CN105176854A - 一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株JH301(Saccharomyces？cerevisiae)，该酿酒酵母菌株JH301(Saccharomyces？cerevisiae)于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO:M？2015226。该菌株JH301不仅具有低产尿素、低产杂醇油、低产酸、高耐受酒精等能力、还可在10℃低温下酒精发酵，综合发酵性能优良；利用该菌株JH301生产红曲黄酒，可提高红曲黄酒的发酵品质与安全性，具有广阔的应用前景。

Description

一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株。

【背景技术】

红曲黄酒是福建特产，具有红曲香与醇香的幽雅混合香，口感醇正、协调、柔和，具有抗氧化、降血压、降胆固醇和增强免疫力等生理功效，是一种具备健康饮品、烹饪调味品及药引子等功能的发酵酒，具有广阔的市场前景。酿造红曲米是红曲黄酒酿造的主要发酵剂，其微生物来源于人工接种及制备环境的开放式自由落菌，含有曲霉、酵母菌和乳酸菌等多种微生物。而酵母品种好坏直接决定所酿黄酒品质的优劣。由于不同环境和工艺生产的红曲米菌群差异性较大，因此传统工艺酿造的红曲黄酒在酒精发酵过程中占主导的酵母种类并不固定，这不但易导致传统工艺酿造的红曲黄酒存在总酸较高、每批次品质不一等缺陷，还可能导致红曲黄酒产品含有较高的氨基甲酸乙酯、杂醇油等有害物质，增加了红曲黄酒的安全隐患。

红曲黄酒酿造优良酵母菌应具备以下几个特性：(1)酒精发酵能力强，耐酒精能力等生理耐性好，能够抵抗不良环境。(2)低产尿素水平。氨基甲酸乙酯(EthylCarbamate，简称EC)，具有遗传毒性和致癌性是酒精饮料的伴生物之一。近年的研究结果表明，黄酒中90％的EC是由酵母菌、乳酸菌的代谢产物尿素和乙醇反应生成的。因此，选育低产或不产尿素酵母对提高黄酒安全性具有重要的意义。(3)低产杂醇油水平。杂醇油含量过高时,不仅会给酒带来异杂味,还会使消费者饮后头痛、头晕、发坠。有研究结果表明，酵母种类对酒类杂醇油生成量影响较大。因此，选育低产杂醇油酵母对提高黄酒品质具有重要的意义。(4)能在10℃低温下发酵。红曲黄酒一般于冬至前后开酿，此时气温较低，平均发酵温度在10-15℃。因此优良的黄酒酵母须能在低温下快速繁殖，以便缩短迟缓期，防止产酸细菌的侵袭。(5)综合发酵性能优良，其残糖水平应符合GB/T13662-2008《黄酒》优级干型酒的要求。

为解决上述红曲黄酒酿造过程中存在的产品缺陷和技术瓶颈，本申请人进行了深入研究，希望能选育出适用于红曲黄酒酿造工艺及品质要求的专用酵母菌株，从而为高品质红曲黄酒的酿造提供优质微生物资源和技术支持。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母JH301(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母JH301(Saccharomycescerevisiae)于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2015226。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本实验室将收集到的福建省永春红曲米、古田平湖红曲米、宁德黄家村红曲米、南平松溪红曲米、古田溪边村红曲米、闽北屏南红曲米、建瓯红曲米、福州红曲米、三明乌衣红曲米分别进行控温发酵，并通过分离、纯化与筛选得到一株高耐酒精、低产酸、低产尿素、低产杂醇油的菌株，检测该菌株的形态学、生理生化学特征、及测定其26SrDNA序列并进行同源性分析，最终鉴定其为酿酒酵母菌属的一个菌株。

本发明的有益效果在于：提供一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)，该菌株不仅具有低产尿素、低产杂醇油、低产酸、高耐受酒精等能力、还可在10℃低温下酒精发酵，综合发酵性能优良；利用本发明酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)生产红曲黄酒，可提高红曲黄酒的的发酵品质与安全性，具有广阔的应用前景。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明中实施例1可在10℃酒精发酵的酵母菌株选育情况曲线图。

图2是本发明中菌株JH301的系统发育树。

【具体实施方式】

本发明中酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)是将收集到的福建省永春红曲米、古田平湖红曲米、宁德黄家村红曲米、南平松溪红曲米、古田溪边村红曲米、宁德屏南红曲米、建瓯红曲米、福州红曲米、三明乌衣红曲米分别进行控温发酵后分离、纯化及筛选得到的菌株；该菌株应用至红曲黄酒酿造时，不仅能够提高红曲黄酒的发酵品质；还使得所产红曲黄酒具有总酸、尿素、杂醇油含量低，及酒精度高的优点。

为了对本发明进行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例。

实施例1该菌株JH301的分离纯化与筛选

(1)能在10℃低温酒精发酵的酵母菌菌株的分离、纯化

取从福建各地收集到的10份红曲米，具体包括永春红曲(1份)、古田平湖红曲(1份)、宁德黄家村红曲(1份)、南平松溪红曲(1份)、古田溪边村红曲(1份)、宁德屏南红曲(1份)、建瓯红曲(1份)、福州红曲(1份)、三明乌衣红曲(2份)，分别编号21-30；取每份红曲米25g并分别加至糖水培养基中(对各份红曲米所加至的糖水培养基进行与红曲米一样的编号)，在10±1℃下控温发酵；每天观察发酵情况并检测记录可溶性固形物含量，且根据记录的数据绘制如图1所示的可在10℃酒精发酵的酵母菌选育情况曲线图。由图1可知，在10℃低温下，除编号29的糖水培养基外，各编号糖水培养基中的可溶性固形物均呈下降趋势，且先快速下降后趋于平缓，发酵8d后，编号21、24、27、30糖水培养基中的可溶性固形物含量均已降至10％以下，说明其已起动酒精发酵。选择上述12个酒样即编号21、24、27、30糖水培养中的发酵液作为菌源做梯度稀释，之后分别吸取0.1mL稀释液涂布于已灭菌的PDA培养基上，30℃培养48h，接着转移接种到试管斜面培养，经反复分离纯化共获得耐低温的酵母菌13株，保存备用。

(2)优良黄酒酵母的筛选

将上述分离纯化获得的13株酵母菌(各酵母菌菌株的编号见表1)分别以2％的接种量加至酵母发酵培养基中，发酵4d后加糖调高可溶性固形物含量8％，之后于20℃控温发酵，每3d检测发酵液的酒精度，发酵结束(酒精度不再发生变化)后取样检测发酵液的总酸、酒精度、尿素浓度、杂醇油含量，筛选红曲黄酒发酵优良酵母菌株；且以购自安琪酵母股份有限公司的安琪黄酒高活性干酵母为对照菌株(为方便描述，将该菌株编号为AQ)。试验结果如表1中所示，耐受酒精能力最强的菌株为JH301达18.5％，极显著高于对照菌株AQ的16％(P<0.01)。产酸量最低的菌株为JH301，发酵结束其总酸为3.52g/L，极显著低于对照菌株AQ的3.62g/L(P<0.01)。产酸产尿素能力最低的菌株为JH301，仅为17.85mg/L，极显著低于对照菌株AQ的50.37mg/L(P<0.01)。产杂醇油水平最低的菌株为JH301，为117.12mg/L，极显著低于对照菌株AQ的179.07mg/L。结果表明，红曲黄酒酿造最适宜酵母菌株为JH301，其能在10℃低温下起动发酵，酒精水平18.5％，产尿素水平为17.85mg/L，产杂醇油水平为117.12mg/L；为了方便描述，将该筛选所得编号为JH301的菌株命名为菌株JH301。

表1试验结果

且在本实施例1中，糖水培养基的配制方法为：配制可溶性固形物含量达23％的白糖水，121℃灭菌20min，冷却后即得所述糖水培养基。PDA培养基的组分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、去氧胆酸钠0.5g/L、氯霉素0.1g/L、琼脂15g/L。酵母发酵培养基的配制方法均为：分别称量100g的糯米于500mL锥形瓶中，浸泡过夜后沥干，并于121℃灭菌20min，冷却后添加150mL无菌水，再分别加入用量为每克糯米70U、560U的α-淀粉酶和糖化酶(即每克糯米需加入70Uα-淀粉酶和560U糖化酶)，于60℃酶解4h，冷却后备用。

实施例2菌株JH301的鉴定

(1)形态学特性：

对菌株JH301的主要形态进行考察，得到该菌株JH301的主要形态如下：菌落白色，油脂状，表面光滑，不透明，边缘整齐；菌落直径2.5-3.5μm×2.5-4.5μm，呈细胞圆形或卵圆形，单生或对生，芽殖。

(2)生理生化特征：

对菌株JH301的生理生化特征进行研究，结果见表3，由表3可知：菌株JH301可代谢D-葡萄糖、D-半乳糖、纤维二糖、D-麦芽糖、D-蔗糖、D-棉籽糖等6种碳源，不能利用甘油、2-酮基-葡萄糖酸盐、L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、木糖醇、肌醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、D-乳糖、海藻糖、D-松三糖等13种碳源。

表3菌株JH301的生理生化试验结果

注：表3中，“+”表示阳性；“-”表示阴性。

(3)菌株JH301的26SrDNA序列测定与同源性分析

采用TIANGEN公司的真菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株即菌株JH301的基因组DNA。委托生物工程(上海)有限公司合成正向引物NL-1(如SEQIDNO：1所示)：5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’；反向引物NL-4(如SEQIDNO：2所示)：5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3'。

以提取所获得的菌株JH301的基因组DNA为模板，且以上述引物(NL-1/NL-4)为引物对PCR扩增其26SrDNA基因D1/D2区域：

PCR反应体系(50μL)：10*buffer5.0μL、dNTP4.0μL、NL-12.0μL、NL-42.0μL、DNA4.0μL、Taq酶1.0μL、ddH₂O32.0μL；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

PCR产物检测：取5μL的PCR产物，2μL的上样缓冲液，在1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离，在EB染料上染色10min，用凝胶成像系统进行分析，将含有目标片段的产物进行测序，测得菌株JH301的26SrDNA序列如SEQIDNO.3所示。将所测得的菌株JH301的26SrDNA序列输入Genebank以Blast软件进行序列同源性比较，并利用MEGA5.0软件构建系统发育进化树，进行亲缘关系和系统发育分析，如图2所示，从而表明，该菌株JH301与Saccharomycescerevisiae模式株聚在最近的一个分支，序列同源性为99％以上，Bootstrap支持率为100％，说明该菌株JH301在分子系统发育分类学上属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌属。

依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，最终确定菌株JH301属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

实施例3菌株JH301在红曲黄酒酿造中的应用

将圆糯米浸泡过夜后蒸熟，摊开迅速冷却至30～40℃，投入盛有红曲米与水的陶土缸中(糯米饭与红曲米、水投入重量比为1：0.04：1.2)，接着以5.7×10⁶cfu/mL的接种量接入经发酵培养基活化的菌株JH301，搅拌均匀；且分别以接种购自安琪酵母股份有限公司的安琪黄酒高活性干酵母(为方便描述，将该菌株编号为AQ)、不接种任何酵母菌的酒样(CK)为对照；然后于室温(10～15℃)温度下进行发酵，发酵1天后开始早晚各搅拌1次，当发酵液中酒精度不再发生变化时表示发酵结束，之后进行压榨过滤制得红曲黄酒初酿酒。

各处理所制得的红曲黄酒初酿酒酒样主要指标检测结果见表4：在10～15℃低温下，添加菌株JH301强化发酵的酒样发酵速率最快，其次为添加酵母菌AQ发酵的酒样，不添加任何酵母菌强化发酵的酒样(CK)的发酵速率最慢，三种处理的发酵周期分别为30、35、45d。添加菌株JH301强化发酵的酒样酒精度最高，达18.3％(v/v)，残糖含量最低，为1.2g/L，其次为添加酵母菌AQ酒样，其酒精度17.6％(v/v)、残糖含量2.4g/L，CK酒样酒精度最低，为17.2％，残糖含量最高，达3.8g/L，差异均达极显著水平(P<0.01)，说明菌株JH301拥有较强的酒精发酵能力；添加菌株JH301强化发酵的酒样总酸最低，为4.56g/L，pH值最高，达4.11，其次为添加酵母菌AQ酒样的5.21g/L、pH值3.92，CK酒样的总酸最高，达9.56g/L，pH值最低，为3.63，差异均达极显著水平(P<0.01)，说明菌株JH301产酸水平较低，可显著降低传统红曲黄酒的发酵总酸，从而提高红曲黄酒的口感；添加菌株JH301强化发酵的酒样尿素含量、杂醇油含量均为最低，分别为27.23mg/L、155.3mg/L，其次是添加酵母菌AQ酒样，分别为56.86mg/L、202.4mg/L，而CK酒样的尿素含量、杂醇油含量均最高，分别为88.98mg/L、356.5mg/L，差异均达极显著水平(P<0.01)，说明菌株JH301产尿素、杂醇油水平较低。

表4指标检测结果

综上可知，本发明提供的酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)不仅具有低产尿素、低产杂醇油、低产酸、高产酒精等能力、还可在10℃低温下进行酒精发酵，综合发酵性能优良；利用本发明酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)生产红曲黄酒，可提高红曲黄酒的的发酵品质和安全性，具有广阔的应用前景。

Claims (1)

1.一种红曲黄酒酿造用的酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株为酿酒酵母菌株JH301(Saccharomycescerevisiae)，于2015年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015226。