CN112940952B - 一株高产己酸乙酯酵母菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株酵母菌Y9（Hyphopichia burtonii），保藏编号为CGMCC No.21807。上述酵母菌Y9可应用于在酿酒中发酵生产己酸乙酯。该酵母具有较好的NaCl和葡萄糖耐受性，能适应宽广的pH环境，属于中等乙醇耐受性菌株，具有一定的己酸和己酸乙酯耐受性，能够适用于白酒发酵。经过条件优化后，菌株Y9发酵可生产己酸乙酯浓度达到15.0 mg/L。

Description

一株高产己酸乙酯酵母菌及其应用

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种高产己酸乙酯酵母菌。

背景技术

白酒是我国国酒，因风味特征差异而分为不同香型，其中浓香型白酒因其独特的风格而深受消费者的喜爱，其饮用量和销售量在众多香型白酒中独占鳌头，占据白酒市场份额的70%。在影响浓香型白酒独特风格的众多风味物质中，具有甜香、水果香、窖香和青瓜香的己酸乙酯是浓香型白酒的主要特征风味物质，其含量的高低直接决定了浓香型白酒的品质。然而，对浓香型白酒品质起到如此重要的风味物质，在传统酿造发酵过程中，含量却往往达不到高品质浓香型白酒的要求，造成浓香型白酒的优质品率低；另外，白酒生产过程中丰富度较高的乳酸菌会产生过多的乳酸，从而生成过量的乳酸乙酯，造成乳酸乙酯和己酸乙酯比例的严重失调，加剧了浓香型白酒品质的下降。因此，在浓香型白酒酿造过程中，如何提高己酸乙酯含量是稳定和提高浓香型白酒品质首要解决的问题。

产香酵母是一类能够代谢生成酯类化合物的非酿酒酵母菌的总称，又称生香酵母，该类酵母能够利用葡萄糖等糖源代谢产生乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯等，在白酒酿造过程中起到非常重要的提酯增香作用。如，将高产乙酸乙酯的酵母菌J-4应用于麸曲白酒酿造生产中，乙酸乙酯含量相比未添加J-4的对照组提高了50.7%，增强了酒体风味[刘小改，马美荣，周林艳，等. 高产乙酸乙酯酵母菌筛选及固态发酵应用研究[J]. 中国酿造,2020, 39(10): 79-83]；将产香酵母长孢洛德酵母Z9Y-91强化于复糟酒生产中，相比对照组，乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸异戊酯等风味酯含量上升，复糟酒感官指标得到提高[王松，陈雪玲，游玲. 1株产香酵母在浓香型白酒复糟酒生产中的应用[J]. 中国酿造, 2020, 39(9): 42-47]。由此可见，产香酵母是白酒酿造中品质提升的重要功能菌株。在众多产香酵母中，有关其高产乙酸乙酯的研究较多，而有关白酒四大酯（乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯）中其它三种酯的研究少。鉴于己酸乙酯对浓香型白酒的重要性，筛选分离获得高产己酸乙酯的产香酵母不仅行之有效，同时也不失为是提高浓香型白酒酿造中己酸乙酯含量的有效途径之一，研究和选育高产己酸乙酯产香酵母菌株具有重大的现实意义。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一株高产己酸乙酯酵母菌，为提高浓香型白酒中己酸乙酯含量提供功能菌株。

本发明还提供了该菌株高产己酸乙酯的发酵条件。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一株酵母菌Y9（Hyphopichia burtonii），保藏编号为CGMCC No. 21807。

上述酵母菌Y9在酿酒中的应用。

所述应用为将酵母菌Y9接种于高粱酶解液中发酵，然后在乙醇和己酸存在下继续静置发酵生产己酸乙酯。

所述高粱酶解液的糖度优选为10-14 Brix。

所述高粱酶解液为高粱经淀粉酶和糖化酶后的滤液。优选的，采用以下方法获得：250 g高粱粉碎后加入水，糊化后加入淀粉酶90℃下液化，冷却至60℃，加入糖化酶糖化，然后趁热过滤并室温离心，上清液即为高粱酶解液。

所述发酵条件为：初始pH为5-7，温度为22-25℃。

所述乙醇的浓度为6-10%v/v；所述己酸的浓度为0.04-0.08%v/v。

所述静置发酵的时间为12-60h，温度为22-25℃。

一种包含上述酵母菌Y9的微生物菌剂。所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

本发明具有以下优点：

本发明从酒曲中筛选获得一株高产己酸乙酯的酵母菌株Y9，通过形态学观察、生理生化及分子生物学鉴定其为Hyphopichia burtonii，该酵母具有较好的NaCl和葡萄糖耐受性，能适应宽广的pH环境，属于中等乙醇耐受性菌株，具有一定的己酸和己酸乙酯耐受性，能够适用于白酒发酵。经过条件优化后，菌株Y9发酵可生产己酸乙酯浓度达到15.0 mg/L。

生物保藏信息

酵母菌Y9（Hyphopichia burtonii），于2021年02月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 21807。

附图说明

图1是菌株Y9在YPD培养基上菌落形态（a）及显微镜下细胞形态（10×100）（b）；

图2是基于26S rDNA D1/D2序列及Neighbor-Joining法构建的系统发育树；

图3是酵母菌Y9对不同条件的耐受性：a. 温度耐受性，b. pH耐受性，c.葡萄糖耐受性，d. NaCl耐受性，e.乙醇耐受性，f. 己酸耐受性，g. 己酸乙酯耐受性；

图4是酵母菌Y9发酵条件的优化：a. 温度，b. 转速，c.乙醇添加量，d. 己酸添加量，e.高粱酶解液糖度，f. pH，g. 己酸乙酯耐受性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 酵母菌的分离鉴定与高产己酸乙酯菌株筛选

1.菌株分离

于2016年10月-12月收集四川、安徽、山东、河北等不同酿酒大曲十余份；

配制YPD液体培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，自然pH，然后121℃条件下灭菌20 min；YPD固体培养基为在液体培养基基础上添加20 g/L的琼脂粉。

将逐级稀释的不同浓度的大曲菌悬液，涂布于YPD固体培养基平板上，28℃倒置培养，挑取疑似酵母菌落进行划线分离后采用显微镜观察和确定，筛选获得79株酵母菌，4℃下保藏备用。

2.高产己酸乙酯菌株筛选

制备高粱酶解液：250 g高粱粉碎后，加入1 L蒸馏水，糊化后，利用耐高温淀粉酶（200 µL）于90℃下液化1 h，冷却至60℃，加入糖化酶（0.125 g）糖化2 h。随后，趁热过滤，并室温离心10 min，离心转速为10000 r/min，上清液糖度调至8 Brix后分装于250 mL三角瓶中（30 mL/瓶），115℃灭菌20 min；

将筛选得到的菌株分别接种于YPD液体培养基中活化24 h，以0.3%（v/v）的接种量接入高粱酶解液培养基中，于28℃，180 r/min培养24 h，然后加入4%（v/v）的无水乙醇和0.04%（v/v）的正己酸，继续发酵36 h，发酵液于室温下10000 r/min离心10 min，获得的上清液进行己酸乙酯含量的测定，取3 mL上清液加入到装有3 mL正庚烷的试管中，充分混匀后静置萃取2 min，取有机相部分于5 mL离心管中，加入适量无水硫酸钠除去痕量水，用有机滤膜过滤后测定己酸乙酯含量。

己酸乙酯含量采用GC-MS方法测定：毛细管色谱柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；进样口温度为250℃；分流比为37：1；采用程序升温（50℃，保留2 min，以10℃/min速率升至180℃，保留2 min，再以6℃/min速率升至230℃，保留2 min）；检测器温度250℃；载气为He，流速1 mL/min；EI电离源，电子能量70 eV；扫描范围50-350 amu；离子源温度250℃；接口温度250℃；己酸乙酯标准曲线的绘制采用外标法，准确称取0.0869 g己酸乙酯纯品，用正庚烷定容至100 mL，分别将其稀释至50、100、200、400和800倍，经GC-MS检测其峰面积，以己酸乙酯含量为X轴，峰面积为Y轴，绘制己酸乙酯标准曲线。

最终筛选获得37株产己酸乙酯菌株，产量如表1所示：

表1 不同酵母发酵液中己酸乙酯含量

从结果来看，相比产香酵母合成乙酸乙酯的含量（为克每升的水平），各菌株合成己酸乙酯的含量都较低，为毫克每升的水平。在这些产己酸乙酯酵母中，有过半的产量极低，不足1.0 mg/L，仅有3株酵母产量达到3.0 mg/L以上，分别为菌株Y1、Y9和Y14，产量分别为3.72 mg/L、4.15 mg/L和3.31 mg/L；通过对以上三株菌进行重复验证发现，菌株Y9明显高于其它两菌株，为此，将菌株Y9确定为本研究的目标菌株。

将菌株Y9进行形态学观察、生理生化特性和分子生物学鉴定。菌株Y9在YPD固体培养基上于28℃培养24 h后，长势良好，菌落呈乳白色，突起，圆形，表面粗糙干燥，不透明，内部湿润易挑起（图1a）；显微镜下细胞形态特征如图1b所示，细胞为椭圆形，一端芽殖（图1b中椭圆标记），有假菌丝，属酵母的典型特征，由此可见，菌株Y9为酵母菌。

表2可以看出，酵母菌Y9能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖发酵产酸产气，利用木糖和纤维二糖只产气不产酸，而不能利用阿拉伯糖、可溶性淀粉和乳糖产酸或产气。该酵母碳源同化试验表明，酵母菌Y9能很好的适应环境，能利用广泛的碳源进行生长，在所试的16种碳源中均有不同程度的生长，但在不同碳源条件下其生长状态有所差异，主要表现为在液体表面生长和在液体表面生长及液体内部生长，这可能是由于该酵母利用不同碳源的代谢途径不同，有些碳源，如甘露醇、山梨醇、乙醇、海藻糖、柠檬酸、葡萄糖、乳糖等主要通过厌氧途径，因此菌体主要集中于液体底部，而山梨糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、麦芽糖、半乳糖和纤维二糖既可以通过厌氧途径也可以通过有氧途径进行同化利用，由此可见酵母菌Y9为兼性厌氧微生物。酵母菌Y9氮源同化结果表明，其能利用硝酸钾、硫酸铵、L-苯丙氨酸和尿素，而不能利用亚硝酸铵，并且在所利用氮源情况上如同碳源同化类似，利用不同氮源生长代谢的途径有所不同，利用L-苯丙氨酸主要通过厌氧途径，而其它3中氮源既可以通过厌氧途径也可以通过有氧途径。在其他生理生化试验中，只有吲哚试验、淀粉水解试验和尿素试验为阳性反应，其他试验都为阴性反应，比对《酵母菌的特征与鉴定手册》并结合形态学观察实验结果，初步判定菌株Y9为Hyphopichia burtonii。

表2 Y9菌株的生理生化特性

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。

提取酵母菌Y9总DNA后，通过通用引物扩增获得其26S rDNA序列，对其进行测序后，在NCBI数据库中进行序列比对，结果表明，该菌与Komagataella pastoris M13-2-1-13的26S rDNA序列同源性最高，相似度达到99.44%。利用MEGA 7.0软件中的Neighbor-Joining方法对该菌株及其序列相似度较高的菌株构建系统发育树（图2）。由图2可以看出该酵母与Hyphopichia burtonii strain FBKL2.8018的亲缘关系最近。

综合形态学、生理生化及分子生物学试验结果，酵母菌Y9被鉴定为Hyphopichia burtonii。将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 21807。

实施例2 酵母菌Y9对不同条件的耐受性

分别测定酵母菌Y9的最适生长温度和生长温度耐受性（20、25、30、35、40、45和50℃）、最适生长pH和生长pH耐受性（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12）、葡萄糖耐受性（10、20、30、40、50、60、70、80和90%，w/v）、NaCl耐受性（0、5、10、15、20、25和30%，w/v）、乙醇耐受性（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20%，v/v）、己酸耐受性（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12%，v/v）和己酸乙酯耐受性（0、300、600、900、1200、1500和1800 mg/L）。

结果如图3所示：随着温度的升高，酵母菌Y9的生长速度先增大后降低，其最适生长温度为25℃，最高耐受温度为40℃，在20-35℃生长旺盛；酵母菌Y9在不同初始pH条件下生长情况可知，其最适生长pH为7，并且具有较宽广的pH适应性，在pH 2-12之间都能生长，尤其是在pH 3-10之间生长旺盛；随着葡萄糖浓度的增加，酵母菌Y9的生物量逐渐降低，尤其是在葡萄糖浓度为20%-70%时呈直线下降趋势。但是，酵母菌Y9表现出较好的高浓度葡萄糖耐受性，即使在葡萄糖浓度达到90%以上，其仍具有生长能力；随着NaCl浓度的增加，酵母菌Y9生长受到抑制的程度不断增加，当NaCl浓度不高于15%时，酵母菌Y9能生长，而当NaCl浓度为20%及以上时，酵母菌Y9的生长受到完全抑制；随着乙醇浓度的增加，酵母菌Y9的生长速率逐渐降低，但其能在8%乙醇浓度时仍生长，这表明Y9属于中等水平乙醇耐受性菌株；酵母菌Y9能够在己酸不高于0.04%时能够生长，但高于0.04%浓度时生长就几乎停滞；酵母菌Y9的生长速率随着己酸乙酯浓度的增加而下降，最高能耐受900 mg/L的己酸乙酯。上述生物学特性说明，获得的酵母菌Y9能够较好地适应于白酒发酵条件。

实施例3 酵母菌Y9产己酸乙酯发酵条件优化

分别配制或制备YPD液体培养基和高粱酶解液，然后将酵母菌Y9接种于YPD液体培养基中于28℃活化培养24 h，按照0.3%（v/v）接种量接种于高粱酶解液培养基中，28℃，180rpm培养24 h，完成第一阶段细胞的积累，然后加入4%（v/v）乙醇和0.04%（v/v）己酸，继续培养至36h，完成第二阶段己酸乙酯的合成。采用单因素一一考察培养基条件（糖度和pH）及第二阶段发酵条件（温度、转速、接种量、乙醇添加量、己酸添加量、诱导发酵时间）对酵母菌Y9合成己酸乙酯的影响，具体如下：

温度：按照上述条件加入乙醇和己酸后，分别于18、20、22、25、28和30℃进行发酵培养；

转速：按照上述优化后的温度条件，在第二阶段发酵时，分别于0、120、150、180、210和240 r/min条件下进行；

乙醇添加量：按照上述优化后的温度和转速，在第二阶段发酵时，使乙醇添加量分别为0、2、4、6、8和10%（v/v）；

己酸添加量：按照上述优化后的温度、转速和乙醇添加量，在第二阶段发酵时，使己酸添加量分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10%（v/v）；

培养基糖度：按照上述优化后的条件分别采用不同糖度（6、8、10、12和14 Brix）的高粱酶解液进行发酵；

高粱酶解液pH优化：按照上述优化后的条件，改变高粱酶解液的初始pH分别为2、3、4、5、6和7进行发酵；

培养时间优化：按照上述优化后的各项条件，培养的时间分别为12、24、36、48和60h。

结果如图4所示：酵母菌Y9合成己酸乙酯的浓度随温度的升高不断增加，在22-25℃时，其合成己酸乙酯浓度达到最高，为4.3-4.5 mg/L。随着摇瓶转速的提高，酵母菌Y9合成己酸乙酯的浓度呈现下降趋势，也就是说溶氧量的增加会对己酸乙酯合成产生抑制。在静置培养方式下，酵母菌Y9合成己酸乙酯的量最高，达到6.2 mg/L。随着乙醇添加量的增加，Y9合成己酸乙酯的量呈现先增加后降低的趋势，其中在乙醇添加量为8%时，其合成己酸乙酯的量达到最高，为9.1 mg/L。当乙醇添加量较少时，酵母菌Y9合成己酸乙酯所需前体物质乙醇不足，影响酵母菌Y9合成己酸乙酯的产量，尤其是未添加乙醇时，未检测到己酸乙酯。适当的己酸添加量有助于酵母菌Y9合成己酸乙酯，在己酸添加量为0.04%-0.08%时，其所产己酸乙酯较高，为8.5 mg/L-9.2 mg/L；己酸添加量低于0.04%时，因合成己酸乙酯的前体物质含量不足，因此其合成己酸乙酯的量较低，尤其是在未添加己酸时，酵母菌Y9不能合成己酸乙酯。随着高粱酶解液糖度的逐渐增加，酵母菌Y9合成己酸乙酯的浓度也逐渐增加，在糖度为14 Brix时（酶解高粱所得最高糖度），所合成己酸乙酯浓度最高，为12.9 mg/L。随着培养基初始pH的升高，酵母菌Y9合成己酸乙酯的浓度呈现增加趋势，在pH 5-7时合成己酸乙酯含量最高。在未添加前体物质乙醇和己酸时，酵母菌Y9不能合成己酸乙酯，而加入两种前体物质后，酵母菌Y9能快速合成己酸乙酯，尤其是在诱导阶段的12 h内，能快速将对细胞毒害作用大的己酸转化为己酸乙酯，之后能够一直保持较高水平。己酸乙酯在发酵时间为48-60 h时达到最高，为14.6-15.0 mg/L，继续延长发酵时间，己酸乙酯含量有所降低。

通过单因素优化了酵母菌Y9产己酸乙酯条件，在高粱酶解液培养基的糖度为14Brix，初始pH 5.0，乙醇添加量为8%，己酸添加量为0.04%，诱导温度为22℃，诱导阶段采用静置，发酵60 h时，己酸乙酯浓度达到15.0 mg/L，是优化前的3.6倍。

Claims (10)

1.一株酵母菌Y9（Hyphopichia burtonii），保藏编号为CGMCC No. 21807。

2.一种权利要求1所述的酵母菌Y9在酿酒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将酵母菌Y9接种于高粱酶解液中发酵，然后在乙醇和己酸存在下继续静置发酵。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高粱酶解液的糖度为10-14 Brix。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高粱酶解液为高粱经淀粉酶和糖化酶后的滤液。

6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高粱酶解液采用以下方法获得：250g高粱粉碎后加入水，糊化后加入淀粉酶90℃下液化，冷却至60℃，加入糖化酶糖化，然后趁热过滤并室温离心，上清液即为高粱酶解液。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵条件为：初始pH为5-7，温度为22-25℃。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乙醇的浓度为6-10%v/v；所述己酸的浓度为0.04-0.08%v/v；所述静置发酵的时间为12-60h；温度为22-25℃。

9.一种包含权利要求1所述酵母菌Y9的微生物菌剂。

10.根据权利要求9所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

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