KR100453376B1

KR100453376B1 - 배추 폐기물을 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지

Info

Publication number: KR100453376B1
Application number: KR10-2002-0062743A
Authority: KR
Inventors: 박현근; 전인철
Original assignee: 박현근; 전인철
Priority date: 2002-10-15
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2004-10-15
Also published as: KR20040033593A

Abstract

본 발명은 김치 제조시 대량의 폐기물로 발생되는 배추폐기물을 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지에 관한 것이다.

Description

배추 폐기물을 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지{Culture Medium for Lactic Acid Bacteria Prepared from Chinese Cabbage Wastes}

본 발명은 김치 제조시 대량의 폐기물로 발생되는 배추폐기물을 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 김치 제조시 대량으로 발생되는 배추 폐기물을 이용하여 제조된 배지를 사용하여 유용한 유산균, 특히 루코노스탁 가시코미타툼을 다량으로 얻어내는 방법에 관한 것이다.

우리의 전통식품인 김치는 한국인이 가장 즐겨먹는 음식물 중 하나일 뿐 아니라, 국제적으로 보급되어 수출이 급증하고 있으며, 대단위 유통센터의 보급 및 학교 급식의 활성화로 공장 단위의 대량 생산이 이루어지고 있다. 김치를 제조하기 위한 주원료인 배추는 전체 원료의 90 중량% 정도를 차지하며, 이 중 상당부분은 폐기물로 버려지고 있는 실정이다. 특히 대량의 배추 폐기물이 발생하는 김치 공장이나 청과물 시장 등에서는 배추 폐기물을 수집 및 처리하는데 상당한 노력, 시간, 및 비용을 소모하고 있다.

현재 배추 폐기물을 비롯한 유기성 폐기물은 전체 폐기물의 상당량을 차지하며, 쉽게 부패하여 악취를 발생시키고, 오수를 누출시켜 처리에 어려움을 겪고 있으며, 동시에 환경문제를 유발하고 있다. 따라서, 이러한 유기성 폐기물의 처리 방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재까지, 배추 폐기물은 대부분 매립되어 토양 미생물에 의한 분해에 의존하고 있으나 매립지에 한계가 있으며, 배추는 수분을 약 80%이상 함유하고 있어 부패가 빠르게 진행되기 때문에 악취가 발생하고, 폐기물의 분해산물이 수계로 유입될 경우 부영양화의 원인이 되기도 한다. 따라서, 매립 방법을 대체할 만한 다른처리 방법이 모색되어 오고 있다.

본 발명자는 배추 폐기물을 처리하는 동시에 김치 유산균 생체량을 대량으로 생산할 수 있는 유산균 배양용 배지를 개발하게 되었다.

도 1은 배추 폐기물을 15℃에서 21일 동안 발효시키는 과정에서 24시간 간격으로 측정한 김치액의 pH 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 배추 폐기물을 15℃에서 21일 동안 발효시키는 과정에서 24시간 간격으로 측정한 김치액의 산도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 배추 폐기물을 15℃에서 21일 동안 발효시키는 과정에서 24시간 간격으로 측정한 김치액 내 유산균 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따라 김치액에서 분리된 JN3 균주의 생장 곡선을 나타낸 그래프로서, 배추 배지를 사용하여 25℃에서 배양하여 시간별로 흡광도를 측정하여 세포수로 환산하였다.

도 5는 도 4의 생장곡선으로부터 계산된 JN3의 세포수 변화를 나타낸 생장곡선이다.

도 6은 발효조, 혼합기, 배지와 배양액 저장고, pH 조절장치로 이루어지는 연속배양 발효조의 구성도이다.

본 발명에서는 배추 폐기물을 이용한 배양용 배지를 제조하기에 앞서 우선 배추 폐기물을 이용한 김치를 발효시켜 유산균을 생산한다.

A. 김치유산균의 분리를 위한 김치발효

배추 폐기물의 발효 공정은 일반적인 김치 담금 공정을 이용한다. 사용되는 재료는 배추 폐기물 100 중량부, 고춧가루, 마늘, 및 파 각각 1 내지 3 중량부, 양파 2 내지 5 중량부, 타이로신 0.01 내지 0.1 중량부이다. 배추는 3 내지 5㎝ 길이로 절단하여 사용하며, 나머지 재료는 적당한 크기로 분쇄한 다음 모두 혼합하고 2 내지 5% 농도의 소금물 30 내지 70 중량부와 혼합한다. 상기 혼합물을 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 재질 반응기에서 13 내지 17℃ 온도를 유지하면서 15일 내지 25일 동안 발효시킨다. 상기 재료 중 타이로신은 발효과정 중 성장하는 유산균 중 특정 유산균만이 선택적으로 성장되도록 하는 역할을 한다.

본 발명에 따르면, 자원 재활용 및 환경 친화적 관점에서 배추 폐기물을 이용하여 김치를 발효시키는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에서 얻고자 하는 루코노스탁 가시코미타툼균은 김치 발효 과정에서 얻어지는 유산균이므로, 배추 폐기물 대신 일반 배추를 이용하여 상기와 같은 방법으로 김치를 발효시켜 동일한 결과를 얻을 수 있다.

B. 유산균의 분리 및 동정

상기 과정에서 발효된 김치로부터 24시간 단위로 김치액을 채취하여 멸균증류수로 10배 희석하여 희석액을 MRS-BPB(de Man, Rgosa and Sharpe-bromophenol blue)배지에 접종하고 도말한다. 15℃에서 약 48시간 배양하여 생성된 집락의 형태와 색상이 다른 집락을 접종침을 이용하여 순수분리하여 MRS(de Man, Rgosa and Sharpe) 사면 배지에서 순수배양한다. 분리균주는 15일마다 MRS 사면 배지에 계대배양하여 보존하며 균주를 동정한다.

C. 배추 배지의 제조

배추 폐기물을 이용하여 배추배지를 제조하기 위하여, 배추 폐기물을 분쇄기로 분쇄하여 고액분리를 한다. 배추즙 내의 고형물을 제거하기 위하여 80℃까지 가열한 후 배추즙 100 중량부에 응집제로 난백 0.5 내지 3 중량부를 혼합한 다음 상온으로 냉각시킨다. 냉각된 배추즙은 거즈를 이용하여 고형물을 여과시킨 후 여액을 여과지로 여과한다. 여액을 막여과(Φ, 0.45㎛)로 멸균하여 배지로 사용한다.

D. 배추 배지에서의 유산균의 생장

A 단계에서 분리된 균주를 C 단계에서 제조된 배추 배지에서 배양시켜 생장 여부를 확인하고 생장율이 가장 높은 유산균을 선별한 다음, 배양시켜 대량의 유산균 생체량을 얻는다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

유산균의 동정

배추 폐기물 100g, 고춧가루, 마늘, 및 파 각각 1.5g, 양파 3g, 및 타이로신 0.05g을 준비하여, 2.5% 소금물 50g과 혼합하였다. 배추 폐기물은 3㎝ 길이로 절단하여 사용하였고, 고춧가루, 마늘, 파, 양파는 분쇄기로 적당한 크기로 분쇄하여 사용하였다. 상기 혼합물을 폴리프로필렌 재질 반응기에서 15℃ 온도를 유지하면서 21일 동안 발효시켰다.

발효 과정 동안 24시간 간격으로 김치액의 pH, 산도, 및 유산균 세포수를 측정하였다.

pH는 pH 미터(ORION 920A)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. pH는 김치 담금 후 24시간까지는 일시적으로 증가하다가 이후 5일 동안 급격히 감소하여 이후부터는 pH 3.6 내지 4.2를 유지하였다.

산도는 0.1N-NaOH로 적정하여 유산으로 환산시켜 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 산도는 pH와는 달리 7일째까지 증가하여 0.6-0.7%를 유지하였다.

유산균 세포수 측정은 생균수 측정법을 이용하였다. 시료(김치액)를 멸균 증류수로 10배 희석법으로 희석한 다음 0.1㎖의 희석액을 유산균 배양용 배지인 MRS-BPB 배지에 접종 도말한 후 15℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배지에 형성된 집락을 계수하여 세포수로 환산하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 세포수의 변화는 4일째까지 급격히 증가하여 10¹²세포/㎖를 나타내었으며, 그 이후는 파동 현상을 보였다.

김치유산균을 분리하기 위하여, MRS-BPB 배지에 생성된 집락의 형태와 색상이 다른 집락을 접종침을 이용하여 순수 분리하여 MRS 사면 배지에 접종하였다. 그 다음 15일마다 MRS 사면 배지에 계대배양하여 사용하였다. 분리된 균주는 총 17개였다.

배추 배지의 제조

상기 과정과는 별도로, 배추 배지를 제조하기 위하여, 배추를 분쇄기로 분쇄하여 배추즙을 제조하고, 즙내의 고형물을 제거하기 위하여 상기 배추즙을 80℃까지 가열한 후 배추즙 100g에 응집제인 난백 1g을 혼합하고 상온으로 냉각시켰다. 냉각된 배추즙은 거즈를 이용하여 고형물을 여과시킨 후 여액을 여과지(Whatman NO. 1 USA)로 재차 여과하였다. 여액은 막여과법(Φ, 0.45㎛)으로 멸균하여 배지로 사용하였다.

유산균의 배양

상기에서 분리된 17종의 유산균을 제조된 배추 배지에서 배양시켰다. 이 중 생장률이 높은 유산균 4종을 분리하였으며, 이를 JN1 내지 JN4로 지명하였다. 상기 4종의 균주는 모두 구균이었으며, 그램염색, 수크로오즈 배지에서 덱스트란의 형성, 및 MRS 배지에서 가스 생성시험이 모두 양성 반응이었다. 온도별 생장실험에서는 5-37℃에서 모두 생장하였으나, NaCl 농도별 생장 시험에서는 1% NaCl 첨가 배지에서는 생장이 일부 억제되었으며, 2.5% NaCl 첨가 배지에서는 생장이 억제되었다. 이러한 결과를 종합해보면, 분리균주는 생장 온도 면에서는 중온성 세균에 해당되며, 저온(5℃)에서도 생장하였고, NaCl 농도가 높아짐에 따라 생장이 억제됨을 알 수 있었다. 각 균주의 형태 및 생태학적 특징을 표 1에 나타내었다.

특성	JN1	JN2	JN3	JN4
세포의 형태	구균	구균	구균	구균
그람 염색	+	+	+	+
수크로오즈로부터 형성된 덱스트란	+	+	+	+
MRS 배지로부터 생산된 가스	+	+	+	+
5℃에서의 성장	+	+	+	+
15℃에서의 성장	+	+	+	+
25℃에서의 성장	+	+	+	+
37℃에서의 성장	+	+	+	+
0% NaCl에서의 성장	+	+	+	+
1% NaCl에서의 성장	(+)	(+)	(+)	(+)
2.5% NaCl에서의 성장	-	-	-	-

+: 양성, -: 음성, (+): 약한 양성

균주의 생화학적 특성 측정

균주의 생화학적 특성을 측정하기 위하여 다중시험체계를 이용하여 당 발효시험을 하였다. 배지는 MRS 배지를 사용하였으며, 글루코오즈 대신 시험하고자 하는 19개의 당을 막 여과법을 이용하여 멸균하여 최종 농도가 1% 되게 첨가하여 시험배지로 사용하였다. 균주를 배지에 접종하여 25℃에서 2일간 배양 후 복합 pH 지시약을 사용하여 발효 유무를 판단하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

분리균주는 L-아라비노스, 멜리비오스, 라피노스, 리보스, D-크실로스, 말토스, 수크로스, 프락토스, 멜레지토스를 발효시켰으나, 갈락토스, 락토스, 만니톨, 살리신, 람노스, 솔비톨은 발효시키지 못하였다. 이상의 결과는 루코노스탁 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum)과 유연관계가 높은 것으로 나타났다.

보다 정확한 동정을 위하여, 루코노스탁 종 특이성 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)법으로 동정하였으며, 그 결과로 루코노스탁 가시코미타툼임을 확인하였다. 루코노스탁 가시코미타툼 균은 2000년 최초로 발견되어 아직은 그 구체적 용도에 대하여 보고된 바 없으나, 유용한 유산균으로서 생균제(동물사료 첨가제), 정장제(인체 의약품용), 건강보조식품(건강식품용), 및 화장품 첨가제 등의 용도로 사용될 것이 기대된다.

특성	JN1	JN2	JN3	JN4	L.m	L.g	L.c	L.l	L.ga
엘-아라비노스로부터 생산된 산	+	+	+	+	+	+	+	+	+
셀로비오스로부터 생산된 산	+	-	+	+	D	+	+	-	+
갈락토스로부터 생산된 산	-	-	-	-	+	-	+	+	ND
락토스로부터 생산된 산	-	-	-	-	D	-	-	+	-
만니톨로부터 생산된 산	-	-	-	-	D	+	+	-	-
멜리비오스로부터 생산된 산	+	+	+	+	D	+	-	-	+
라피노스로부터 생산된 산	+	+	+	+	D	+	-	-	+
리보스로부터 생산된 산	+	+	+	-	+	+	-	-	+
살리신로부터 생산된 산	-	-	-	-	D	+	+	-	-
트레할로스로부터 생산된 산	+	-	+	+	+	+	+	-	+
디-크실로스로부터 생산된 산	+	+	+	+	D	+	-	-	+
말토스로부터 생산된 산	+	+	+	+	ND	+	ND	ND	+
만노스로부터 생산된 산	-	-	+	-	ND	ND	ND	ND	+
수크로스로부터 생산된 산	+	+	+	+	ND	ND	ND	ND	+
프럭토스로부터 생산된 산	+	+	+	-	ND	ND	ND	ND	+
람노스로부터 생산된 산	-	-	-	-	ND	ND	ND	ND	-
글루코네이트로부터 생산된 산	-	+	-	-	ND	-	+	-	ND
멜레지토스로부터 생산된 산	+	+	+	+	ND	ND	ND	ND	-
솔비톨로부터 생산된 산	-	-	-	-	ND	ND	ND	ND	-

JN1-4 : 분리 균주

L.m :루코노스탁 메센테로이드스sp.메센테로이드스,

L.g :루코노스탁 겔라디움

L.c :루코노스탁 시트륨

L.l :루코노스탁 락티스

L.ga :루코노스탁 가시코미타툼

+: 90% 또는 그 이상의 균주가 양성임;

D: 89-11%의 균주가 양성임;

-: 90% 또는 그 이상의 균주가 음성임;

ND: 감지되지 않음.

배추 배지에서의 생체량 측정

배추 배지에서 분리한 균주를 25℃에서 3일간 배양한 후 분광 광도계를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하고, 생체량은 배양액 20㎖를 막여과하여 105℃에서 4 시간 동안 건조하여 건조중량으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 결과적으로 흡광도와 건조 중량은 무관하게 나타났다. 이는 세포의 형태와 크기의 차이에 따른 것으로 판단되며, 건조 중량은 JN3가 가장 높게 나타났다.

	JN1	JN2	JN3	JN4
흡광도 (550㎚)	0.67	0.53	0.54	0.73
건조 중량 (g/L)	0.355	0.360	0.420	0.395

건조 중량이 가장 높은 JN3의 생장 곡선을 측정하였다. 생장 곡선 측정은 배추 배지를 사용하여 25℃에서 배양하여 시간별로 흡광도를 측정하여 세포수로 환산하였다. 흡광도와 세포수의 상관관계는 도 5에 나타내었으며, 루코노스탁 가시코미타툼(JN3)의 생장 곡선은 도 6에 나타내었다.

생장곡선으로부터 생장률 상수(K)를 구하면 다음과 같다.

(상기의 X _t 는 세포수/㎖, t 는 시간임)

K = 1/ t _gen 이므로, t _gen = 1/0.77 = 1.3(시간)이다.

(상기의 t _gen 는 배가시간(doubling time)임.)

따라서, 비생장률(μ)는 0.693× K 이므로 μ는 0.53임.

연속배양 발효조

본 발명에 따라 김치를 배양하기 위한 연속배양 발효조는 발효조와 혼합기, 배지와 배양액 저장고, pH 조절장치로 나뉘어지며, 발효조의 모식도는 도 6에 나타내었다.

1) 발효조와 혼합기

발효조는 멸균 가능한 유리 재질의 1ℓ 용기를 사용한다. 배지와 배양액, pH 조절액의 혼합을 위하여 마그네틱 스터러를 설치하여 사용하며, pH 측정을 위한 pH전극을 설치하였다.

2) 배지와 배양액 저장고

배지와 배양액 저장고도 멸균 가능한 용기를 사용하였으며, 배지와 배양액이 정량적으로 유출입시키기 위하여 연동 펌프를 설치하였다.

3) pH 조절장치

유산균이 생장하면서 생성되는 유산에 의하여 pH가 낮아져 생장이 저해되는 것을 방지하기 위하여 pH 조절장치를 설치하였으며, 조절장치로 pH가 6.5 이하이면 작동하는 연동 펌프(2)를 설치하여 0.1N-NaOH를 주입케 하였다.

4) 배지의 유량

배지의 저장고로부터 발효조로 유입되는 배지의 유량은 루코노스탁 가시코미타툼의 배가시간이 1.3시간이며, 발효조의 용량이 1ℓ이므로 환산하면 유량이 13㎖/min였다.

본 발명은 배추 폐기물을 이용하여 고부가가치의 유산균 생체량을 대량생산할 수 있는 배양용 배지를 제공하는 효과를 가진다. 상기 배지에서 가장 대량으로 배양될 수 있는 균주는 루코노스탁 가시코미타툼이다. 본 발명에 따르면, 폐기물 처리가 문제되던 대량의 배추 폐기물을 처리함과 동시에 유산균 생체량을 대량으로 얻을 수 있게 된다.

Claims

배추 폐기물을 분쇄기로 분쇄하고, 분쇄된 배추 폐기물 100 중량부에 0.5 내지 3 중량부의 난백을 혼합하여 80℃까지 승온시킨 다음, 상온으로 냉각시키고 막여과하여 제조되는 유산균 배양용 배지.
제1항에 있어서, 상기 유산균은 루코노스탁 가시코미타툼인 것을 특징으로 하는 유산균 배양용 배지.