KR100290990B1

KR100290990B1 - 염이 함유된 배지를 이용한 피키아 귈리어몬디 균체 생산 방법및이를 이용한 폐기물 처리 방법

Info

Publication number: KR100290990B1
Application number: KR1019990006620A
Authority: KR
Inventors: 박연희; 최민호
Original assignee: 윤원석; 학교법인대우학원
Priority date: 1999-02-27
Filing date: 1999-02-27
Publication date: 2001-05-15
Also published as: KR20000056878A

Abstract

본 발명은 고농도의 염이 함유된 환경에서 성장할 수 있고 단세포 단백질로 이용될 수 있는 신규 효모 균주 피키아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii) A9, 염이 함유된 배지에서 피키아 귈리어몬디를 배양하여 단세포 단백질로 사용할 수 있는 균체를 생산하는 방법 및 피키아 귈리어몬디를 이용하여 염이 함유된 폐기물을 처리하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 내염성이 매우 강한 효모로서 고농도의 염이 함유된 배추 절임 폐수 등에서의 생육이 매우 우수하고, 생육 온도 및 pH 범위도 넓어, 김치 생산 공장에서 발생하는 임의의 배추 절임폐수에 배양하면 단세포 단백질을 생산함과 동시에 배추 절임폐수 및 배추 쓰레기를 한꺼번에 효과적으로 처리할 수 있는 장점이 있다.

Description

염이 함유된 배지를 이용한 피키아 귈리어몬디 균체 생산 방법 및 이를 이용한 폐기물 처리 방법{Production of Pichia guilliermondii Biomass Using Saline Medium and Process for Treating Waste by Employing Same}

본 발명은 염이 과량 함유된 배지, 특히 김치 제조시 발생하는 배추 절임폐수에서 성장할 수 있는 효모 피키아 귈리어몬디, 특히 신규 효모 균주 피키아 귈리어몬디 A9(Pichia guilliermondii A9)를 배양하여 단세포 단백질로 사용할 수 있는 균체를 생산하는 방법, 상기 균주를 이용하여 배추 절임폐수 등의 폐기물을 처리하는 방법, 및 피키아 귈리어몬디 A9에 관한 것이다.

김치는 우리나라의 대표적 전통 발효식품으로서 1980년대부터 본격적인 산업화가 시작되었으며 공장에서 생산되는 김치는 연간 약 14만 톤으로 조사되었으나, 수출과 내수의 증가로 해마다 약 15∼20%의 증가 추세에 있다(Choi, T. D., An Analysis on the Market Organization of Kimchi Industry, Doctoral Thesis, Seoul National University, Seoul, 1994). 이와 같은 김치의 산업화에 따라 최근 김치의 과학적인 생산, 가공, 보존을 위한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 김치제조 중 절임 과정에서 부산물로 발생하는 절임폐수에 관한 연구는 전무한 실정이다.

김치공장의 절임폐수는 그 발생량 및 성분이 조사, 보고된 바 없으나 현재 연간 약 8∼10만 톤 정도가 발생하는 것으로 추정된다. 절임폐수는 배추의 절임 과정 중 배추로부터 유출된 당 성분 등이 함유되어 있어서 BOD 및 COD가 높고, 소금의 함량이 약 7∼10% 정도로 매우 높아서 현재와 같이 이를 그대로 버리는 것은 수질 및 토양오염을 일으키는 심각한 문제가 되고 있으며, 또한 절임폐수의 유기 성분을 균체 생산 및 유용물질 생산을 위한 기질로 재활용할 가치가 있는 폐수로 볼 수 있다.

지금까지 식품공장의 폐수를 이용한 균체 생산에 관한 연구로는 국내에서는 주로 알콜 발효공장의 증류 폐액을 이용하여 효모를 생산하고 동시에 폐수 처리 효과를 얻기 위한 연구 결과가 보고되었다. 이 등(Lee, H. Y. et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng., 10, 95∼100(1982))은 절간 고구마 원료의 주정 폐액에서 효모 토룰롭시스 칸디다(Torulopsis candida)를 배양하여 BOD를 39% 감소시켰다고 보고하였으며, 김 등(Kim, et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 21, 281∼287(1993))은 쌀보리 알콜 발효 증류 폐액에서 칸디다 루고사(Candida rugosa)를 배양한 결과 균체 생산량은 높았으나 COD 감소 효과는 낮은 편이었다고 보고하였다. 또한, 이 등(Lee, C. Y. et al., Korean J. Biotechnol. Boeng., 8, 172∼177(1993))은 단세포 지질 생산에 적합한 효모로 로도토룰라 글루티니스(Rhodotolula glutinis)를 알콜 발효 증류 폐액에서 배양하여 4g/ℓ의 단세포 지질과 88.7%의 BOD 감소 효과를 얻었다고 보고하였다. 한편, 조 등(Cho, S. H. et al., J. of Korean Agric. Chem. Soc., 32, 424∼434(1989))은 식품공장 폐수의 특성을 조사하고 그 중 주정공장 폐수에서 미생물을 배양한 결과 90% 이상의 BOD와 COD 감소 효과를 얻었다고 보고하였다.

외국에서는 행 등(Hang, Y. D. et al., J. of Milk and Food Technol., 35, 432∼435(1972))이 김치와 유사한 채소 발효 식품인 사우어크라우트(sauerkraut) 생산시 발생하는 폐수가 BOD가 매우 높고, pH가 낮으며, NaCl 농도가 약 3 - 4% (w/v)로 높으므로 상법에 의한 폐수 처리가 부적합하다고 하였으며, 이 폐수에 칸디다 유틸리스(Candida utilis)와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 배양함으로써 BOD를 감소시키고 균체를 생산하는 방법을 보고하였다(Hang, Y. D., et al., Progress in Water Technol., 8, 381∼384(1976)). 또한 사우어크라우트 폐수에서 칸디다 유틸리스를 배양하여 BOD를 90% 이상 감소시키는 동시에 식용 또는 사료로 쓰이거나, 인버테이즈(invertase)의 효소원으로 사용할 수 있는 균체를 생산할 수 있다고 보고하였다(Hang, Y. D., Process Biochem., 12, 27∼28(1977)).한편, 웰쉬와 잘(Welsh, F. W. and R. R. Zall, Process Biochem., 19, 122∼123(1984))은 수산물 절임 폐수에 칸디다 유틸리스를 배양하여 균체를 생산하는 방법을 보고하였다. 일본국 특허 공개 제 평4-173089 호에는 염농도 0.2-7% (w/w)의 범위에서 페놀을 분해할 수 있는 리조비엄 과(Rhizobiaceae)에 속하는 세균이 개시되어 있다.

그러나, 지금까지 염농도가 더욱 높은 김치공장에서 발생하는 절임폐수에 관하여는 조사된 바 없으며, 이 폐수를 이용한 균체 생산에 대한 연구는 전혀 없는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 고농도의 염이 함유된 환경에서 성장할 수 있고 단세포 단백질로 이용될 수 있는 신규 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 염이 함유된 배지에서 피키아 귈리어몬디를 배양하여 단세포 단백질로 사용할 수 있는 균체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피키아 귈리어몬디를 이용하여 고농도의 염이 함유된 폐기물을 처리하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1a 내지 1c는 배추 절임 폐수에서 배양할 때 피키아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii) A9의 성장에 대한 온도, pH 및 NaCl 농도의 영향을 각각 나타낸 것이다.

도 2는 배추 절임 폐수(pH 4.0, 8% NaCl)에서 30℃로 배양할 때 피키아 귈리어몬디 A9의 성장에 대한 통기량의 영향을 나타낸 것이다.

도 3a 및 3b는 배추 절임 폐수(pH 4.0, 8% NaCl)에서 30℃로 배양할 때 피키아 귈리어몬디 A9의 성장에 대한 황산 암모늄 및 인산 칼륨의 영향을 각각 나타낸 것이다.

도 4는 배추 절임 폐수(pH 4.0, 8% NaCl)에서 30℃로 배양할 때 피키아 귈리어몬디 A9의 성장에 대한 미량 영양성분의 영향을 나타낸 것이다.

도 5는 배추 절임 폐수(pH 4.0, 8% NaCl)에서 30℃로 배양할 때 피키아 귈리어몬디 A9의 성장에 대한 황산 아연 농도의 영향을 나타낸 것이다.

도 6은 30℃에서 피키아 귈리어몬디 A9의 성장도중 배추 절임 폐수의 BOD 감소를 나타낸 것이다.

도 7은 피키아 귈리어몬디 A9과 기타 내염성 효모의 배추 절임 폐수에서의 생육을 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 배추 절임폐수와 같이 고농도의 염이 함유된 환경에서 성장할 수 있는 신규 효모 균주 피키아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii) A9이 제공된다.

피. 귈리어몬디 A9는 온도 약 20℃ 내지 42℃, pH 약 2 내지 11에서 우수한 생육을 나타내며, 특히 NaCl 농도 약 18%에서도 생육이 가능하다. 특히, 이 균주는 배추 절임 폐수와 같이 고농도(7-12%)의 NaCl을 함유하는 각종 배지에서 생육이 가능하며, 배추 절임 폐수 등에 함유된 유기물 이용 능력이 우수하여 상기 균주를 배추 절임 폐수 등에서 배양함으로써 단세포 단백질을 효과적으로 생산하면서 동시에 유기물을 제거할 수 있다. 상기 균주는 배추 절임 폐수 등에서의 생육 pH, 생육 온도 및 생육 염농도 범위가 넓은 균주이므로 상이한 절임 공정에 따라 성분에 차이가 있는 임의의 절임폐수에서도 특별한 부가적 처리없이 성장할 수 있다. 더구나, 본 발명의 균주는 배추 절임폐수에서 배양할 때 공지의 피. 귈리어몬디 균주보다 높은 생육을 나타내고, 특히 40℃의 고온에서 공지의 피. 귈리어몬디 균주보다 훨씬 우수한 생육을 나타내므로 일반적으로 공업적인 미생물 배양시 발생하는 발효열에 의한 온도 상승에 대한 냉각비용을 절감할 수 있다는 측면에서 공업적으로 매우 유리하다.

본 발명에서는 또한 피. 귈리어몬디 A9를 포함하는 피. 귈리어몬디 종(genus)들을 고농도의 염을 포함하는 배지에서 배양하여 단세포 단백질로 사용할 수 있는 균체를 생산할 수 있음을 발견하였다. 구체적으로는, 피. 귈리어몬디를 초기 pH가 2 내지 11, NaCl 농도가 0.5 내지 18%인 배지에 접종하고, 20℃ 내지 42℃의 온도에서 진탕배양한 후, 배양액으로부터 원심분리 등의 방법에 의해 균체를 회수하고 세척 및 건조하여 건조 균체를 얻음으로써 단세포 단백질을 얻을 수 있다. 피. 귈리어몬디를 pH 4, NaCl 농도 12% 이하인 배지에서 30℃로 진탕 배양하는 것이 가장 바람직하며, 배양 초기 pH를 3∼4 정도로 낮게 조절하여 배양하면 세균에 의한 오염을 피할 수 있어 유리하다. 통기량은 생육에 크게 영향을 미치지 않으며 0.5 vvm 정도면 충분하다.

상기의 방법에 의해 배양한 균체는 일반적인 단세포 단백질 생산 공정(Solomons, G. L., CRC Cirtical Reviews in Biotechnology, 1(1), 21∼58 (1982))과 같이 균체의 회수, 건조, 분쇄의 과정을 거쳐 제품화할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 생산된 균체는 약 40%의 높은 조단백질 함량을 나타내므로 단세포 단백질로서 유용하게 이용될 수 있다. 피키아 귈리어몬디는 요시다 및 하시모토(Yoshida, A. and Hashimoto, K., Agric. Biol. Chem., 50, 2117-2120 (1986a))와 마우어스베르거 등(Mauersberger et al., (1996) Candida maltosa, pp. 411-480, In Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Wolf, K. ed. Springer-Verlag, Berlin, Germany)에 의해 보고된 바와 같이 병원성이 없거나 병원성을 나타낼 가능성이 거의 없다. 또한, 균체의 건조과정 등에 의한 열처리를 통해 사균화시킨 균체를 단세포 단백질로 사용할 경우 독성에 대한 위험도는 더욱 줄일 수 있다.

본 발명에서 피. 귈리어몬디를 배양하기 위한 배지로서는 고농도의 염을 포함하는 임의의 배지를 사용할 수 있고, 특히 김치 제조 공장의 절임 폐수 및 폐기물, 절임채소 가공공장(피클류, 단무지 생산 공장 등)의 절임 폐수 및 폐기물, 장류 가공 폐수 및 폐기물, 수산물 염장 가공 폐수 및 폐기물, 염장 육가공(햄 등) 폐수 및 폐기물 등 고농도의 염을 포함하는 폐기물들을 사용할 수 있다.

필요에 따라, 상기 배지에 임의의 영양 성분을 첨가하여 균체의 생육을 증진시킬 수 있으며, 미량원소로서 약 0.5 mM의 아연을 첨가하면 균체의 생육이 증진된다. 그러나, 0.5 mM의 아연의 첨가에 의한 균체 증가 효과는 크지 않으므로 첨가하지 않아도 무방하다.

또한, 본 발명에서는 미생물을 이용하여 폐기물을 처리하는 방법에 있어서, 염이 함유된 폐기물에 균주로서 내염성인 피. 귈리어몬디를 접종하고, 상기 균주를 배양하여 유기물을 분해하는 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법이 제공된다. 균주의 배양 방법은 상기에서 균체 생산 방법과 관련하여 설명한 것과 동일하고, 본 발명의 방법으로 처리할 수 있는 폐기물들은 피. 귈리어몬디의 균체 생산과 관련하여 상기에서 예시한 고농도의 염을 함유하는 폐수 및 폐기물들을 포함한다.

특히, 김치 제조 공장에서 배출되는 김치 절임폐수를 처리할 때, 김치 절임 폐수에 배추 쓰레기 착즙액을 첨가하는 공정을 도입하면 김치 제조 공장에서 배출되는 두 가지 폐기물인 배추 절임폐수와 배추 쓰레기를 동시에 처리하는 효과가 있다.

본 발명의 균주를 이용하여 배추 절임폐수를 처리하는 경우 24시간 이내에 BOD를 약 90% 이상 감소시키므로 본 발명의 폐수처리 방법은 매우 간단하면서도 유기물 제거 효과가 뛰어나다. 배추 절임 폐수에 배추 쓰레기 착즙액을 첨가하여 배양한 경우에도 유기물 제거 효과가 우수하여 20% 이내로 첨가한 경우는 24시간 이내에, 30% 첨가시에는 48시간 이내에 환원당 함량이 완전히 소모된다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다. 본 실시예에서는 김치 제조 공장의 절임 폐수 및 폐기물, 절임채소 가공공장(피클류, 단무지 생산 공장 등)의 절임 폐수 및 폐기물, 장류 가공 폐수 및 폐기물, 수산물 염장 가공 폐수 및 폐기물, 염장 육가공(햄 등) 폐수 및 폐기물 중에서 배추 절임폐수를 이용하였다.

실시예 1: 배추 절임폐수의 특성 분석

(1) 절임폐수

경기도 소재의 생산 규모가 다른 4개의 김치공장으로부터 배추 절임폐수 시료를 수집하였다.

또한 균일한 성분의 절임폐수를 얻기 위하여 김치공장에서 배추를 절이는 공정과 유사한 과정에 따라 다음과 같이 실험실에서 절임폐수를 제조하였다. 즉, 시장에서 구입한 배추를 다듬어 4조각으로 자른 후 10% 소금물에서 15℃를 유지하면서 15시간 동안 절였다. 이때 배추 무게와 소금물의 비율은 약 2:3 (w:v)으로 하였으며, 절인물은 여과지(Whatman No. 2)를 사용하여 걸렀다. 또한, 김치공장에서 1회 절임에 사용한 소금물을 2회 또는 3회 재사용하는 것을 감안하여 1회 절인 배추중 일부를 동일한 조건에서 2회 절였으며, 이때 1회 사용한 절임폐수와 재 사용한 절임폐수의 성분차이도 비교하였다.

절임폐수에서 효모의 생육 특성을 조사할 경우는 실험실 제조 절임폐수를 사용하였으며, 절임폐수는 NaCl을 사용하여 NaCl농도가 8%가 되도록 하였고, 환원당 농도는 약 1.0 g/ℓ가 되도록 글루코즈를 첨가하여 표준화하여 사용하였다.

(2) 절임폐수의 특성 분석

(1)에서 준비된 배추 절임폐수들을 이용하여 생물학적 산소 요구량(BOD), 화학적 산소요구량(COD), NaCl 농도, pH, 총당 및 환원당 함량, 질소 함량 등의 주요 특성을 분석하였다. 절임폐수의 BOD 및 COD는 표준방법(APHA, AWWA and WPCF(1992), Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 18th ed., American Public Health Association, Washington, D.C)에 따라 측정하였으며, NaCl 농도는 모어(Mohr)의 방법(AOAC(1995), Official Methods of Analysis, 16th ed., Association of Official Analytic Chemists, Washington, D.C)으로 측정하였다. 환원당 함량은 디니트로살리실산법(dinitrosalicyric acid(DNS) method; Miller, G. L., Anal. Chem., 31, 426∼428(1959))로 측정하였고, 킬달(Kjeldahl) 질소 함량은 표준 방법(APHA, AWWA and WPCF(1992), Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 18th ed., American Public Health Association, Washington, D.C) 및 A.O.A.C법(AOAC(1995), Official Methods of Analysis, 16th ed., Association of Official Analytic Chemists, Washington, D.C)을 사용하여 측정하였다.

그 결과는 표 1과 같다.

시료	pH	NaCl(%)	환원당(g/ℓ)	BOD(mg/ℓ)	COD(mg/ℓ)	킬달질소(mg/ℓ)
A1	5.36	11.6	0.64	1,100	1,300	25
A2	4.91	9.5	1.00	1,200	1,800	28
A3	5.48	8.4	0.60	1,100	1,600	20
A4	5.80	7.0	0.50	1,100	1,300	25
B1	6.65	7.5	0.50	900	1,000	10
B2	6.55	7.4	0.51	900	1,100	10
B3	6.25	6.2	1.10	1,300	1,800	17
B4	6.70	6.2	0.75	1,100	1,300	16
B5	6.50	5.8	0.80	1,100	1,300	15
A1∼A4: 김치공장 배추 절임폐수B1, B2: 실험실 제조 배추 절임폐수로서 1회 절인 것B3∼B5: 실험실 제조 배추 절임폐수로서 2회 절인 것

김치공장의 절임폐수(A1∼A4)는 pH 5∼6 범위였으며, NaCl 농도는 7∼12%로 매우 높았다. 또한, 환원당 농도는 약 0.5∼1.0 g/ℓ, BOD는 약 1,100∼1,200 mg/ℓ, COD는 1,300∼1,800 mg/ℓ인 것으로 조사되었으며, 총질소함량은 킬달 질소로 20∼28 mg/ℓ로서 상당량의 유기물을 함유한 것으로 나타났다.

이와 같이 김치공장의 절임폐수는 공장에 따라서 성분의 차이가 있는 것으로나타났는데, 이는 원료인 배추의 성분이 시기에 따라 차이가 있으며 소금물의 비율 및 절임 조건을 일정하게 맞추지 못했기 때문으로 볼 수 있다.

또한, 실험실에서 제조된 배추 절임폐수를 분석한 결과에서도 pH는 6.2∼6.7 정도였고, NaCl 농도는 6∼7% 부근이었으며, 0.5 g/ℓ 내지 1.1 g/ℓ의 환원당이 함유된 것으로 나타나 김치공장 절임폐수와 그 특성이 유사하였다. 그러나, 1회 절임폐수와 2회 절임폐수를 비교한 결과, 2회 절임폐수는 환원당 함량이 약 50∼100% 가량 증가한 것으로 나타났으며, NaCl 농도는 약 1% 정도 낮아졌다.

김치공장의 절임폐수는 알콜 증류 공장의 주정 폐액의 BOD가 수만 mg/ℓ 정도로 매우 높은 것과 비교하면 유기물 함유량이 낮은 수준이지만, BOD가 1,500 mg/ℓ에서 2,500 mg/ℓ인 것으로 조사된(Cho, S. H., et al., J. of Korean Agric. Chem. Soc., 32, 424∼434(1989)) 맥주공장, 과실 통조림공장, 수산물 가공공장의 폐수와는 비슷하였다. 특히, 사우어크라우트 폐염수(Hang, Y. D., et al., J. of Milk and Food Technol., 35, 432∼435(1972))가 NaCl 농도가 3∼4%로 높아 일반 폐수 처리 방법으로 처리하기에 부적합하다고 한 점에 비추어 이보다 NaCl 농도가 훨씬 높은 김치공장의 절임폐수는 기존의 폐수 처리 방법으로는 처리하기 곤란할 것이므로, 단세포 단백질 등으로 이용 가능한 미생물 균체 생산에 이용하는 것이 효과적일 것으로 볼 수 있었다.

실시예 2: 효모균주의 분리, 선발 및 동정

균주 분리용 시료로 절임폐수, 토양 및 간장, 된장, 고추장 등의 식품을 수집하였다. 균주 분리용 배지로 8%의 NaCl을 첨가한 YM 배지를 사용하고 균분리용 시료를 적당히 희석한 후 평판 도말하여 30℃에서 2∼5일간 배양하였다. 평판 배지에 형성된 콜로니로부터 분리한 70여 주의 효모를 실시예 1에 기재된 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 배양하면서 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 기존의 알려진 내염성 효모에 비해 생육이 우수한 균주를 선발하였다. 선발된 내염성 효모 균주를 YM 브로쓰에서 2일간 정치배양한 후, 표준화된 실험실 제조 절임폐수 배지에 1% 접종하고 30℃에서 배양한 결과 A9으로 명명된 균주가 가장 우수한 생육을 나타내었다. A9을 바이오로그사(Biolog Inc., Hayward, CA)의 미생물 자동 동정 장치로 분석한 결과, 피키아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii)로 동정되었다.

이 효모 균주를 피키아 귈리어몬디 A9으로 명명하고, 1999년 2월 18일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제KCTC 8932P호로서 기탁하였다.

실시예 3: 절임폐수에서 내염성 효모 피키아 귈리어몬디 A9의 생육 특성

(1) 최적 배양 온도, pH 및 NaCl 농도의 영향

균체 생산에 적합한 최적 배양온도를 조사하기 위해, pH 6, NaCl 농도 8%로 조절한 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 피. 귈리어몬디 A9를 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃의 각 온도에서 180rpm으로 진탕하면서 24시간 배양한 뒤 생육 정도를 측정하여 최적 배양 온도를 결정하였다. 그 결과, 도 1a에서 볼 수 있는 바와 같이, 배양 온도 25℃ 내지 35℃의 범위에서 생육 정도가 높았으며, 가장 우수한 생육을 나타낸 30℃를 최적 배양 온도로 결정하였다.

또한, 균체 생산에 적합한 최적 pH를 검토하기 위해, NaCl 농도를 8%로 하고, pH를 2∼8 범위로 변화시킨 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에서 피. 귈리어몬디 A9를 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 24시간 배양한 뒤 생육 정도를 측정하여 최적 pH를 결정하였다. 그 결과, 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, 피. 귈리어몬디 A9는 pH 3 부터 pH 8의 범위에서는 생육 정도에 차이가 극히 적어 생육 범위가 매우 넓었으며, pH 4에서 생육이 가장 높은 것으로 나타났다. 실시예 1에서 확인된 바와 같이 김치공장 절임폐수의 pH는 5 내지 6이었으므로 절임폐수는 pH 조절 없이 균체 생산에 이용할 수 있으나, 본 발명의 균주는 낮은 pH에서도 생육이 우수하므로 절임폐수의 초기 pH를 3∼4 정도로 낮게 조절하여 배양할 경우에는 세균에 의한 오염을 피할 수 있어 유리하다고 볼 수 있다.

한편, NaCl 농도를 6∼15%로 변화시킨 pH 6의 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 피. 귈리어몬디 A9를 접종한 후 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 24시간 배양한 뒤 생육 정도를 측정하여 절임폐수의 소금농도가 효모의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 도 1c에서 볼 수 있는 바와 같이, 피. 귈리어몬디 A9는 NaCl 농도 9%까지는 영향을 받지 않고 우수한 생육을 보였으며, 10% 이상에서부터는 생육이 약간씩 낮아졌고, 12% 이상에서는 크게 저해되었다. 그러므로, 피. 귈리어몬디 A9는 NaCl 농도가 7∼12%인 절임폐수에서 거의 저해받지 않고 생육할 수 있는 내염성 효모로서 절임폐수에서의 배양에 적합한 균주임을 확인할 수 있었다.

(2) 최적 통기량

균체 생산을 위한 발효조 배양시 최적 통기량을 조사하기 위해, NaCl 농도를 8%로, 초기 pH를 4로 조절한 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에, 5%의 NaCl을 첨가한 YM 브로쓰에서 18시간동안 180 rpm에서 진탕 배양한 피. 귈리어몬디 A9를 2% 접종한 후, 발효조의 발효용량을 1ℓ로 하고 교반속도를 300 rpm으로 고정한 다음, 통기량을 0.5 vvm, 1.0 vvm, 2.0 vvm으로 조절하여 배양하면서 생육을 비교하였다.

그 결과, 효모의 생육은 생육속도 및 정도에서 통기량에 따라 거의 차이가 없어 0.5 vvm의 통기량으로도 충분한 것으로 나타났다(도 2).

(3) 암모늄염, 인산염 및 미량원소의 첨가 효과

절임폐수는 다른 식품 공장의 폐수에 비하여 탄소원을 비롯한 균체 생육에 필요한 영양분 함량이 낮은 편이므로 피. 귈리어몬디 A9 배양시 소량의 암모늄염 및 인산염을 첨가하여 균체 생산량의 증가 효과를 조사하였다. 구체적으로, pH 4.0, NaCl 농도 8%인 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 (NH₄)₂SO₄와 K₂HPO₄를 각각 0%, 0.2% 및 0.5%로 첨가한 후 피. 귈리어몬디 A9를 접종하고 30℃에서 180rpm으로 24시간 진탕 배양하면서 생육 정도를 측정하여 암모늄염 및 인산염의 첨가에 의한 균체 생산 증가 효과를 조사하였다. 그 결과, 도 3a 및 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, (NH₄)₂SO₄및 K₂HPO₄는0.5%까지 첨가하여도 대조군에 비해 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.

한편, 미량원소로 구리(CuSO₄), 망간(MnSO₄), 마그네슘(MgSO₄), 칼슘(CaSO₄), 철(FeSO₄), 아연(ZnSO₄)등을 0.5 mM의 농도로 상기 절임폐수에 첨가한 후 피. 귈리어몬디 A9를 30℃에서 24시간 배양하여 균체 생산 증가 효과를 조사하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, 여기에서 1은 미량원소를 첨가하지 않은 대조군이고 2 내지 7은 미량원소로 CuSO₄, MnSO₄, MgSO₄, CaSO₄, FeSO₄및 ZnSO₄를 각각 첨가한 시험군이다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, ZnSO₄가 약간의 증가효과를 보였으며 그 이외는 효과가 없었다. ZnSO₄의 최적 첨가 농도를 결정하기 위해, ZnSO₄를 0 내지 5mM 농도로 첨가한 절임폐수에서 피. 귈리어몬디 A9를 배양하여 생육정도를 조사한 결과, 도 5에서와 같이 0.5 mM에서 가장 생육이 높았으며 1mM보다 높은 농도에서는 생육 저해를 나타내었다. 그러나, 0.5 mM의 ZnSO₄의 첨가에 의한 균체 증가 효과는 크지 않으므로 첨가하지 않아도 무방하다.

실시예 4: BOD 제거 효과

실시예 1에 기재된 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 피. 귈리어몬디 A9를 배양하였을 때 절임폐수의 BOD 변화를 측정하여 효모 배양 처리에 의한 유기물 제거 효과를 조사하였다.

NaCl 농도를 8%로, 초기 pH를 4로 조절한 절임 폐수에 피. 귈리어몬디 A9를 1% 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 진탕 배양하면서 BOD 감소 효과를 조사하였다. 그 결과, 배양 초기 BOD가 1,200 mg/ℓ이었던 절임폐수는 24시간 이내에 BOD가 120 mg/ℓ로 감소하였다.

이와 같이 절임폐수의 BOD를 약 90% 이상 제거시킨 결과는 절간 고구마원료 주정 폐액에 토룰롭시스 칸디다 (Tolulopsis candida) 배양시 38.9%의 BOD를 감소시킨 이 등(Lee, H. Y., et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng., 10, 95∼100(1982))의 결과에 비해서는 훨씬 높고, 주정 공장 폐수에 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)를 배양하여 94%의 BOD를 제거한 조 등(Cho, S. H., et al., J. of Korean Agric. Chem. Soc., 32, 424∼434(1989))의 결과와 사우어크라우트 폐염수에 칸디다 유틸리스를 배양하여 90% 이상의 BOD를 제거한 행의 결과(Hang, Y. D., et al., Progress in Water Technol., 8, 381∼384(1976))와는 비슷한 정도이다.

실시예 5: 균체의 성분 분석

NaCl 농도 8%, 초기 pH 4로 조절한 절임폐수에 피. 귈리어몬디 A9를 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 진탕하면서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 증류수로 2회 세척한 후 동결 건조하여 건조 균체를 얻고, 단백질, 지질, 탄수화물 및 회분함량을 조사하였다. 건조 균체의 조단백질 함량은 마이크로-킬달법 (micro-Kjeldahl method; APHA, AWWA and WPCF(1992), Standard methods for the examination of water and waste water, 18th ed., American Public Health Association, Washington, D.C)으로, 탄수화물 함량은 페놀-황산법(Dubois, M., et al., Anal. Chem., 28, 350∼356(1956))으로 측정하였으며, 조지방 함량은 블리히와 다이어의 방법(Bligh, E. G. and W. J. Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911∼917(1959))에 따라 측정하였다. 회분 함량은 시료를 항량을 알고 있는 도가니에 넣고 무게를 측정한 후 전기로에 넣고 500℃에서 수시간 태운 다음 데시케이터(desiccator)에 옮겨 방냉한 후 실온에서 평량하였다. 항량에 이를 때까지 반복하여 회분 함량을 계산하였다.

효모 균체의 성분 분석 결과는 표 2에 나타낸 바와 같고, 절임폐수에서 배양된 효모의 균체 성분 조성을 영양배지인 YM 브로쓰에서 동일한 조건으로 배양한 경우와 비교하면 단백질 함량은 약 6% 적으며, 지질 함량은 약 6% 많고, 회분함량은 동일하였다.

조성(%)	폐염수	YM 브로쓰
조 단백질	40.0	46.1
조 지질	11.7	4.4
탄수화물	45.4	47.4
회분	5.9	5.9

이 결과는 절간 고구마 주정폐액에서 배양한 토룰롭시스 칸디다(Lee, H. Y., et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng., 10, 95∼100(1982))의 단백질 함량이 48%인 것과 비교하면 적은 편이나, 치즈 유청액에서 배양한 사카로마이세스 프래질리스(Saccharomyces fragilis) 등의 효모가 30∼40.25%(El-Samragy, T. A., et al., Process Biocem. 23, 28∼30(1988)), 칸디다 귈리어몬디(Candida guilliermondii)를 탄화수소에 배양했을 때 26.7%인 것(Sabry, S. A., et al., Biomed. Lett. 46, 615∼618(1991))에 비하면 훨씬 높은 것으로 나타났다.

실시예 6: 배추 쓰레기 착즙 첨가 효과

김치 원료인 배추를 다듬는 과정에서는 약 10% 이상의 배추 쓰레기가 발생하며 배추에는 효모 등의 미생물이 쉽게 이용이 가능한 당이 1.6∼2.6% 함유되어 있으므로(Shim, S. T., et al., Korean J. Food Sci. Technol., 22, 278∼284(1990); 및 Yu, H. G., et al., Korean J. Food Sci. Technol., 24, 107∼110(1992)), 김치공장에서 상당량 발생되는 배추 쓰레기는 미생물 배지로 이용 가치가 매우 높은 우수한 유기성 폐기물 자원이라 할 수 있다. 그러므로, 본 실시예에서는 김치공장에서 김치 제조시 다량 발생되어 처리에 곤란을 겪고 있는 배추 쓰레기를 절임폐수에 첨가하여 효모의 생육을 증가시키는 방법을 시도하였다.

김치 제조시 배추를 다듬는 과정에서 발생한 배추 쓰레기를 모아 블렌더(Waring blender)로 파쇄하고, 가제로 걸러 배추 쓰레기 착즙액을 얻었다. 배추 쓰레기의 착즙액을 NaCl 농도 8%, 초기 pH 4로 조절한 표준화된 실험실 제조 배추 절임폐수에 각각 5%, 10%, 20% 및 30%의 비율로 첨가하고 피. 귈리어몬디 A9를 접종하여 30℃에서 180rpm으로 진탕 배양하면서 균체 생산량을 측정하였다. 균체 생산량은 균 배양액을 일정량 취한 후 원심분리(4,000 rpm, 15분)하여 균체를 얻고 증류수로 세척한 뒤 다시 원심분리하여 회수한 균체를 105℃ 건조기에서 항량에 도달 할 때까지 건조하여 측정하였다.

그 결과는 표 3에 나타내었으며, 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 배추 쓰레기를 첨가하지 않은 경우 최고 균체 생산량은 0.69 g/ℓ이었으나, 배추 쓰레기 착즙액 첨가에 의해 건조균체량은 10% 첨가시 1.87 g/ℓ, 20% 첨가시 2.75 g/ℓ, 30% 첨가시 3.4 g/ℓ에 달해 첨가하지 않은 경우에 비해 각각 2.7배, 4.0배 및 4.9배 증가하여 절임폐수만 사용한 경우보다 균체 생산량이 크게 증가하였다. 이때, 환원당은 5%, 10% 및 20% 첨가시에는 24시간, 30% 첨가시에는 48시간 이내에 완전히 소모되었다.

배추 착즙액	환원당(g/ℓ)	최대 건조균체량(g/ℓ)	수율(g/g 환원당)
0 %	1.08	0.69	0.64
5 %	2.15	1.35	0.63
10 %	3.06	1.87	0.61
20 %	4.87	2.75	0.57
30 %	6.80	3.40	0.50

따라서, 김치공장에서 다량 발생되어 문제가 되고 있는 또 다른 폐기물인 배추 쓰레기를 김치공장 절임폐수에 첨가하는 방법으로 효모 균체 생산에 이용함으로써 두 종류의 폐기물을 동시에 효과적으로 처리할 수 있다.

실시예 7: 배추 절임폐수에서 피키아 귈리어몬디 A9와 몇 가지 내염성 효모의 생육정도 비교

본 발명의 균주 피. 귈리어몬디 A9와 동일 종으로 알려진 피키아 귈리어몬디 ATCC 6260의 절임폐수에서의 BOD 제거 효과를 실시예 4에 기재된 방법으로 조사하고, 본 발명의 균주 피. 귈리어몬디 A9와 비교하였다. 피. 귈리어몬디 ATCC 6260의 절임폐수 BOD 제거율은 86%로서 90%를 나타낸 A9보다 BOD 제거 효과가 약하기는 하지만 매우 우수하였다.

한편, 본 발명의 피. 귈리어몬디 A9, 이와 동종인 피. 귈리어몬디 ATCC 6260 및 내염성 효모인 칸디다 할로니트라토필라(Candida halonitratophila) IFO 1595, 자이고사카로마이세스 룩씨(Zygosaccharomyces rouxii) KFRI 204, 및 칸디다 버사틸리스(Candida versatilis) IFO 1228을 이용하여 실시예 4의 방법으로 배추 절임 폐수에서의 생육 정도를 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 피. 귈리어몬디 ATCC 6260의 최고 생육 정도는 30℃에서 배양할 경우 540 nm에서의 흡광도 값이 1.3으로서 피. 귈리어몬디 A9의 최고 생육 정도의 90% 수준이었다. 특히, 배양 온도가 높아짐에 따라 생육정도의 차이가 커져 40℃ 배양의 경우 피. 귈리어몬디 ATCC 6260의 24시간 배양 후 생육 정도는 A9의 생육 정도의 21 % 수준이었다. 즉, 40℃ 배양의 경우는 본 발명의 균주 A9은 ATCC 6260보다 약 4.6배 우수하였다. 본 발명의 균주 피. 귈리어몬디 A9의 고온에서도 생육이 우수한 특성은 일반적으로 공업적인 미생물 배양시 발생하는 발효열에 의한 온도 상승에 대한 냉각비용을 절감할 수 있다는 측면에서 공업적으로 매우 유리한 특성이다. 또한, 본 발명의 균주 피. 귈리어몬디 A9은 기타 내염성 균주들과 비교하여 배추 절임폐수에서의 생육이 훨씬 우수하였다.

그러나, 피. 귈리어몬디 ATCC 6260도 배추 절임 폐수에서 상당히 우수한 생육과 BOD 제거 효과를 나타내므로, 본 발명의 균주 피. 귈리어몬디 A9와 동일 종의 균주들은 배추 절임 폐수에서의 균체 생산에 적합한 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 균주는 18%의 NaCl이 함유된 환경에서도 생육이 가능한 내염성 효모로서 고농도(7-12%)의 NaCl을 함유하는 배추 절임 폐수에서 생육이 가능하며 배추 절임 폐수에 함유된 유기물 이용 능력이 우수하여 상기 균주를 배추 절임 폐수에 배양함으로써 단세포 단백질을 효과적으로 생산하면서 동시에 유기물을 제거 할 수 있다. 상기 균주 A9은 배추 절임 폐수에서의 생육 pH, 생육 온도 및 생육 염농도 범위가 넓은 균주이므로 상이한 절임 공정에 따른 절임 폐수 성분의 차이에 대한 부가적인 처리가 불필요하다. 또한, 피. 귈리어몬디를 염이 함유된 폐기물에서 배양함으로써 균체를 생산함과 동시에 폐기물도 처리할 수 있다. 구체적인 예로 본 발명의 방법은 김치 제조 공장의 절임 폐수 및 폐기물, 절임채소 가공공장(피클류, 단무지 생산 공장 등)의 절임 폐수 및 폐기물, 장류 가공 폐수 및 폐기물, 수산물 염장 가공 폐수 및 폐기물, 염장 육가공(햄 등) 폐수 및 폐기물의 처리에 사용할 수 있다. 특히, 배추 절임 폐수의 경우, 배추 쓰레기 착즙액을 절임폐수에 첨가하여 피. 귈리어몬디를 배양하면 균체생산량이 크게 증가하며, 김치공장에서 발생하는 두가지의 폐기물을 동시에 효과적으로 처리할 수 있다.

Claims

미생물을 이용하여 폐기물을 처리하는 방법에 있어서, 염이 함유된 폐기물에 균주로서 내염성인 피키아 귈리어몬디(Pichia guilliermondii)를 접종하고, 상기 균주를 배양하여 유기물을 분해하는 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
제1항에 있어서,

상기 폐기물이 김치 제조 공장의 절임 폐수 및 폐기물, 절임채소 가공공장의 절임 폐수 및 폐기물, 장류 가공 폐수 및 폐기물, 수산물 염장 가공 폐수 및 폐기물, 및 염장 육가공 폐수 및 폐기물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
제2항에 있어서,

상기 폐기물이 배추 절임폐수이고, 여기에 배추 쓰레기 착즙액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 균주가 피키아 귈리어몬디 A9(기탁번호: KCTC 8932P)인 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
제4항에 있어서,

상기 균주를 pH는 2 내지 11로, NaCl 농도는 0.5 내지 18%로, 온도는 20℃ 내지 42℃로 배양하는 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
제5항에 있어서,

pH가 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 폐기물 처리방법.
(a) 염이 함유된 배지에 균주로서 내염성인 피키아 귈리어몬디를 접종하는 단계,

(b) 상기 균주를 배양하는 단계,

(c) 배양액으로부터 균체를 회수하는 단계, 및

(d) 상기 회수된 균체를 세척 및 건조하는 단계

를 포함하는 균체 생산방법.
제7항에 있어서,

상기 단계 (a)의 배지가 김치 제조 공장의 절임 폐수 및 폐기물, 절임채소 가공공장의 절임 폐수 및 폐기물, 장류 가공 폐수 및 폐기물, 수산물 염장 가공 폐수 및 폐기물, 및 염장 육가공 폐수 및 폐기물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 균체 생산방법.
제8항에 있어서,

상기 배지가 배추 절임폐수이고, 여기에 배추 쓰레기 착즙액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 균체 생산방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 균주가 피키아 귈리어몬디 A9(기탁번호: KCTC 8932P)인 것을 특징으로 하는 균체 생산방법.
제10항에 있어서,

상기 균주를 pH는 2 내지 11로, NaCl 농도는 0.5 내지 18%로, 온도는 20℃ 내지 42℃로 배양하는 것을 특징으로 하는 균체 생산방법.
제11항에 있어서,

pH가 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 균체 생산방법.
고농도의 염이 함유된 환경에서 성장할 수 있는 피키아 귈리어몬디 A9(기탁번호: KCTC 8932P).