CN108094794A - 一种解酒护肝的复合微生物饮品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复合微生物活菌含量高、活性高、稳定性高、作用效果快的、无副作用，保存时间长，具有明显保肝护肝，解酒的复合微生物饮品，制备该复合微生物饮品的原料按重量份由枯草芽孢杆菌发酵液30‑40份，桃红荚硫菌发酵液30‑40份，米根霉发酵液30‑40份混合而成。本发明所选择的菌株都是经过解酒与乙醇保持率的试验筛选的，较高的乙醇保持率能够抑制乙醇在胃肠道的吸收并加速乙醇在胃内的代谢，从而降低血液中乙醇的浓度；复合微生物饮品含有丰富的聚谷氨酸，多肽，多糖物质以及益生菌，可以有效降低血清ALT,AST的水平，防治酒精性肝损伤并且可提高肝脏抗氧化能力来减少肝损伤。

Description

一种解酒护肝的复合微生物饮品及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂与食品饮品技术领域，具体是涉及到一种解酒护肝的复合微生物饮品及其制备方法。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的不断提高，我国饮酒人数及饮酒量呈上升趋势，酒精(乙醇中毒尤其是急性酒精中毒的人数剧增。2012年WHO发布的《全球酒精政策状况报部表明，全世界每年死亡人数中，有近4%的死亡是由酗酒造成的，每年约有250万人的死因与酗酒有关。可见，酗酒已严重危害人们的身体健康，甚至还可能引发一系列社会问题。因此，寻找一条既科学又方便实用的有效解酒方法尤为重要。
基于酒精在人体内代谢机制的特点，解酒饮品的作用核心就是降低患者血液中乙醇及其代谢产物的浓度，从而减轻其对人体各器官的损伤。根据乙醇在肝脏中的代谢机制特点，当前解酒饮品的解酒功效主要表现在以下2个方面：①抑制乙醇在胃肠道的吸收并加速乙醇在胃内的代谢，从而降低血液中乙醇的浓度;②增加肝脏内乙醇代谢相关酶类的活性,加快乙醇在肝脏内的氧化代谢速率，消除代谢产生的自由基和脂质过氧化物对机体的损伤。可以减缓乙醇在胃肠道吸收的速度，降低血液中乙醇的浓度，缓解肝脏的乙醇降解压力。同时可以提高饮酒后SOD , CAT , GSH-Px等抗氧化酶的活性，降低饮酒后MDA . ALT和AST的活性，降低脂质过氧化的风险，减少饮酒引起的体内氧化自由基的形成及其对肝脏和其他组织细胞的损伤。过量饮酒会抑制大脑的呼吸中枢，造成呼吸停止，也会抑制肝糖原的分解，使肝糖元不能及时转化为葡萄糖，导致血糖下降也会危及到生命。目前市面上有很多解酒药，用以缓解酒精浓度过高造成的头晕、呕吐等症状。这些药物副作用较大，会对肝脏和肾脏代谢带来额外的负担。市面上也有一些解酒护肝的保健饮料，但是见效很慢，解酒，保肝护肝效果不明显，市场上尚无理想的解酒护肝饮料。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种复合微生物活菌含量高、活性高、稳定性高、作用效果快的、无副作用，保存时间长，具有明显保肝护肝，解酒的复合微生物饮品，制备该复合微生物饮品的原料按重量份由枯草芽孢杆菌发酵液30-40份，桃红荚硫菌发酵液30-40份，米根霉发酵液30-40份混合而成。
为了实现上述目的，本发明保肝护肝，解酒的复合微生物饮品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一, 枯草芽孢杆菌发酵液的制备
、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过30亿/毫升，即可作为枯草芽孢杆菌液体菌种；
、将步骤培养的枯草芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于100亿/毫升，即可结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的枯草芽孢杆菌JCD-H-16，该菌种已由本发明的专利权人在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13663保藏日期为2017年2月16日。
步骤二，桃红荚硫菌发酵液的制备
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养7-10天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，待检测其OD650≥4，活菌数≥10亿cfu/ml，多糖含量达到5 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：玉米黄粉20 g/L，氯化铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.4g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日。
步骤三，米根霉发酵液的制备
、取出米根霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米根霉种子液；
发酵：将上述制备的米根霉种子液以2%的接种量接种至装有300L米根霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养48-72小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即可作为米根霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的米根霉发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L，大豆分离蛋白粉10 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，米根霉菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5085；
步骤四，将前面制备的枯草芽孢杆菌发酵液30-40份，桃红荚硫菌发酵液30-40份，米根霉发酵液30-40份混合而成，检测其多糖含量不低于1.5 g/L，芽孢含量不低于20亿CFU/ml，即可灌装，作为复合微生物饮品。
本发明中含有枯草芽孢杆菌JCD-H-16，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13663保藏日期为2017年2月16日；具有解磷，防病促生，增产提质，抑菌谱广，高产γ-聚谷氨酸等多重功效，本发明人对其有比较详细的研究与试验，开始主要着重研究其较强解磷防病促生且明显的合成聚谷氨酸能力的菌株，因此主要应用着重于做为微生物菌肥等领域，但发现其对酒精的保持较率较其他菌有明显的优势，因此，对其安全性确定后，应用到解酒上去有意想不到的效果。
本发明中含有的桃红荚硫菌，由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日；本发明人对其有比较详细的研究与试验，开始主要着重研究其超强的硫化氢的降解能力与氨氮去除能力，因此主要应用着重于作为微生物菌肥，污水处理剂等领域，但在发酵培养基优化过程中发现其有时会比较粘稠，经过分析发现其粘稠物质主要为多糖物质，经过分析发现其主要多糖物质为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸构成；而且经过不同的培养基试验其最高多糖物质可达到10g/L以上，但如果多糖物质较高时，其残余还原糖含量也比较高，不适合后期产品的保存，最后我们经过试验确定其本发明公开的培养基与培养工艺比较合适，不仅仅残还原糖较少，多糖物质也是可起到明显的效果，有文献报道多糖是一种免疫调节剂，能够激活免疫细胞、分泌细胞因子，参与宿主特异性免疫与非特异性免疫，从而提高机体免疫功能。大量免疫实验证实，细菌多糖可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用，不仅激活T, B淋巴细胞、巨噬细胞(M})和自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，对免疫系统发挥多方面的调节作用；大多数多糖对各种病毒有抑制作用，如艾滋病毒(HIV-1)、单纯疤疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和乌肉瘤病毒等，还具有抗肿瘤，降血糖，保肝护肝的作用。
本发明中的复合微生物饮品中含有米曲霉，能产生多种具有生物活性的酶系，如：淀粉酶，糖化酶，蛋白酶，纤维素酶，植酸酶，木聚糖酶等。米曲霉（Aspergillus oryzae）是发酵工业常用的生产菌种，分类上归属于半知菌亚门，是曲霉属真菌中的一个常见种，米曲霉在淀粉存在下产生大量的淀粉酶，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在高分子蛋白存在下产生蛋白酶，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，其菌体物质还含有丰富的氨基酸与未知营养因子，对人体有较明显的有益效果。
本发明的有益效果：本发明中保肝护肝解酒的复合微生物饮品中所选择的菌株都是经过解酒与乙醇保持率的试验筛选的，较高的乙醇保持率能够抑制乙醇在胃肠道的吸收并加速乙醇在胃内的代谢，从而降低血液中乙醇的浓度；
通过防醉试验发现本发明的微生物饮品组的防醉与醒酒效果都比较好。可能的原因：一方面微生物饮品中含有聚谷氨酸与多糖物质粘度大，持酒率高，可以减缓小鼠肠胃对乙醇的吸收速度;另一方面微生物饮品中的发酵所产生的多肽，和益生菌等物质增加对进入血液乙醇的代谢速度来达到降低机体血乙醇浓度的效果，从而起到解酒防醉的功效。
本发明的复合微生物饮品可以有效降低血清ALT, AST的水平，防治酒精性肝损伤。其作用原理可能与枯草芽孢杆菌中含有大量的聚谷氨酸，多糖物质，以及发酵过程中产生的小肽物质的激活纤溶、调节凝血等功能有关，但其确切的生化、分子生物学机理还有待于进一步探讨。
本发明的复合微生物饮品能够有效提高模型小鼠肝脏SOD的活性，同时降低氧化产物MDA的含量。这个结果表明，复合微生物饮品通过提高肝脏抗氧化能力来减少肝损伤。
总之，本发明提供一种复合微生物活菌含量高、活性高、稳定性高、作用效果快的、无副作用，保存时间长，具有明显保肝护肝，解酒的复合微生物饮品。
具体实施方式
实施例1解酒菌种平板初筛
平板筛选培养基：磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠5g/L，氯化铁0.01g/L，硫酸铵5g/L，无水乙醇5%(v/v)，琼脂20g/L，pH7.2；
芽孢发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，大豆分离蛋白粉40 g/L，蜂蜜40 g/L，氯化钠5 g/L，：磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.2；
将本公司实验室保存的100多株芽孢杆菌进行平板初筛，发现芽孢杆菌能在平板上快速生长有JCD-H-16，JCD-Q-8，JCD-B-17，JCD-L-2 JCD-L-15：并进行乙醇保持率试验，结果如表1发现JCD-H-16对乙醇的保持率有较明显的优势，因此初步选定其作为下一步试验菌株，
表1芽孢杆菌的乙醇保持率试验结果
菌种 JCD-H-16 JCD-Q-8 JCD-B-17 JCD-L-2 JCD-L-15
乙醇保持率（%） 35.4 7.8 9.9 12.4 6.4
实施例2复合微生物发酵液乙醇保持率的筛选试验
乙醇保持率是指解酒物质对加入其中的乙醇经过包裹等作用量减少，或者抑制或延缓乙醇在体内的吸收的能力。
测定溶液中乙醇浓度公式如下：
乙醇保持率=[（A-B）/A]× 100%
其中：A：添加乙醇量
B：处理后乙醇含量
试验方法：将现有的各种发酵菌液进行单独发酵后，再按一定比例进行复配，再测定其乙醇保持率，总共分以下11组：
A：枯草芽孢发酵液；B：桃红荚硫菌发酵液；C：根霉菌发酵液；D：酵母菌发酵液；E：植物乳杆菌发酵液；F：枯草芽孢发酵液与桃红荚硫菌发酵液1：1混合；G：桃红荚硫菌发酵液与根霉菌发酵液1：1混合；H：根霉菌发酵液与枯草芽孢发酵1：1混合；I：枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液1：1：1混合；J：枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液，酵母菌发酵液1：1：1：1混合；K：枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液，酵母菌发酵液，植物乳杆菌发酵液1：1：1：1：1混合
试验结果：乙醇在机体中被胃肠吸收到体内各组织器官中约5 min后便会出现在组织血液中。采用气相色谱法测定微生物菌液的加入乙醇之前与反应之后的乙醇浓度。由表2可知，11种微生物样品都具有不同程度的乙醇保持活性；组合I：枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液1：1：1混合样品的乙醇保持率最高，其次是J：枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液，酵母菌发酵液1：1：1：1混合。解酒物质对乙醇包埋效果越好，乙醇的持久率就会越好，延缓或减少机体对乙醇的吸收效果越好。从乙醇保持率上来看，枯草芽孢发酵液，桃红荚硫菌发酵液，根霉菌发酵液这三种单独的发酵液的乙醇保持率最高的只达到了35.4%，但将其复合后，其乙醇保持率居然达到了88.9%，可能发酵代谢产物中的一些物质发生偶合或者反应了。
表2各组微生物乙醇保持率
物料 A B C D E F G H I J K
乙醇保持率(%) 35.4 28.7 18.6 13.5 8.9 67.2 44.6 58.8 88.9 68.9 54.7
实施例3一种解酒护肝的复合微生物饮品，该复合微生物饮品由枯草芽孢杆菌发酵液30-40份，桃红荚硫菌发酵液30-40份，米根霉发酵液30-40份混合而成；
其具体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一, 枯草芽孢杆菌发酵液的制备
、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过30亿/毫升，即可作为枯草芽孢杆菌液体菌种；
、将步骤培养的枯草芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养30小时，检测其芽孢含量为121亿/毫升，即可结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L，蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的枯草芽孢杆菌JCD-H-16，该菌种已由本发明的专利权人在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13663保藏日期为2017年2月16日。
步骤二，桃红荚硫菌发酵液的制备
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养8天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，检测其OD650为4.4，活菌数为12亿cfu/ml，多糖含量为6.6 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：玉米黄粉20 g/L，氯化铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.4g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日。
步骤三，米根霉发酵液的制备
、取出米根霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米根霉种子液；
发酵：将上述制备的米根霉种子液以2%的接种量接种至装有300L米根霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养62小时，检测其菌体含量为72g/L，停罐，即可作为米根霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的米根霉发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L，大豆分离蛋白粉10 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，米根霉菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5085；
步骤四，将前面制备的枯草芽孢杆菌发酵液40份，桃红荚硫菌发酵液30份，米根霉发酵液30份混合而成，检测其多糖含量为1.8 g/L，芽孢含量为38亿CFU/ml，即可灌装，作为复合微生物饮品。
实施例4 安全性试验
本发明实施例3制备的复合微生物饮品在广西大学经小鼠急性毒性试验，结论结果表明复合微生物饮品对小鼠（按0.4ml/10g体重饲喂本发明复合微生物饮品14天）效果：小鼠全部存活,活动自如,毛发光滑,饮食正常,呼吸道、眼及口腔等处无分泌物外，未发现任何中毒症状，体重均有增加。与空白组对照组，比较，饲喂本复合微生物饮品的小鼠体重明显增加（P＜0.001）。14天观察期结束，将小鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、小肠等脏器均未见明显异常表现。提示本复合微生物饮品属实际无毒类物质，安全度大。
实施例5微生物饮品防醉药效试验
即先对小鼠灌胃药物，经过30 min后再对小鼠灌胃饮用酒。取60只雄性小鼠，随机分为3组，每组20只，3组分别命名为：空白对照组、阳性对照组和微生物组。在试验前先对小鼠禁食12h，然后按照0.15 mL/ l 0g的剂量分别给空白对照组灌胃蒸馏水、阳性对照组灌胃酒无罪药物、微生物组灌胃实施例3生产的微生物饮品，3组试验组要求均在灌胃蒸馏水，酒无罪或微生物饮品30 min后按照0.15 mL/l0g剂量灌胃饮用酒，然后记录3组小鼠翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间，如表3。
表3小鼠防醉药效试验结果
组别 动物 醉酒数 死亡数 醉酒潜伏时间（min） 醒酒时间（min）
空白对照组 20 20 3 7.24±0.88 342.19±15.32
阳性对照组 20 20 0 16.55±2.77 133.98±10.78
微生物饮品组 20 20 0 45±4.12 62.01±7.54
小鼠血液乙醇浓度的测定
为了更好的探究微生物饮品的防醉醒酒机理，试验测定乙醇在小鼠血液中的浓度，结果如表4所示
表4小鼠血液乙醇浓度的测定结果
从表3与表4上可以看出，采用防醉试验的灌胃方式的血乙醇浓度低于醒酒试验的灌胃方式的小鼠血乙醇浓度，因此可得微生物饮品组的防醉与醒酒效果都比较好。一方面微生物饮品中含有聚谷氨酸与多糖物质粘度大，持酒率高，可以减缓小鼠肠胃对乙醇的吸收速度;另一方面微生物饮品中的发酵所产生的多肽，和益生菌等物质增加对进入血液乙醇的代谢速度来达到降低机体血乙醇浓度的效果，从而起到解酒防醉的功效。
实施6实施例3生产的复合微生物饮品对小鼠酒精性肝损伤的保护作用
通过测定复合微生物饮品对酒精性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(alanineaminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活胜和肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等生化指标，研究复合微生物饮品的护肝功效，并从生物化学水平探讨其作用机制，为复合微生物解酒产品的开发与应用提供实验基础和科学依据。
小鼠购买后，经3天适应喂养。取30只小鼠随机分成3组：对照组(Control) ,模型组(Model)和实验组(Experimental，每组10只。分别进行以下实验处理：
对照组：先灌胃0.15m1/20g bw生理盐水，30min后灌胃0.15m1/20g bw生理盐水；
模型组：先灌胃0.15m1/20g bw生理盐水，30min后灌胃0.15m1/20g bw 56 度白酒；
实验组：先灌胃0.15m1/20g bw复合微生物饮品，30min后灌胃0.15m1/20g bw 56度白酒。实验周期为14d，最后1天灌胃后，小鼠禁食12小时，然后进行后续实验。
测定方法：血清ALT, AST活性测定
取上述各组实验小鼠，采用眼眶取血，经3500r/min离心l0min后，取上清。按照试剂盒说明书操作，测定ALT, AST活性。
ALT测定原理：ALA，在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及a-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应30min后(固定时间)加入2,4一二稍基苯肼(DNPH)盐酸溶液，既中止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505nm比读吸光度并计算酶活力。
AST测定原理：AST能使a-酮戊二酸和天冬门氨酸移换氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2,4二硝基苯肼反应生成2,4二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色，比色后，查标准曲线，可求得酶的活力单位。
肝脏组织SOD, MDA酶活测定
各组小鼠取血后处死，立即取出肝脏，生理盐水清洗并擦干，准确称取肝重，按照重量体积比1：9的比例加入生理盐水，制备成10%的匀浆。按照试剂盒说明书操作，分别测定SOD,MDA活性。使用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行蛋白定量。
SOD测定原理：通过黄嘌吟及黄嘌吟氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时发生吸光度变化，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
SOD活力单位：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)o
组织中SOD活力计算公式：
MDA测定原理：过氧化脂质降解的产物丙二醛可与硫代巴比妥酸(TB A )缩合，形成在532nm处有最大吸收峰的红色产物。
组织中MDA含量计算公式：
试验结果一：
由于模型组中，试验过程中有三只小鼠死亡，因此，其数量较对照与实验组少；从表5中可见，模型组ALT, AST活性均极显著高于对照组(P<0.01)，说明酒精性肝损伤模型建立成功；实验组ALT, AST活性虽然都显著高于对照组(P<0.05 )，但是与模型组相比其酶活仍有显著下调(P<0.05 )。说明复合微生物饮品能有效减轻酒精对肝脏的损伤，保护肝脏，从而在一定程度上抑制ALT和AST活性的升高。ALT，和AST是存在于肝细胞浆和线粒体中的转氨酶，当肝细胞严重病变、坏死时，ALT和AST就会渗漏入血，所以血清ALT和AST活性升高为肝细胞损伤的特异性指标。本试验显示，酒精灌胃导致小鼠血清ALT, AST极显著的升高，说明酒精性肝损伤模型造模成功；同时，我们的研究也发现复合微生物饮品可以有效降低血清ALT, AST的水平，防治酒精性肝损伤。其作用原理可能与枯草芽孢杆菌中含有大量的聚谷氨酸，多糖物质，以及发酵过程中产生的小肽物质的激活纤溶、调节凝血等功能有关，但其确切的生化、分子生物学机理还有待于进一步探讨。
表5小鼠血清ALT和AST活性
组别 动物数 ALT AST
对照组 10 141.564±8.998 253.675±49.732
模型组 7 183.241±25.675 355.361±45.334
实验组 10 145.454±10.001 254.234±47.887
试验结果二：肝组织SOD, MDA活性和含量的变化
SOD测定实验结果：从表6中可以看出，与对照组相比，模型组SOD活性有极显著降低(P<0.01)，这是因为模型小鼠长期摄入酒精，肝脏SOD因清除大量自由基和脂质过氧化物而大量消耗；实验组SOD活性虽然显著低于对照组(P<0.05 )，但是与模型组相比酶活仍有极显著上调(P<0.01)a
MDA测定实验结果：从表6中可以看出，与对照组比较，模型组MDA含量有极显著升高( P<0.01 )，肝细胞氧化损伤严重，实验组MDA含量虽然显著高于对照组(P<0.05 )，但是与模型组相比仍有极显著降低(P<0.01) o
表6小鼠肝组织SOD, MDA活性和含量的变化
组别 动物数 SOD MDA
对照组 10 297.698±20.028 0.3554±0.0771
模型组 7 249.917±18.114 0.9235±0.1129
实验组 10 292.452±14.654 0.3871±0.0710
以上结果表明，复合微生物饮品能够有效提高模型小鼠肝脏SOD的活性，同时降低氧化产物MDA的含量。这个结果表明，复合微生物饮品通过提高肝脏抗氧化能力来减少肝损伤。
酒精性肝损伤发病机制复杂，其中氧化应激是最重要的发病机制之一，氧自由基在酒精性肝病的发生发展中发挥重要作用。SOD是体内重要的抗氧化酶可以清除自由基，保护细胞免受损伤。SOD水平的高低可以衡量机体对抗氧自由基能力的大小。MDA是机体进行脂质过氧化作用产生的最终产物，过量的MDA可引起细胞代谢及功能障碍甚至导致细胞死亡，因此组织过氧化损伤的程度可以用MDA来衡量。在本研究中我们发现，模型组小鼠肝组织SOD活性降低，MDA含量增加，我们推测其可能的机制为：机体长期大量摄入酒精后，酒精代谢产生的大量自由基导致SOD被耗竭，机体抗氧化机制受损，不能清除过多自由基，引起自由基大量积累，并进一步导致脂质过氧化，故而MDA含量会增加。实验组小鼠由于灌胃了复合微生物饮品，肝组织SOD活性提高，MDA含量也降低了。说明能够提高肝脏抗氧化能力，减轻自由基和脂质过氧化物对肝脏的损伤。
上述研究结果证实，本发明复合微生物饮品能够有效提高SOD活性，清除自由基，防止脂质过氧化，起到预防与保护酒精性肝损伤的作用。

Claims (1)

1.一种解酒护肝的复合微生物饮品，其特征在于，该复合微生物饮品由枯草芽孢杆菌发酵液30-40份，桃红荚硫菌发酵液30-40份，米根霉发酵液30-40份混合而成；该复合微生物饮品具体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一, 枯草芽孢杆菌发酵液的制备
、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时，种子采用5%的接种量，接种至装液量为2L LB培养基的5L大三角瓶中， 37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过30亿/毫升，即可作为枯草芽孢杆菌液体菌种；
、将步骤培养的枯草芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于100亿/毫升，即可结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L， 蛋白胨8 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钠2.3 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JCD-H-16，该菌种已由本发明的专利权人在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．13663保藏日期为2017年2月16日；
步骤二，桃红荚硫菌发酵液的制备
、半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体紫硫光合细菌培养基中，25-35℃光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的菌种
、种子培养：将活化的菌种接种至种子液体培养基中，温度25-35℃，光照强度为：1000-3000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；
、发酵培养：将种子培养液与桃红荚硫菌发酵培养基以1：4的接种量接种，在光照培养罐中厌氧培养7-10天，培养温度25-35℃，光照强度为：1000-4000lux，搅拌速度为50转/分钟，待检测其OD650≥4，活菌数≥10亿cfu/ml，多糖含量达到5 g/L，即为桃红荚硫菌发酵液；
其中，所述的半固体紫硫光合细菌培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.08g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，苹果酸钠1g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂10g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的种子液体培养基为：氯化铵0.6g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，二水氯化钙0.05g/L，氯化镁0.3g/L，果糖2g/L，醋酸钠2 g/L，甘油0.5g/L，九水硫化钠0.2g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2，其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；
其中，所述的桃红荚硫菌发酵培养基为：玉米黄粉20 g/L，氯化铵0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.4g/L，果糖20g/L，醋酸钠2 g/L，蜂蜜10g/L，硫代硫酸钠1g/L，121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；
其中，桃红荚硫菌由本发明人保藏在中国普通微生物菌种管理中心，编号为CGMCC10344，保藏日期为2015年1月12日；
步骤三，米根霉发酵液的制备
、取出米根霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，28℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中28℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米根霉种子液；
发酵：将上述制备的米根霉种子液以2%的接种量接种至装有300L米根霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养48-72小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即可作为米根霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的米根霉发酵培养基：玉米黄粉40 g/L，葡萄糖10g/L，葛根粉40 g/L，大豆分离蛋白粉10 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.2 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L， pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，米根霉菌种是购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 3.5085；
步骤四，将前面制备的枯草芽孢杆菌发酵液30-40份，桃红荚硫菌发酵液30-40份，米根霉发酵液30-40份混合而成 ，检测其多糖含量不低于1.5 g/L，芽孢含量不低于20亿CFU/ml，即可灌装，作为复合微生物饮品。
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