CN103409330A

CN103409330A - 一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及应用

Info

Publication number: CN103409330A
Application number: CN2013101193666A
Authority: CN
Inventors: 薛洁; 王丽华; 唐坤甜; 张凤杰; 李惟
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103409330B

Abstract

本发明公开了一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及在葡萄酒生产中的应用，属于生物技术和发酵领域。该菌株是从中国昌黎地区葡萄原料中分离得到，其筛选方法是取酿酒葡萄原料，使用培养基方法对酵母进行分离和纯化，然后经过初筛、复筛和发酵实验，发酵液采用GC-MS测定氨基甲酸乙酯含量，挑选氨基甲酸乙酯浓度低的菌株。使用该菌株能有效降低葡萄酒生产中氨基酸甲酸乙酯的含量，提高葡萄酒的安全性。

Description

一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及应用

技术领域

本发明涉及一种低产氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的筛选及该葡萄酒酵母在葡萄酒酿造中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

葡萄酒是国际公认的健康饮品，是国民经济发展中最具活力的产业之一，在提高城乡居民生活水平、推动相关产业发展、扩大就业、带动农民增收等方面做出了重要贡献。2011年我国葡萄酒产量为115.69万千升，同比增长13.02%；销售收入384.60亿元，同比增长21.14%；利润50.71亿元，同比增长13.96%。葡萄酒行业的速度、效益同步增长，已成为最具有潜力的朝阳产业。但是随着食品安全趋势发展和消费者对食品安全的关注，各国都制定了或正着手制定严格的葡萄酒安全技术法规和标准，对葡萄酒的质量安全提出了越来越高的要求，葡萄酒的质量安全问题已成为影响各葡萄酒国际市场占有率及竞争力的重要因素。

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,Ec），又称为尿烷，是发酵食品在发酵过程中自然产生的副产物，有基因毒性和致癌性，自2002年以来，氨基甲酸乙酯已成为世界卫生组织重点监控物质之一，2007年被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）归为2A类致癌物。1985年，加拿大政府首次规定了不同酒精饮料中氨基甲酸乙酯的最高含量30μg/L，美国也就当地生产的食品采取自愿制定EC安全含量标准的做法，欧盟一些成员国也规定了酒精饮品中EC最高限量。在亚洲，韩国规定葡萄酒的EC最高限量30μg/L，但受多方面原因的限制，到目前我国仍没有制定有关EC的限量标准，造成葡萄酒中EC含量超标的问题非常突出，随着人民生活水平的提高及酒类产品出口的需要，如何降低葡萄酒中EC的含量正逐渐受到研究人员的重视。

近二三十年来，随着对葡萄酒中 EC 形成机理研究的深入，一般认为萄酒中EC是由前体物质（尿素、瓜氨酸等氨甲酰类物质）和乙醇自发反应产生的，尿素和瓜氨酸是通过酵母的尿素循环途径和苹果酸-乳酸菌的精氨酸脱亚氨基酶途径（简称ADI途径）代谢的结果，其中酵母的尿素循环产生尿素含量的高低与葡萄酒酿造中所使用的菌株类型密切相关。在葡萄酒酿造过程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸，该过程受CAR1基因编码的精氨酸酶活性的影响。细胞中的尿素不会立即进行降解，而是根据细胞对氮代谢的调节，或者分泌到酵母细胞外的酒液环境中，或者被细胞作为氮源重新吸收利用。酿酒酵母中有两种尿素转运蛋白，分别为由DUR4编码的Dur4p和由DUR3编码的Dur3p。当细胞需要更多的氮源时，Dur3p 被激活，尿素就被细胞重新吸收利用；而当细胞内尿素浓度过高，则在 Dur4p 的作用下把尿素分泌到细胞体外，以降低细胞内尿素的浓度，维持细胞机体的正常运行。尿素的这两条降解途径均是需能过程，并且皆须在由基因DUR1,2编码的尿素酰氨分解酶的催化下完成。基因CAR1和DUR1,2都受葡萄汁中氮代谢抑制的调控，但这两个基因的表达模式使得在同一条件下只能有一个基因表达。葡萄酒中尿素的积累是因为DUR1,2不能表达或表达的量较少，而CAR1表达的量较多的缘故。DUR1,2在葡萄酒酵母中合适的表达以使葡萄汁发酵中产生的尿素都被降解成氨和 CO₂，不同酵母由于CAR1和DUR1,2两种基因表达情况不同，造成葡萄酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性，所以筛选不分泌尿素或尿素分泌量低的酵母，特别是筛选精氨酸酶活力低的酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。

本专利通过通过以下筛选方法，分离筛选出一株能显著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的葡萄酒酵母菌株，对于开发具有优质本地且安全性较高的葡萄酒具有重要意义。

发明内容

本发明的目的旨在解决国产葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量较高的现状，提供一株低产氨基甲酸乙酯的酵母及其在葡萄酒生产中的应用。

本发明所提供的低产氨基甲酸乙酯酵母的葡萄酒酿酒酵母CY5菌株，其分类命名是:酿酒酵母saccharomyces cerevisiae,保藏号为:CGMCC No.7327，于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株经过48h固体YEPD培养基上生长的菌落为圆形、乳白色，有光泽，其边缘整齐，菌体粘稠，易挑起。在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，菌落球形突出，表面光滑、不透明，奶油状。

CY5菌株从我国昌黎产区酿酒葡萄表面筛选得到的，主要筛选步骤包括：在葡萄园中选取不同品种、品系的接近成熟的葡萄原料，以无菌操作的方式在不同位置处摘取整串葡萄，然后从每串葡萄的上部、下部、内部、外部摘取葡萄50粒，捣碎混匀放置2h。然后取混合均匀的葡萄汁，梯度稀释涂布于分离培养基中，于25℃培养箱中静置培养3d，随机选取具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2-3次，斜面保存备用。将分离的酵母菌株进行初筛、复筛、酒精耐受性、SO₂耐受性试验和发酵试验，获得氨基甲酸乙酯含量非常低的一株酵母。

本发明所用的分离培养基为YEPD培养基，所含组分为：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，氯霉素0.1g/L。所使用的斜面保存培养基为YPD培养基，所含组分为：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%。

本发明所用的初筛方法是酵母菌的产气性能测试，具体过程为：采用杜氏管发酵法，将10ml的10oBrix麦芽汁加入试管中，灭菌冷却后加入酵母菌，在25℃下发酵48小时，选择产气量等于杜氏小管体积的菌株。

本发明所用的复筛方法是酵母菌的产酒精能力测试，具体过程为：采用昌黎地区赤霞珠葡萄汁为原料，葡萄汁总糖含量为210g/L。在28℃条件下培养6天后，选择酒精度11%（V/V）以上、香气平衡的菌株。

本发明所使用的酒精耐受性和SO₂耐受性试验方法，具体过程是：采用杜氏管发酵法，将10ml的13oBrix麦芽汁加入试管中，灭菌后分别添加无水乙醇（8%、10%、12%、14%、16%、18%）和SO₂（50mg/L, 100mg/L、150mg/L、200mg/L），接种复筛得到的酵母菌株，28℃条件下静止培养48小时，选择杜氏小管产气达到满体积且耐酒精度14%以上、耐SO₂150mg/L以上的菌株。

本发明所使用的发酵试验方法，具体过程如下：模拟葡萄汁的配制：葡萄糖100g/L，果糖100g/L，酒石酸3g/L，柠檬酸0.3g/L，L-苹果酸0.3g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L；无硫酸氨的氨基础培养基3g/L；MnSO₄·H₂O 4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 4 mg/L，CuSO₄·5H₂O1mg/L，KI 1 mg/L，CoCl₂·6H₂O0.4 mg/L，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 1mg/L，H₃BO₃ 1mg/L；肌醇300mg/L，生物素0.04mg/L，精氨酸1.6g/L，脯氨酸1mg/L，色氨酸0.2g/L，泛酸1mg/L；棕榈酸1mg/L，棕榈烯酸0.2mg/L，硬脂酸3mg/L，油酸0.5mg/L，亚油酸0.5mg/L，亚麻酸0.2mg/L，pH值调整为3.3。模拟葡萄汁发酵：将筛选得到的酵母活化后接到装有300ml模拟葡萄汁的三角瓶中，使其终浓度达到10⁶个/mL，在25℃下厌氧发酵5～7天，发酵结束后取样GS-MS分析氨基甲酸乙酯的含量。

利用本发明的酿酒酵母生产出的葡萄酒优点在于：与对照商业化酿酒酵母菌株相比，其发酵得到的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量为2.5ug/L，比对照菌株降低了73.40%；该菌株在工业生产葡萄汁发酵中，显示能很好利用果糖、葡萄糖，菌体生长和酒精生成速率高等优良酿造特性，并能保持原酒的香气成分。本发明应用价值高，具有极高的社会和经济效益。

具体实施方式

下述实施例中的模拟葡萄汁培养基配方如下：葡萄糖100g/L，果糖100g/L，酒石酸3g/L，柠檬酸0.3g/L，L-苹果酸0.3g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L；无硫酸氨的氨基础培养基3g/L；MnSO₄·H₂O 4mg/L，ZnSO₄·7H₂O 4 mg/L，CuSO₄·5H₂O1mg/L，KI 1 mg/L，CoCl₂·6H₂O0.4 mg/L，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 1mg/L，H₃BO₃ 1mg/L；肌醇300mg/L，生物素0.04mg/L，精氨酸1.6g/L，脯氨酸1mg/L，色氨酸0.2g/L，泛酸1mg/L；棕榈酸1mg/L，棕榈烯酸0.2mg/L，硬脂酸3mg/L，油酸0.5mg/L，亚油酸0.5mg/L，亚麻酸0.2mg/L，pH值调整为3.3。

下述实施例中的WL培养基配方如下：酵母浸粉4.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖50.0 g/L，磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，硫酸镁0.125 g/L，氯化铁0.0025 g/L，硫酸锰0.0025 g/L，琼脂20.0 g/L，溴甲酚绿22.0 mg/L。

下述实施例中的YEPD培养基配方如下：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，氯霉素0.1g/L。

下述实施例中的YPD培养基配方如下：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%。

实施例1：低产氨基甲酸乙酯酵母CY5的筛选

⒈ 酵母菌的产气性能测试：采用杜氏管发酵法，将10ml的10oBrix麦芽汁加入试管中，灭菌冷却后加入供试酵母菌，在25℃下发酵48小时，选择产气量等于杜氏小管体积的菌株。

⒉ 酵母菌的产酒精能力测试：采用昌黎地区赤霞珠葡萄汁为原料，葡萄汁总糖含量为210g/L。在28℃条件下培养6天后，选择发酵后葡萄酒酒精度11%（V/V）以上、香气平衡的菌株。

⒊ 酒精耐受性和SO₂耐受性试验：采用杜氏管发酵法，将10ml的13oBrix麦芽汁加入试管中，灭菌后分别添加无水乙醇（8%、10%、12%、14%、16%、18%）和SO₂（50mg/L, 100mg/L、150mg/L、200mg/L），接种供试酵母菌株，28℃条件下静止培养48小时，选择杜氏小管产气达到满体积且耐酒精度14%以上、耐SO₂150mg/L以上的菌株。

⒋ 发酵试验：供试酵母活化后接到装有300ml模拟葡萄汁的三角瓶中，使其终浓度达到1×10⁶CFU/mL，在25℃下厌氧发酵5～7天，发酵结束后取样GS-MS分析氨基甲酸乙酯的含量，选择氨基甲酸乙酯含量低于5ug/L的菌株。

经过以上筛选步骤，得到CY5酿酒酵母菌株。

实施例2：低产氨基甲酸乙酯酵母和商业菌株在赤霞珠葡萄汁中的小型酿酒比较试验

在2个2.5L广口瓶里分别装2L赤霞珠葡萄汁（理化指标为：还原糖263.1g/L,总酸8.1g/L,pH 3.80，添加总SO₂约60mg/L），加入低产氨基乙酯酵母和葡萄酒企业使用的商用酵母D21（法国拉曼集团），使其终浓度达到1×10⁶CFU/mL，按照干红葡萄酒的标准工艺进行生产。发酵结束后取澄清的干红葡萄酒，取样测定氨基甲酸乙酯含量和香气成分及含量。

表1 两种酵母菌株生产葡萄酒的理化指标

结果如下：筛选菌株与商业菌株相比，发酵结束后测定残糖均小于4g/L，酒精度也无显著差异，因此筛选的菌株符合工业发酵的要求。同时筛选菌株的氨基甲酸乙酯明显低于商业酵母。

Claims

1.一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母CY5菌株，其保藏号为CGMCC No.7327，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2. 权利要求1 所述的低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母CY5菌株(CGMCC No.7327)在制备作为葡萄酒发酵剂方面的应用。