CN105861348A - 一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用，属于酒类酿造以及食品安全领域。本发明的一株低产尿素的酿酒酵母是从白酒发酵环境(大曲)中分离得到，命名为Saccharomyces cerevisiae JZ109，于2016年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12417。本发明的菌株具有低产尿素、产风味、高产乙醇、耐酒精、耐酸、耐高温、耐高糖的特征，是优良的酿酒功能菌株，可应用于酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域，保证食品安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用，属于酒类酿造以及食品安全领域。
背景技术
传统食品在发酵过程中会不可避免地产生一种代谢副产物，即氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，EC)。氨基甲酸乙酯的产生是由于发酵过程中微生物代谢所产生的或来自原料当中的尿素、瓜氨酸等与乙醇自发发生化学反应所形成的。形成EC的前体物质主要有尿素，氰化物以及瓜氨酸，而尿素是目前公认的酒精饮料当中EC形成的主要前体物质，如黄酒，葡萄酒等。在中国白酒发酵过程中，EC形成的主要前体物质也被证实是尿素，其在酒醅中的含量为26～80mg/kg。
尿素主要是由酵母代谢精氨酸所产生的，由于国外的酒精饮料大多是单菌发酵或者少数菌株共同参与的发酵，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在发酵过程中发挥主体作用。因此，大多数的研究集中在酿酒酵母，并得出酿酒酵母是饮料酒中尿素和乙醇产生的主要菌株。Saccharomyces cerevisiae为重要的尿素产生菌株，其在发酵过程当中所产生的大量尿素会导致发酵过程中EC的形成，从而产生安全问题。目前尽管有关于低产尿素的酿酒酵母的报道，但是这些酿酒酵母在产乙醇和风味能力、以及环境耐受能力等方面却并不理想，限制了其在食品生产中的应用。因此，获取低产尿素且具有产风味功能并能适应多种食品生产环境的Saccharomyces cerevisiae，对于以酵母作为主要功能微生物的发酵食品的生产就显得尤为重要，对于食品安全具有重要贡献。
发明内容
为了解决上述问题，本发明筛选得到了一株低产尿素的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeJZ109，是从多种香型白酒发酵环境(大曲)当中筛选的。该菌株是从中国白酒酿造过程中获得，具有产风味、产酒精、耐酸等特性，是优良的酿酒功能菌株，能够有效应用于酿造酒、蒸馏酒、配制酒及其它食品领域，降低食品发酵过程尿素和EC的形成，从而解决食品安全问题。
本发明的第一个目的是提供一株Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，于2016年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.12417。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株是从白酒自然发酵过程中(大曲)分离筛选得到的。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，低产尿素且具有产风味功能并能适应食品发酵环境。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，可通过所有适合酵母生长的的培养基进行培养(其中在WL固体培养基上生长菌落如图1)。培养方式选用静置培养或振荡培养，温度4-46℃，培养时间足够微生物的生长即可。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，经高粱培养基发酵48h后代谢风味物质中醇类达41609.34μg/L、酯类达5365.91μg/L、酮类达1562.31μg/L、醛类达89.93μg/L、苯环类达176.81μg/L、酸类达406.32μg/L、萜烯类达712.34μg/L。其中各主要风味物质中，以醇类物质为最多，如苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、正丙醇、异戊醇、乙醇；另外，其酯类也为最主要的风味物质，其中，乙酸乙酯含量最高，其次为2-苯乙基乙酸酯、丙酸乙酯、己酸乙酯。另外，本酿酒酵母所产风味物质中，萜烯类物质相对其他菌种而言，所占比例较高，如：里哪醇、β-法呢烯、α-松油醇、红没药烯、α-法呢烯、香茅醇、7-甲基-3-次甲基-6-辛烯-1-醇、法呢醇、香叶醇、橙花叔醇2、红没药醇、法呢醇、β-大马酮。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，生长温度范围为4-42℃，适温为25-33℃；生长pH范围为2.3-12.0，优选4.0-8.0，可在分别含60％的葡萄糖以及14％乙醇的环境生长。
所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，其产乙醇能力为38.91g/L，远高于对照菌株Saccharomyces cerevisiae SC-288C的21.10g/L
本发明的第二个目的是提供含有所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌体的活细胞、冷冻干燥得到的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417干菌体、固定化的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417细胞、Saccharomyces cerevisiae CGMCCNO.12417的液体菌剂、Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株。这些形式的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，均能在乙醇浓度0-14％，温度10-42℃，糖浓度0-60％及pH 2.3-11进行培养，并能产风味。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417的液体菌剂的制作方法，是将Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株接种于液体酵母菌剂培养基中，于30℃培养24h；所述液体酵母菌剂培养基配方为A或者B；其中，
A：以g/L计，含有酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、其余为水；
B：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:1-1:4w/v的比例混合，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10-50单位/g原料，于40-80℃保持2-10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为10-150Bx、pH为4-6；其中，原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合。
在本发明的一种实施方式中，所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417的固体菌剂的制作方法，是将活化后的菌株以10％接种比例接种于固体酵母菌剂培养基中，30℃培养24-36h；所述液体酵母菌剂培养基配方为C或D；其中，
C：原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合；原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:0.5-1：2w/v的比例混合后，80-100℃蒸煮30min；
D：在高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合得到的发酵原料，蒸煮1-5h，加入0.1-1mol/L NaOH溶液调节酸度为0-5。
本发明的第三个目的是提供所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株的应用，是应用于食品技术领域，尤其是发酵食品技术领域。
所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面，尤其是芝麻香型麸曲白酒。
所述应用，是将Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。
所述应用，是将Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株添加到种子(曲或者种子培养液)中，比如添加到酵母麸曲中。
本发明的第四个目的是提供一种降低EC的方法，所述方法是将Saccharomyces cerevisiaeCGMCC NO.12417菌株添加到食品制备过程中。
本发明的有益效果：
本发明得到了一株低产尿素、产风味、高产乙醇、耐酒精、耐酸、耐高温、耐高糖的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株，利用该酵母在酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域的应用可在一定程度上减少尿素和EC的形成。本发明的菌株，可在分别含60％的葡萄糖、2.0％的KCl以及14％乙醇的环境生长，尿素产量远远低于现有的其他Saccharomycescerevisiae CGMCC菌株，而且产风味能力强。本发明菌株在发酵过程中尿素产生的最大值为145.05μg/L，远低于其他同种的菌株，比如模式菌株的最大值为1640.38μg/L。
生物材料保藏
酿酒酵母，分类学命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2016年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12417。
附图说明
图1：Saccharomyces cerevisiae JZ109酵母在WL培养基上的菌落形态；
图2：Saccharomyces cerevisiae Z109酵母26S rDNA扩增凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1：低产尿素的酵母Saccharomyces cerevisiae的筛选及鉴定
取10g大曲溶于100ml无菌生理盐水中，摇床振荡30分钟后进行梯度稀释，涂布WL固体平板，根据平板上菌落形态特征(图1)，挑取Saccharomyces cerevisiae酵母单菌落进行高通量液体发酵，对获得的潜在的低产尿素Saccharomyces cerevisiae酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物NL1和NL4分别扩增酵母的26S rDNA的片段，凝胶电泳检测(图2)。随后进行测序比对，确定所筛选得低产尿素的酵母在分类学上都属于Saccharomyces cerevisiae酵母。最终所得到一株低产尿素的酿酒酵母，命名为Saccharomycescerevisiae JZ109。将Saccharomyces cerevisiae JZ109保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12417。
WL培养基：酵母浸粉4.0g/L，胰蛋白陈5.0g/L，葡萄糖50.0g/L，磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425g/L，氯化钙0.125g/L，硫酸镁0.125g/L，氯化铁0.0025g/L，硫酸锰0.0025g/L，琼脂20g/L，嗅甲酚绿22mg/L。
实施例2：菌株代谢产风味的功能
种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株Saccharomyces cerevisiae JZ109，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。
发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基的250ml三角瓶中，自然pH，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵48h。
运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法对挥发性产物进行分析，取8mL样品，放入装有3g NaCl的顶空进样瓶中，加入10μL浓度为42.60mg/L的4-甲基-2-戊醇为内标。将顶空瓶于50℃恒温萃取45min，萃取完后进行GC-MS分析。
上述实施例1获得的菌株，其发酵48h后代谢产风味的能力为如表1所示。
表1风味物质含量(μg/L)
各主要风味物质中，醇类物质为最多，其中苯乙醇30878.63μg/L、3-甲基-1-丁醇8341.32μg/L、2-甲基-1-丙醇2106.32μg/L、正丙醇3621.95μg/L、异戊醇4561.56μg/L、乙醇6859.36μg/L；另外，其酯类也为最主要的风味物质，其中，乙酸乙酯含量最高为1962.63μg/L，2-苯乙基乙酸酯1089.09μg/L、丙酸乙酯156.53μg/L、己酸乙酯146.23μg/L。另外，本酿酒酵母所产风味物质中，萜烯类物质相对其他菌种而言，所占比例较高，其中，里哪醇21.36μg/L、β-法呢烯68.69μg/L、α-松油醇18.34μg/L、红没药烯16.31μg/L、α-法呢烯20.3μg/L、香茅醇67.31μg/L、7-甲基-3-次甲基-6-辛烯-1-醇49.32μg/L、法呢醇18.69μg/L、香叶醇15.68μg/L、橙花叔醇264.31μg/L、红没药醇6.95μg/L、法呢醇149.65μg/L、β-大马酮19.32μg/L。
实施例3：Saccharomyces cerevisiae JZ109酵母低产尿素
种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。
发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基(添加1000mg/L的精氨酸前体物质)的250ml三角瓶中，接种量为1％，30℃，200rpm，发酵48h，测定发酵过程中酵母生长情况(OD600)和尿素生成情况。发现该菌株在发酵过程12h进入稳定期(OD600为1.2)，发酵过程中尿素产量达到的最大值为145.05μg/L(8h)。
尿素检测：采用柱前衍生高效液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)进行测定发酵液尿素的含量。具体操作为：500μl发酵液加入500ml的无水乙醇，400μl9-羟基吨溶液以及100μl的0.1M盐酸溶液，摇匀，室温避光衍生30min。
实施例4：Saccharomyces cerevisiae JZ109与Saccharomyces cerevisiae SC-288C产乙醇情况对比
种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株Saccharomyces cerevisiae JZ109，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。
发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基的250ml三角瓶中，自然pH，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵120h。测定发酵过程中生物量(OD600)及产乙醇能力情况。发酵终点时，Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株产乙醇能力为38.91g/L，而对照菌株Saccharomyces cerevisiae SC-288C菌株产乙醇能力为21.10g/L.
乙醇检测：采用安捷伦1200型号高效液相色谱(HPLC)进行测定发酵液乙醇含量的测定。具体操作为：取700μL样品和700μL的10％TCA沉淀蛋白半小时，取上清混合液1000μL，加入3000μL流动相，过0.45μm滤膜。
实施例5：Saccharomyces cerevisiae JZ109与Saccharomyces cerevisiae SC-288C产尿素情况对比
种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株以及模式菌株Saccharomyces cerevisiae SC-288C(中国普通微生物菌种保藏中心)，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。
发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基(添加1000mg/L的精氨酸、)的250ml三角瓶中，接种量为1％，30℃，200rpm，发酵48h，测定发酵过程中酵母生长情况(OD600)以及尿素生成情况。发现本发明的Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株在发酵过程中尿素产生的能力明显小于模式菌株Saccharomyces cerevisiae SC-288C，本发明的菌株在发酵过程中尿素产生的最大值为145.05μg/L，而模式菌株在发酵过程中尿素产生的最大值为1640.38μg/L。
实施例6：菌株生理生化性质
生长温度范围为4-42℃，适温为25-33℃；生长pH范围为2.3-12.0，优选4.0-8.0，可在分别含60％的葡萄糖以及14％乙醇的环境生长中。
将上述实施例1获得的Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株，接种于YPD液体培养基中，30℃培养24h，然后用无菌生理盐水稀释至OD600为1，吸取0.5ml菌液至50ml耐受性培养基中。
温度耐受性培养基：YPD培养基，分别于30℃，37℃，40℃，42℃以及46℃进行静止培养48h。结果显示本发明的Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株能够在温度范围为30-46℃进行生长。
酸度耐受性培养基：YPD培养基，用0.1M HCl调节培养基pH，使其成pH分别为2.9，2.7，2.5，2.4，2.3，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株能够在pH范围为2.9-2.3进行生长。
酒精度耐受性培养：YPD培养基，加入酒精，使其成酒精度含量分别为0，4％，6％，8％，10％，12％，14％，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Saccharomycescerevisiae JZ109菌株能够在酒精度范围为0-14％进行生长。
糖度耐受性培养基：YPD培养基，加入不同质量的葡萄糖，使其成葡萄糖浓度分别为1％,40％，50％，60％，65％，70％，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Saccharomycescerevisiae JZ109菌株能够在葡萄糖浓度范围为0-60％进行生长。
实施例7：Saccharomyces cerevisiae JZ109在芝麻香白酒中的应用
将本发明的菌株Saccharomyces cerevisiae JZ109制作成液体菌剂，其制作方法是将Saccharomyces cerevisiae JZ109菌株接种于液体酵母菌剂培养基中，于30℃培养24h；所述液体酵母菌剂培养基配方为A或者B；其中，
A：以g/L计，含有酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、其余为水；
B：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:1-1:4w/v的比例混合，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10-50单位/g原料，于40-80℃保持2-10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为10-150Bx、pH为4-6；其中，原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合。
将液体菌剂添加进入芝麻香白酒麸曲制作的原料当中，等麸曲制作完成之后，加入酒醅当中进行发酵，发酵完成后，检测白酒生产发酵后期酒醅及原酒里面尿素与EC的含量，发现添加Saccharomyces cerevisiae JZ109的麸曲，在进行生产时，能显著减少酒醅和原酒中尿素20～50％，同时，EC减少量为15～45％，原酒里面EC的减少量为15％～35％，说明添加权利一所述的菌株确实能达到减少食品当中尿素及EC的含量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417，于2016年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12417。
2.根据权利要求1所述的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417，其特征在于，所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417具有低产尿素、产风味物质、产酒精的特性。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有Saccharomyces cerevisiae CGMCCNO.12417菌体的活细胞、冷冻干燥得到的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417干菌体、固定化的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417细胞、Saccharomyces cerevisiaeCGMCC NO.12417的液体菌剂、Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417菌株。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任何能够应用于食品或者食品制备的任意种属的菌。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。
6.权利要求1所述Saccharomyces cerevisiae CGMCC NO.12417或者权利要求2所述的微生物菌剂在食品技术领域的应用，尤其是发酵食品方面的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是应用于酿造酒、蒸馏酒。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将Saccharomyces cerevisiaeCGMCC NO.12417添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将Saccharomyces cerevisiaeCGMCC NO.12417添加到种子中。
10.一种降低EC的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1的Saccharomycescerevisiae CGMCC NO.12417添加到食品制备过程中。
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