CN116987614B - 寡养单胞菌及其在制作窖泥中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于白酒酿造技术领域，具体涉及寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19及其在制作窖泥中的应用，该菌株于2022年12月9日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20221907。本发明通过在人工窖泥培养时加入寡养单胞菌J19可分解酵母浸粉、豆粕粉和大曲粉等原料中的蛋白质产生氨态氮，不但可使人工窖泥的pH持续维持在6.0～7.5的最佳范围内，而且为窖泥己酸菌、丁酸菌等有益微生物的生长提供速效氮源，有利于窖泥质量和酿酒质量的提高。
Description
技术领域
本发明属于白酒酿造技术领域，具体涉及寡养单胞菌及其在制作窖泥中的应用。
背景技术
窖泥作为浓香型白酒发酵容器——窖池的重要构成部分，窖泥中所栖息的酿酒功能微生物对浓香型白酒风格的形成起着决定性作用。pH是影响窖泥质量的重要因素之一，其主要通过改变细胞膜电荷、环境中有机物离子化作用以及酶活来影响窖泥微生物各种生理代谢活动。研究发现：优质窖泥的pH值多集中在6.0～7.5范围内，而当窖泥pH低于4.5时则窖泥质量明显下降，pH过低不但不利于窖泥功能微生物的生长代谢，且易造成窖泥钙化板结。
目前对人工窖泥pH的调节，主要采用在培养人工窖泥时向窖泥中加入碱性化学物质的方式，比如加入氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液，但这种调节pH的方式只能在短期内有效，无法持续维持窖泥正常pH，往往经过一到两轮次生产，待碱性物质被窖泥中微生物代谢产生的有机酸中和消耗完毕，窖泥pH又会明显降低。因此，寻求一种能够持续调节窖泥pH、且提高窖泥质量的有效方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株寡养单胞菌J19，在人工窖泥培养中，该菌可利用窖泥制作原料中的蛋白质产生氨态氮，不但可以调节窖泥pH，而且可为酿酒功能微生物的生长繁殖提供速效氮源，从而提高窖泥质量。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：寡养单胞菌(Stenotrophomonasterrae)J19，所述寡养单胞菌J19于2022年12月9日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20221907。
本发明还提供一种上述的寡养单胞菌J19在制作窖泥中的应用。
进一步的，所述窖泥用于挂窖酿酒。
进一步的，所述应用的方法为：在窖泥制作的过程中，添加所述寡养单胞菌J19。
进一步的，所述应用的具体方法为：
S1、称取原料并加无菌水混匀至含水量36％～40％；其中所述原料按质量份数比包括黄泥50-70份、窖皮泥18-22份、老窖泥2-5份、泥炭2-5份、丢糟7-9份、粮糟7-9份、大曲粉1-3份，豆粕粉1-3份、酵母浸粉0.2-0.7份、黄水2-4份、寡养单胞菌J19菌剂1.2～6份；优选的，所述原料按质量份数比包括黄泥60份、窖皮泥20份、老窖泥3份、泥炭3份、丢糟5份、粮糟5份、大曲粉2份，豆粕粉1.5份、酵母浸粉0.5份、黄水3份、寡养单胞菌J19菌剂6份。
S2、收拢成堆，进行厌氧发酵40～50天即可。优选的，所述厌氧发酵采用塑料薄膜覆盖密封即可。
进一步的，所述无菌水的制作方法为：80-90℃冷却后得到的40-50℃的水。
进一步的，所述寡养单胞菌J19菌剂的制备方法包括：将所述寡养单胞菌J19菌体进行扩大培养得到。
进一步的，所述扩大培养的温度为20～30℃，时间为4～6天，接种量为4～6％。
进一步的，所述扩大培养的培养基配方按质量份数比为：蛋白胨5份、磷酸氢二钾0.2份、氯化钠0.25份、氯化钾0.3份、硫酸镁0.5份、硫酸亚铁0.01份、蒸馏水1000份，并加氢氧化钠调节pH值至8.0。
优选的，所述扩大配方的方法具体为：在保藏寡养单胞菌J19的试管斜面上挑取一环菌体接种于装有200ml培养基的三角瓶中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成一级种子液。将一级种子液按5％的接种量接种于培养基中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成二级种子液，将二级种子液按5％的接种量接种于培养基中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成菌剂。
本发明的有益效果是：本发明通过在人工窖泥培养时加入高产氨态氮寡养单胞菌J19菌剂，寡养单胞菌J19可分解酵母浸粉、豆粕粉和大曲粉等原料中的蛋白质产生氨态氮，不但可使人工窖泥的pH持续维持在6.0～7.5的最佳范围内，而且为窖泥己酸菌、丁酸菌等有益微生物的生长提供速效氮源，有利于窖泥质量和产酒质量的提高。
附图说明
图1为构建的系统发育树；
图2为寡养单胞菌J19菌体形态图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1寡养单胞菌J19菌种的分离筛选
1、富集培养
称取10.0g优质老窖泥样品于蓝盖瓶中，加入100mL无菌水和无菌玻璃珠，摇床上充分振荡30min，可适当用无菌玻璃棒将窖泥打散，制成窖泥悬液。量取窖泥悬液10mL转移到盛有90mL富集培养基的蓝盖瓶中，在30℃条件下培养7d，得到产氨菌富集液，连续取样转接富集培养5次。
所述富集培养基配方为：蛋白胨5g、磷酸氢二钾0.2g、氯化钠0.25g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L，用盐酸调节培养基pH值至4.0。
2、菌种分离
选取第5次富集培液作为菌源，采用10倍稀释法得到不同稀释度的菌液，选用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度涂布平板。接种后倒置于30℃恒温培养箱中，培养2～3d至单一菌落形成。用四区划线法纯化，划完后倒置于30℃恒温培养箱中，培养1～2d，反复划线接种纯化四次，直至纯化出单个菌株。
3、初筛
将在平板上纯化出的菌株用无菌接种环挑出加入培养基中活化培养3d制备菌悬液，吸取少量培养液在白瓷比色板中，滴加1-2滴纳氏试剂后若出现红棕色或黄色沉淀证明培养液中有氨化细菌存在。
4、复筛
将初筛得到的氨化菌按5％的接种量分别接种于培养基(pH7.0)中，培养5d，得到产氨菌纯种培养菌液，培养结束后测定氨态氮含量。选取氨态氮产量高的菌株J19于4℃保藏备用。
5、菌种鉴定
将氨态氮产量高的菌株J19进行分子生物学菌种鉴定，鉴定过程中，使用的引物如下：
27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’；
鉴定得到的基因序列如下：
GGCAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATG
GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTG
CGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGAT
GGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCCACCATTGTAG
TACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC
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将测序结果利用BLAST程序在GenBank数据库中进行比对，利用Mega软件构建系统发育树，经鉴定该菌株为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)
将其命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19，并于2022年12月09日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20221907。
实施例2寡养单胞菌J19菌剂的制备
在保藏寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19的试管斜面上挑取一环菌体接种于装有200ml培养基的三角瓶中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成一级种子液。将一级种子液按5％的接种量接种于培养基中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成二级种子液，将二级种子液按5％的接种量接种于培养基中，在25℃恒温条件下静置培养5天，制成菌剂。
所述培养基配方为：蛋白胨5g、磷酸氢二钾0.2g、氯化钠0.25g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、蒸馏水1L，用氢氧化钠调节培养基pH值至8.0。
实施例3寡养单胞菌J19菌剂在人工窖泥培养中的应用
取晒干的黄泥60吨，正常使用的窖皮泥20吨，正常使用的老窖泥3吨，泥炭3吨，发酵正常的丢糟5吨，发酵正常的粮糟5吨，发酵正常的大曲粉2吨，豆粕粉1.5吨，酵母浸粉0.5吨。将上述固态物料搅拌混合均匀，称取3吨菌剂、3吨发酵正常的黄水和16吨沸水(即无菌水)均匀泼洒于混合好的固态物料上，搅拌均匀后收拢成堆，用塑料薄膜密封发酵40～50天，即得到人工窖泥，可用于挂窖酿酒。
实施例4寡养单胞菌J19菌剂在人工窖泥培养中的应用效果
将采用本发明方案制作的人工窖泥和对比窖泥用于酿酒效果验证，并对采用本发明方案制作的人工窖泥和对比窖泥的各项指标进行分析检测，以评价采用本发明方案制作的人工窖泥效果。酿造产酒1次为1排，共连续进行6排酿造。
所述对比窖泥为在制作时将质量份数为3份的菌剂替换成质量份数为5份人工窖泥功能菌培养液，并相应减少沸水加入量，其他制作原料和制作方法同采用本发明方案制作的人工窖泥。
其中，人工窖泥功能菌培养液富含己酸菌、丁酸菌等酿酒功能微生物，是目前白酒行业制作人工窖泥时普遍使用的物料，以提高人工窖泥质量。其制作方法为在己酸菌培养基中按10％(w/w)的接种量接入优质老窖泥，搅拌均匀后在35-37℃条件下静置密封发酵9-15天。
所述己酸菌培养基为：酵母膏0.1％、硫酸铵0.5％、乙酸钠0.9％、硫酸镁0.03％、磷酸氢二钾0.1％、无水乙醇2％，pH6～7。
1、本发明方案窖泥和对比窖泥质量指标对比
表1发明方案窖泥和对比窖泥质量指标一览表
从表1可以看出，在进行6排酿酒生产后，采用本发明方案制作的人工窖泥的pH与酿酒使用前相比略有提高，仍然稳定在pH6.0～7.5的最佳范围内，非常适合己酸菌、丁酸菌等酿酒功能性微生物的生长繁殖和代谢产酸。同时，采用本发明方案制作的人工窖泥的氨态氮含量与酿酒使用前相比由168.4mg/100g干泥提高到了241.1mg/100g干泥，提高了43.2％。氨态氮含量的提高不仅使窖泥的pH稳定在6.0～7.5的最佳范围内，而且可以为窖泥微生物的生长提供速效氮源，促进酿酒微生物的生长和代谢。这也可从酿酒使用前后采用本发明方案制作的窖泥其产酸能力和耐热芽孢杆菌数都有明显的提高得到验证。
从表1也可以看出，经过6排酿酒生产后，对比窖泥的氨态氮含量和pH都有明显的降低，pH仅为4.5，较低的pH严重影响窖泥微生物的生长和代谢。对比窖泥的产酸能力和耐热芽孢杆菌数都有明显的减少，窖泥质量下降。
为了进一步验证采用本发明方案制作的窖泥，用于酿酒的效果。对使用两种窖泥所酿白酒的感官指标和理化指标进行了检测，结果如下：
2、采用本发明方案窖泥和对比窖泥所酿白酒感官特征对比
参照《白酒分析方法》(GB/T 10345-2007)。由5名取得国家一级品酒师资格的专业尝评人员对酒液的己酸乙酯香气典型性、以己酸乙酯为主体的复合香气浓郁程度、口感醇厚度进行评价评分，评价评分取值范围为0-10分，结果见表2。
表2本发明方案窖泥酿酒各感官指标评分
表3对比窖泥酿酒各感官指标评分
表4感官测定各指标综合评语及平均分结果
从表4可以看出，经5名取得国家一级品酒师资格的专业品酒师尝评打分，采用本发明方案窖泥所酿白酒的己酸乙酯香气典型性、复合香气浓郁程度和口感醇厚度得分均显著高于采用对比窖泥所酿白酒。这是因为本发明通过在人工窖泥培养时加入高产氨态氮寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19菌剂，寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19可分解酵母浸粉、豆粕粉和大曲粉等原料中的蛋白质产生氨态氮，不但可使人工窖泥的pH持续维持在6.0～7.5的最佳范围内，而且为窖泥己酸菌、丁酸菌等有益微生物的生长提供速效氮源，酿酒功能微生物的生长繁殖和风味物质的代谢，使酒体中的风味物质含量更高，且各风味物质之间的含量比例更协调。
3、采用本发明方案窖泥和对比窖泥所酿白酒理化指标对比
将采用本发明方案窖泥和对比窖泥酿造的白酒送至具有CMA检测资质的四川依柳源技术检测有限公司，采用气相色谱法测定酒中香味成分含量，结果见表5。
表5采用本发明方案窖泥和对比窖泥所酿白酒理化指标检测结果
从表5可以看出，在摘酒酒精度相同的情况下，采用本发明方案窖泥所酿白酒的总酸、总酯以及己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等风味成分含量均高于采用对比窖泥所酿白酒，且比例也更协调，这与采用两种窖泥所酿白酒的感官尝评结果相一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.寡养单胞菌(Stenotrophomonas terrae)J19，其特征在于，所述寡养单胞菌J19于2022年12月9日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20221907。
2.权利要求1所述的寡养单胞菌J19在制作窖泥中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述窖泥用于挂窖酿酒。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：在窖泥制作的过程中，添加所述寡养单胞菌J19。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：
S1、称取原料并加无菌水混匀至含水量36％～40％；其中所述原料按质量份数比包括黄泥50-70份、窖皮泥18-22份、老窖泥2-5份、泥炭2-5份、丢糟7-9份、粮糟7-9份、大曲粉1-3份，豆粕粉1-3份、酵母浸粉0.2-0.7份、黄水2-4份和寡养单胞菌J19菌剂1.2～6份；
S2、收拢成堆，进行厌氧发酵40～50天即可。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述无菌水的制作方法为：80-90℃冷却后得到的40-50℃的水。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述寡养单胞菌J19菌剂的制备方法包括：将所述寡养单胞菌J19菌体进行扩大培养得到。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述扩大培养的温度为20～30℃，时间为4～6天，接种量为4～6％。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述扩大培养的培养基配方按质量份数比为：蛋白胨5份、磷酸氢二钾0.2份、氯化钠0.25份、氯化钾0.3份、硫酸镁0.5份、硫酸亚铁0.01份和蒸馏水1000份，并加氢氧化钠调节pH值至8.0。
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