株式会社应用开发中心保藏，按照日本特许法第27条之3的规定，是可以发放的。另外，该M-207A7株以CCTCC M 99013的保藏号于平成11年12月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection)(中华人民共和国，武汉430072，武汉大学)。
本发明中，在含1重量％以上氯化钠的培养基中可以生长发育是指接种在添加1重量％的氯化钠的YM琼脂培养基中，在35℃，在暗处培养7天的条件下生长发育。另外，总叶绿素含量以干燥重量计4％以上是指在上述表2所示组成的小球藻培养用培养基中接种，在35℃下进行3天200rpm的振荡培养的情况下，以干燥重量计，总叶绿素的含量为4％以上。
附图的简单说明
图1是表示用紫外线照射的小球藻死亡率的图。
发明的详述
下面，根据实施例详细说明本发明，本发明的技术范围不受以下实施例的限定。实施例1(含有高叶绿素的耐盐性小球藻的取得)
(亲代株的分离)
从1997年5月至7月，在表3所示的A10培养基(东京大学分子生物学研究所编LAM Catalogue of Strains.p404.1993)中添加了1％的表4所示的抗生素混合液N6(发酵工学会平成3年度大会会议录471页)的琼脂培养基上培养从群马县的湖泊沼泽采集的水和泥沙得到的小球藻，在35℃下，7天内，日照周期明暗各12小时进行培养，分离小球藻属的单细胞绿藻类。接着，采用移液管洗净法(《藻类学研究法》共立出版株式会社1979年12月1日发行，p70)，完全无菌化。在YM肉汤液中接种该无菌株，在35℃下，在暗处培养7天，使用YM琼脂培养基分离繁殖的株，成为亲代株。表3(A10培养基组成)KNO3         1.25gMgSO4.7H2O  1.25gKH2PO4      1.25gFe溶液(注)     1.0mlA5溶液         1.0ml琼脂           18g蒸馏水         1000mlPH             6.0(注)Fe溶液
FeSO4·7H2O  1.0g
蒸馏水          1000ml
H2SO4         2滴表4(抗生素混合液N6组成)青霉素G钾盐     334mg硫酸链霉素      334mg硫酸卡那霉素    134mg硫酸庆大霉素    134mg磷霉素          334mg制霉菌素        26mg蒸馏水          100ml
用0.22μm滤膜进行过滤除菌处理。
(高叶绿素变异株的选拔)
在以107-108个/ml细胞密度在无菌水中悬浮上述亲代株的液体中，进行2次5kerg/mm2的照射量的紫外线处理，在YM琼脂培养基上，在35℃下，在暗处进行7天培养，在出现的菌落中选择、分离比亲代株绿色更深的50株菌落。在该分离的50株变异株中进一步地使用20ppm的吖啶黄，进行30分钟的接触处理，反复分离绿色深的菌落，再次选择、分离50株。
(耐盐性株的选拔)
在添加了1重量％氯化钠的YM琼脂培养基中接种50株含高叶绿素的株，在35℃下，在暗处培养7天，从出现的30株群落选择、分离含有高叶绿素且耐盐性的变异株M-207A7。该变异株的主要性状示于表5中。从该性状可以看出，变异株M-207A7株在1重量％的氯化钠下是可以生长发育的。表5(性状以及性质)大小                     4-7μm形状                     球形同化葡萄糖的能力(5％)    +++同化葡萄糖的能力(10％)   ++1％氯化钠浓度的生长发育  ++同化半乳糖的能力(1％)    -同化乙醇的能力           -可溶性淀粉               -(叶绿素含量的测定)
在表2所示组成的小球藻培养用培养基中培养上述得到的M-207A7株和作为比较例的市售品B-1株。另外，在表3所示组成的A10培养基中培养作为对照的小球藻C.vulgaris C-27。培养是将100ml各培养基放入500ml三角烧瓶中，在35℃下进行3天200rpm的振荡培养，培养后，在3000rpm下离心分离处理培养液15分钟，回收藻体。通过在650nm以及665nm下的吸光度测定藻体的甲醇提取液的方法(《藻类学研究法》共立出版株式会社1979年12月1日发行，p498中记载的方法)，测定总叶绿素含量。结果示于表6中。表6株                   藻体量(g/l) 叶绿素量(％)     培养基M-207A7(本发明)        6.88       4.1     小球藻培养用培养基(表2)B-1(市售品)            6.60       3.1     小球藻培养用培养基(表2)小球藻C.vulgaris C-27  2.62       1.7     A10培养基组成(表3)(对轮虫的给饵试验)
在放入了3L天然海水∶自来水＝3∶1的轮虫饲养用溶液的5L容积的烧杯中，放入轮虫以使轮虫的初始浓度为150-200个体/ml，在保持水温27℃下的同时，4天给饵小球藻PCV(Packed Cell Volume)为60v/v％的悬浮液，每100个轮虫个体，早上0.1ml，晚上0.2ml。该试验反复7次，对于本发明的M-207A7株和作为比较例的市售品B-1株，调查轮虫繁殖(4天后)的差异。7次平均结果示于表7中。从表7可以验证轮虫能够很好地食用在海水中可存活的耐盐性株。表7株                 个体/ml        轮虫繁殖率M-207A7(本发明)       1850           9-12倍B-1(市售)             1600           8-10倍(M-207A7株的大量培养)
在50L容积的发酵罐中放入40L表4所记载的培养基，在通气量30L/分，搅拌300rpm，在暗处，在35℃下培养3天，回收培养液，在3000rpm下离心分离处理15分钟，得到小球藻藻体。用上述方法得到总叶绿素的含量为4.3％(干燥重量计)。从该结果可以看出，通过罐中的通常的异养培养方法，在保持优异的性状的状态下，可以以工业规模大量培养含有高叶绿素的耐盐性小球藻。
实施例2(重现性试验)
除了亲代株的采集源的湖泊沼泽的场所不同之外，以和实施例1相同的方式，分离含有高叶绿素的耐盐性小球藻。如表8所示，从和实施例1不同的8个地方的湖泊沼泽，也可以得到在含有1重量％以上氯化钠的培养基中可生长发育且以干燥重量计总叶绿素含量为4％以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻。表8湖泊沼泽        氯化钠浓度1％的生        叶绿素量(％)
             长发育A                 ++                        4.0B                 ++                        4.1C                  +                        4.2D                  +                        4.1E                 +++                       4.1F                 ++                        4.0G                  +                        4.2H                  +                        4.1
工业实用性
根据本发明，通过在罐内的通常的异养培养方法，能够在保持优异性状的状态下，以工业规模大量培养叶绿素含量高的，且在海水中的生存期长的，适合于海面养殖饲料、水产饲料的含有高叶绿素的小球藻，作为养鱼用轮虫饵的情况下，能够提供给养殖鱼类，所述养殖鱼类被来自海水的以食物链式浓缩的二噁英类等环境污染物质污染减少。

Claims (9)

1.一种含有高叶绿素的耐盐性小球藻，其特征在于，在含有1重量％以上氯化钠的培养基中能够生长发育且总叶绿素含量比亲代株高。
2.一种含有高叶绿素的耐盐性小球藻，其特征在于，在含有1重量％以上氯化钠的培养基中能够生长发育且总叶绿素含量以干燥重量计为4％以上。
3.根据权利要求2记载的含有高叶绿素的耐盐性小球藻，其特征在于，小球藻是属于小球藻属的变异株M-207A7。
4.在含有1重量％以上氯化钠的培养基中能够生长发育的小球藻，其特征在于是通过实施变异处理得到的。
5.含有高叶绿素的小球藻，其特征在于，总叶绿素含量以干燥重量计为4％以上。
6.小球藻藻体的制造方法，其特征在于，通过异养培养方法，培养权利要求1-5任一项记载的小球藻，采集耐盐性和/或高叶绿素含量的小球藻藻体。
7.水产饲料，其特征在于，以权利要求1-3任一项所记载的含有高叶绿素的耐盐性小球藻或在含有1重量％以上氯化钠的培养基中能够生长发育的耐盐性小球藻为有效成分。
8.变异株的制备方法，其特征在于，在小球藻中实施采用紫外线照射的变异处理，和实施采用甲磺酸酯或吖啶黄的变异处理。
9.权利要求8记载的变异株的制备方法，其特征在于，变异株是在含有1重量％以上氯化钠的培养基中能够生长发育且总叶绿素含量以干燥重量计为4％以上的含有高叶绿素的耐盐性小球藻属变异株。
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