JP2007222056A - グルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するSaccharomycesCerevisiae株ならびにその使用プロセス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】YAO2032株(受託番号DSM 17789)およびYAO3083株(受託番号DSM 17790)からなる群より選択されるSaccharomyces cerevisiae株のすべての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有する、培養物。
【選択図】なし
Description
(1.発明の分野)
本発明は、Saccharomyces cerevisiae株、ならびにグルタチオンおよびγ−グルタミルシステインを過剰生成するためのプロセスに関する。
グルタチオン(GSH)は、L−グルタミン酸、L−システインおよびグリシンから構成される低分子ペプチドであり、天然の抗酸化物質である。グルタチオンは、1888年に初めて単離され、1921年に正式に命名された。グルタチオンは、動物、植物および微生物を含む生物において広く見出されている。動物細胞におけるその代謝および生理学的機能、ならびにグルタチオンを過剰生成するためのプロセスは、詳しく報告されている(非特許文献1;非特許文献2;および非特許文献3)。グルタチオンは、肝臓保護剤(liver protector)、毒素のスカベンジャーおよび点眼剤において使用されてきた。グルタチオンは、機能性健康食品製品の有望な成分でもある。
本発明の1つの課題は、YAO2032およびYAO3083からなる群より選択されるSaccharomyces cerevisiae株の全ての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物を提供することである。上記培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成し得る特徴的な性質を有する。
(項目1) YAO2032株およびYAO3083株からなる群より選択されるSaccharomyces cerevisiae株のすべての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有し、該YAO2032株は、ドイツ連邦共和国のD38124、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク1bにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)に、受託番号DSM 17789として受託されており、該YAO3083は、ドイツ連邦共和国のD38124、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク1bにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)に受託番号DSM 17790として受託されている、培養物。
(項目2) 項目1に記載の培養物であって、前記株は、YAO3083株である、培養物。
(項目3) 項目1に記載の培養物であって、前記株は、YAO2032株である、培養物。
(項目4) 項目1に記載の培養物を含む、組成物。
(項目5) 項目4に記載の組成物であって、該組成物は、薬学的組成物または食品組成物である、組成物。
(項目6) グルタチオンおよび/またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスであって、該プロセスは、項目1に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物を培養する工程によって特徴付けられる、プロセス。
(項目7) 項目6に記載のプロセスであって、前記微生物は、Saccharomyces cerevisiae YAO3083である、プロセス。
(項目8) 項目6に記載のプロセスであって、前記微生物は、Saccharomyces cerevisiae YAO2032である、プロセス。
(項目9) 項目6に記載のプロセスであって、培養培地が、アミノ酸を含む、プロセス。
(項目10) 項目9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システイン、グリシン、およびグルタミン酸からなる群より選択される、プロセス。
(項目11) 項目10に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システインである、プロセス。
(項目12) 項目9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、0.1%〜0.75%の範囲の濃度を有する、プロセス。
(項目13) 項目9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、醗酵開始から15時間目〜48時間目に前記培養培地に添加される、プロセス。
(項目14) 項目6に記載のプロセスであって、前記培養は、バッチ培養または流加培養である、プロセス。
(項目15) 項目14に記載のプロセスであって、前記培養は、流加培養である、プロセス。
(項目16) 項目6に記載のプロセスであって、前記微生物は、20℃〜40℃の範囲にある温度にて培養される、プロセス。
(項目17) 項目6に記載のプロセスであって、前記微生物は、3〜7の範囲にあるpH値にて培養される、プロセス。
(項目18) 項目6に記載のプロセスであって、前記微生物は、好気性条件下で培養される、プロセス。
(項目19) 項目6に記載のプロセスであって、グルタチオンおよび/またはγ−グルタミルシステインを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、プロセス。
酵母は、グルタチオンを生成し得る。本発明は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを過剰生成し得る、新規かつ安定なSaccharomyces cerevisiae株を提供する。グルタチオンおよび/またはその前駆体を生成するためのプロセスもまた、本発明において例示されている。
実施例において使用される株は、Saccharomyces cerevisiae 1−12(CCRC21727)およびその変異株である。
グリセロールストックされたCCRC21727を、寒天プレート上に配置して、30℃にて2日間培養した。その後、新しい単一コロニーを、4.75mLのYM培地(3g/Lの酵母抽出物、3g/Lの麦芽抽出物、5g/Lのペプトン、10g/Lのデキストロース、pH5.1)中に接種し、30℃にて攪拌速度150rpmで24時間培養した。その培養物のうちの5%を、スクリーニング培地(60g/Lグルコース、30g/Lペプトン、30g/L酵母抽出物、pH5.1)中にさらに接種し、同じ条件下で24時間〜48時間培養した。
新たな単一コロニーを、50mLのYM培地中に接種した。24時間培養した後、その培養物のうちの3%〜5%を、100mLの活性培地(60g/Lのグルコース、12g/Lのペプトン、12g/Lの酵母抽出物、1g/LのMgSO4・7H2O、pH5.1)中に、同じ条件下で接種した。その培養物のうちの5%を、主要培地(55g/Lのグルコース、8.3g/Lの糖蜜、7g/Lのコーンスティープリカー(corn steep liquid)、4g/Lの(NH4)2SO4、6g/LのKH2PO4、2.9g/Lの(NH4)H2PO4、1.5g/LのMgSO4・7H2O、pH5.1)を含む5L醗酵槽中にさらに接種した。一般的な醗酵条件は、温度30℃、攪拌速度500rpm、曝気1L/分であった。
30℃にて3時間新たに培養した培養物を、滅菌リン酸緩衝液で2回洗浄し、その後、30μg/mL〜300g/mLのNTGを添加した。その細胞とNTGとを混合して、15分間そのままにした。リン酸緩衝液で2回洗浄した後の細胞を、1,2,4−トリアゾールと、NaN3と、塩化ベンジルと、メチルグリオキサールとを含む、スクリーニングプレート上に配置した。そのプレートを、変異株をスクリーニングするために、30℃にて3日間〜7日間培養した。
1mLの培養物を、細胞ペレットを収集するために遠心分離した。そのペレットに、酸抽出用の0.1N酢酸を同体積添加した。抽出された細胞を、水中にて10分間煮沸し、氷上に放置した。その上清を得るために、さらに遠心分離を実施した。その上清に、3mLの反応溶液(0.6mMの 5,5’−ジチオビス−2−ニトロ安息香酸(DTNB)、0.1Mのリン酸緩衝液、pH7)を3mL添加し、充分に混合した。10分間反応させた後、その溶液のOD412吸光度を、その反応物のイオウ含有量を評価するためにアッセイした。
上記のような酸抽出溶液を、HPLCアッセイに供した。上記の上清0.5mLに、0.1mLの40mMヨード酢酸および0.2mLの1M NaHCO3を添加した。この混合物を、暗中にて1時間反応させ、その後、一晩反応のために、着色剤である0.5mLの1.5% 1−フルオロ−2,4−ジニトロ−ベンゼン(FDNB)を添加した。その後、その反応溶液を、12,000rpmにて5分間遠心分離して濾過した。HPLC条件を、下記に列挙した(Schofield,J.D.およびX.Chen.1995.J.Cereal Science.21:127−136):
移動相:緩衝液A:80%メタノール;
緩衝液B:200mLの酢酸ナトリウム溶液(122mLの水と378mLの氷酢酸との中にある272gの酢酸ナトリウム三水和物)および800mLの緩衝液A
クロマトグラフィーカラム:LichrosorbTM NH2カラム
流量:1mL/分間
検出器:UV検出器(365nm)。
Saccharomyces cerevisiae 1−12(CCRC21727)を、NTG変異誘発に供し、その変異株を、酸化剤および/または毒素(1,2,4−トリアゾール、NaN3、塩化ベンジル、およびメチルグルオキサール)によってスクリーニングした。NTGと、酸化剤および/または毒素の量が多く使用されるほど、グルタチオンの収量が高かった。Saccharomyces cerevisiae 1−12の野生株(CCRC21727)のグルタチオン収量は、5mg/g乾燥細胞〜8mg/g乾燥細胞であった。4世代の変異誘発およびスクリーニングの後、グルタチオン収量が25mg/g乾燥細胞〜26mg/g乾燥細胞であるYAO2032と、グルタチオン収量が34mg/g乾燥細胞であるYAO3083を、約8,000個の変異株から得た。理解され得るように、本発明の株のグルタチオン収量は、約4倍高かった。このプロセスおよび系統図を、図1に示す。
野生型株であるSaccharomyces cerevisiae 1−12(CCRC21727)、ならびにYAO2032およびYAO1176を、30世代にわたって連続継代し、それらの収量を評価した。
グルタチオン生成を改良するために、L−システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、カザミノ酸、およびペプトンを、YAO2032の醗酵開始時または培養15時間目に、培養培地に添加した。412nmでの吸光度の結果を、図3に示す。この図は、細胞内イオウ含有量が、開始時に上記アミノ酸を添加した場合に少し改善されたことを示す。しかし、これらのイオウ含有量は、非常に増加した。システインを添加することにより最良の効果が得られることに、注意すべきである。
YAO3083を、本実施例において利用した。そのバッチ培養における結果を、図6に示す。40時間のバッチ培養の後、乾燥細胞重量当たりのグルタチオン生成および細胞溶液の体積当たりのグルタチオン濃度の両方を、定常期において得た。1L当たりの乾燥細胞重量は、約15gであった。グルタチオン濃度は、0.3g/Lであった。乾燥細胞重量当たりのグルタチオン重量は、30mg/g乾燥細胞重量であった。一方、γ−グルタミルシステイン生成が、少し増加した。
本発明は、Saccharomyces cerevisiae YAO2032株またはYAO3083株の生物学的に純粋な培養物を提供する。この培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有する。この培養物を含む組成物もまた、提供される。グルタチオンおよび/またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスもまた、提供される。
Claims (19)
- YAO2032株およびYAO3083株からなる群より選択されるSaccharomyces cerevisiae株のすべての特徴を含む微生物株の生物学的に純粋な培養物であって、該培養物は、グルタチオンおよびその前駆体であるγ−グルタミルシステインを生成することが可能な特徴的性質を有し、該YAO2032株は、ドイツ連邦共和国のD38124、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク1bにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)に、受託番号DSM 17789として受託されており、該YAO3083は、ドイツ連邦共和国のD38124、ブラウンシュヴァイク、マッシャーオーダーヴェーク1bにあるドイチェ ザムルング フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツゥーレン ゲーエムベーハー(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)に受託番号DSM 17790として受託されている、培養物。
- 請求項1に記載の培養物であって、前記株は、YAO3083株である、培養物。
- 請求項1に記載の培養物であって、前記株は、YAO2032株である、培養物。
- 請求項1に記載の培養物を含む、組成物。
- 請求項4に記載の組成物であって、該組成物は、薬学的組成物または食品組成物である、組成物。
- グルタチオンおよび/またはその前駆体であるγ−グルタミルシステインの生成のためのプロセスであって、該プロセスは、請求項1に記載の微生物株の生物学的に純粋な培養物を培養する工程によって特徴付けられる、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記微生物は、Saccharomyces cerevisiae YAO3083である、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記微生物は、Saccharomyces cerevisiae YAO2032である、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、培養培地が、アミノ酸を含む、プロセス。
- 請求項9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システイン、グリシン、およびグルタミン酸からなる群より選択される、プロセス。
- 請求項10に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、システインである、プロセス。
- 請求項9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、0.1%〜0.75%の範囲の濃度を有する、プロセス。
- 請求項9に記載のプロセスであって、前記アミノ酸は、醗酵開始から15時間目〜48時間目に前記培養培地に添加される、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記培養は、バッチ培養または流加培養である、プロセス。
- 請求項14に記載のプロセスであって、前記培養は、流加培養である、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記微生物は、20℃〜40℃の範囲にある温度にて培養される、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記微生物は、3〜7の範囲にあるpH値にて培養される、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、前記微生物は、好気性条件下で培養される、プロセス。
- 請求項6に記載のプロセスであって、グルタチオンおよび/またはγ−グルタミルシステインを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、プロセス。
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