CN112094762A - 一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株葡萄牙棒孢酵母，其命名为Clavispora lusitaniae CP‑1，保藏编号为GDMCC No:61036；本发明还涉及葡萄牙棒孢酵母在发酵生产橙皮素中的应用以及生物转化橙皮苷的方法。该菌株来源于陈皮，属于公认安全菌株，可以在食品中应用，容易培养和保存，通过发酵所得的橙皮素产率可高达74.29％，达到了显著提高产量的目的。

Description

一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)菌株及其在发酵生产橙皮素中的应用。
背景技术
橙皮苷是一种二氢黄酮苷，是柑桔中含量最为丰富的黄酮类物质之一，由苷元(橙皮素) 和芸香糖组成，研究证实橙皮苷具抗炎、抗氧化、干扰肿瘤形成等多种生物活性，但是橙皮苷在柑桔果实中是以活性较低的糖苷形式存在，提取得到的橙皮苷其糖苷键并没有断开，这种糖苷键的存在特别是鼠李糖糖苷键的存在，阻碍了其被生物体消化吸收，降低了其生物利用率。橙皮苷的溶解性很差，它的水溶性和脂溶性都相当低，使得它不易被生物酶类利用，也不易透过生物细胞膜，因而也限制了它在食品等领域中的应用。药代动力学研究表明苷类成分肠道内难以吸收、肠内滞留时间较长而易受到肠道菌群的水解作用，苷经肠道细菌代谢后被水解，生成苷元而发挥其药理作用。因此，通过将苷类化合物转化成其相应苷元来提高苷类化合物生物利用度的研究是近年研究热点。
在上世纪70年代从柑桔中提取橙皮苷就已经工业化生产了，这些橙皮苷大部分应用于医药和化妆品领域中，在食品和保健品领域几乎没有应用。因为橙皮苷中糖基的存在，经人体口服后需要经人体大肠中微生物分解后才能被吸收，未被分解的部分则随大便排出体外，而对于肠胃功能不好的人则橙皮苷的药效也会降低。至于人体皮肤吸收，也由于糖基的存在，降低了橙皮苷的亲脂性，不易通过皮肤细胞，因此也会降低它对皮肤作用的效果。而去除糖基或部分糖基后，橙皮苷的衍生物在水溶性、脂溶性和生物利用率都会改善。
目前生产橙皮素主要是采用酸水解法和酶水解的。酶法水解温度较低，水解反应较好控制，但是经发酵产酶的产率并不高，价格昂贵，而且水解率较低，若酶系中含有多种酶，得到的反应产物仍然复杂，使得分离纯化困难。酸水解能耗高，损失大，对环境污染严重。因此筛选一株高效转化生产橙皮素的微生物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一株高效转化生产橙皮素的菌株。
本发明的第二个目的在于，提供上述菌株在在发酵生产橙皮素中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供一种发酵生产橙皮素的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一株高效转化生产橙皮素的菌株，所述菌株为葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)，已于2020年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61036。
根据本发明第一个方面所述的葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)，所述葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)的生物学性质为：将菌种划线接种于固体麦芽汁培养基上，37℃培养24h，菌落直径3-5mm，菌落圆形埑状，颜色乳白色，质地呈奶油状，不透明，菌落边缘呈毯状。
根据本发明第一个方面所述的葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)，所述葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)的分离纯化方法包括如下步骤：
1.配置分离培养基并灭菌后倒平板得到桔皮粉培养基；
2.随机取样陈皮；
3.将陈皮样品置于马铃薯培养液中，得到陈皮悬液并梯度稀释；
4.吸取上述步骤3所得悬液于桔皮粉培养基均匀涂布，30℃培养3天，重复操作进行纯化，直至菌落大小、形态一致，得纯培养物后低温保存。
根据本发明第一个方面所述的葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)，步骤 1中所述分离培养基为：硫酸镁0.5％，陈皮粉1.0％，磷酸氢二钾0.5％，氯化钾0.5％，硫酸铁0.01％，琼脂2.0％，pH自然。
根据本发明第一个方面所述的葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)，步骤 3中所述马铃薯培养液为：马铃薯200g，葡萄糖20g，ddH2O1000mL，pH自然。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)在发酵生产橙皮素中的应用。
根据本发明第二个方面的应用，以葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)为菌种，以橙皮苷为转化底物，发酵法生物转化制备橙皮素。
本发明的第三个方面，提供一种发酵生产橙皮素的方法，包括如下步骤：
S1：菌种活化：将葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)接种至麦芽汁培养液，活化培养得种子液；
S2：扩大培养：取步骤S1中种子液加入麦芽汁培养液中，扩大培养得菌液；
S3：将步骤S2中菌液加入橙皮苷溶液中，发酵生产橙皮素。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1中所述麦芽汁培养液包含：麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g，ddH2O 1000mL，pH自然。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1中所述活化培养的条件为：28～37℃，140～200 rpm培养12～24h。
优选地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S1中所述活化培养的条件为：30℃， 150rpm培养18h。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S2中所述扩大培养的条件为：28～37℃，140～200 rpm培养12～24h。
优选地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S2中所述扩大培养的条件为：30℃， 150rpm培养18h。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述橙皮苷溶液为：橙皮苷，0.1molNaOH， 50mmol磷酸缓冲液，pH 7.5。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述磷酸缓冲液的pH为7～8.5。
优选地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述磷酸缓冲液的pH为8。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述菌液与橙皮苷溶液的体积比为1:9。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述发酵的条件为：30～37℃，180～200rpm 发酵10～24h。
优选地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述发酵的条件为：35℃，200rpm 发酵18h。
更优选地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述发酵的pH为7.5。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述橙皮苷溶液的初始浓度为60～100 μg/mL。
进一步地，根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3中所述发酵的初始底物浓度为 80μg/mL。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)，该酵母为出发菌株生物催化橙皮苷制备橙皮素，微生物法将难溶的橙皮苷转化为溶解性好、活性强的橙皮素，无污染，成本低，反应条件温和，专一性强，安全高效。该菌株来源于陈皮，属于公认安全菌株，可以在食品中应用，该菌株容易培养和保存，通过发酵所得的橙皮素产率可高达74.29％，达到了显著提高产量的目的。
附图说明
图1葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)的系统树分析。
图2不同溶剂对橙皮素产率的影响。
图3不同转速对橙皮素产率的影响。
图4不同温度对橙皮素产率的影响。
图5不同缓冲体系pH对橙皮素产率的影响。
图6不同底物浓度对橙皮素产率的影响。
图7橙皮苷标准品HPLC色谱图。
图8橙皮素标准品HPLC色谱图。
图9最佳发酵工艺条件下发酵液HPLC色谱图。
图10橙皮素标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
陈皮粉分离培养基：硫酸镁0.5％，陈皮粉1.0％，磷酸氢二钾0.5％，氯化钾0.5％，硫酸铁0.01％，琼脂2.0％，pH自然。
马铃薯葡萄糖培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，ddH2O加至1000mL，pH自然。
麦芽汁培养液：麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g，ddH2O加至1000mL，pH自然。
磷酸缓冲液：16mL 50mmol NaH2PO4，84mL 50mmol Na2HPO4，pH7.5。
实施例1菌种分离纯化与鉴定
1.培养基配制：
配置陈皮粉分离培养基100ml，于121℃灭菌15min，待培养基冷却至约60℃，在超净工作台上倒平板，得到桔皮粉培养基。
2.陈皮样品处理
随机取样陈皮，称取陈皮30g置于已灭菌的自封袋中，后于超净工作台中撕碎，混合均匀后分别从30g中称取1g陈皮样品备用，达到均匀取样，使所取样品具有代表性。
3.陈皮菌悬液制备
将1g陈皮样品于40mL的马铃薯葡萄糖培养液中，于30℃下恒温摇床培养3天，得到陈皮菌悬液，并进行梯度稀释，平行三组。
4.陈皮中真菌的分离纯化
吸取每组菌悬液各100μL，于桔皮粉培养基上分别进行均匀涂布并标记，后于30℃培养箱中恒温培养3天后，从平板中挑取形态不同的菌落于新的相对应的培养基上进行平板划线，继续30℃下培养3天后观察所生长的菌落大小、形态特征，重复以上操作，直至平板上的菌落大小、形态特征一致，用石炭酸复红染液染色后镜检，确定其纯化，得到纯培养物。
纯化后的菌株用接种针从培养好的平板上取菌块4～7环(带少量培养基)，接入菌株保藏管中，拧紧盖子，充分剧烈震荡，用无菌吸管将溶液吸走后马上放入冰箱中，置于-80℃冰箱中保存，温度越低越有利于保存，备用。
5.PCR扩增及检测
使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，然后进行PCR扩增。真菌利用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO.1)和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO.2)对IS-PCR进行扩增，PCR反应体系及反应条件如表1和表2所示。
之后用西班牙琼脂糖配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1×TAE，电压按5V/CM进行琼脂糖凝胶电泳，电泳上样量为5μl。
表1 PCR反应体系
2X Taq Master Mix 12.5μl
上游引物 0.5μl
下游引物 0.5μl
DNA模板 2μl
ddH<sub>2</sub>O 9.5μl
总体积 25μl
表2 PCR反应条件
Figure RE-GDA0002781620710000051
6.陈皮真菌分子鉴定
PCR扩增后于4℃保存，产物交由上海生物技术有限公司测序，经初筛、复筛出1株高效产橙皮素菌株，利用引物ITS1和ITS4对IS-PCR进行扩增，产物交由上海生物技术有限公司测序，基于18S rDNA基因测序。
菌株序列为：
TGACGGCGAATGTCGTGCTGTAACGTGTTTGACAGCGCGGTTGATATTTCSGAGCA ACGCCTAACCGGGGGTTAGAGGGGATGCGACGCTCAAACAGGCATGCCTCGAGGAATG CCTCGAGGCGCAATGKGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAGTCATACTACGT ATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCC(SEQ ID NO.3)。
将所得上述碱基序列在NCBI官网上进行BLAST，与待检菌株同源性较高的几株菌株均为葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)。
通过MEGA5.1软件绘制系统树，其中DC1为待测菌株，结果见图1。可以看出待测菌株DC1与葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)的亲缘关系最近，同源性为99％，进而判定该菌株为葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)。
实施例2菌株转化条件的优化
1.菌种的活化
无菌条件下，用接种环从保藏的斜面培养基中取一满环葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)接种至装有30mL的麦芽汁培养液的100mL三角瓶，在30℃，150rpm条件下，培养24h，制得种子液。
2.扩大培养
用移液枪移取1mL种子液至装有30mL的麦芽汁培养液的100mL三角瓶，在30℃，150rpm条件下，培养24h，制得菌液。
3.单因素水平优化实验
分别从溶剂、转速、温度、pH和底物浓度5个方面进行了优化实验。
其中发酵液中橙皮素含量的测定方法为：
1.橙皮素标准曲线的绘制
准确称取橙皮素标准品(HPLC级)10mg，在100mL容量瓶中用无水乙醇溶解后，继续加入无水乙醇直至液面最低处刻度线，摇匀后得到质量浓度为100μg/mL的橙皮素标准溶液。
精确移取橙皮素标准溶液、无水乙醇按0：5、1：4、2：3、3：2、4：1、5：0加入于 10mL容量瓶中；充分摇匀后得橙皮素系列标准溶液，浓度分别为0、20、40、60、80、100μg/mL，各移取1mL橙皮素系列标准溶液于1.5mL液相样品瓶中，进行高效液相色谱(HPLC)分析。使用WPS2019软件进行统计处理并绘图，得到橙皮素峰面积与橙皮素浓度标准曲线如图2，得到公式y＝5842.5x；R2＝0.9999(式中：y为峰面积，x为橙皮素浓度(μg/mL)，R为相关系数)。
2.样品处理
分别将10mL甲醇、乙醇、乙腈与90mL蒸馏水混合，制得10％甲醇，10％乙醇和10％乙腈。
准确称取橙皮苷89.0μg加入100mL容量瓶中，分别加入磷酸缓冲液、10％甲醇，10％乙醇和10％乙腈；配制80μg/mL橙皮苷溶液，10％甲醇-80μg/mL橙皮苷溶液，10％乙醇-80μg/mL橙皮苷溶液，10％乙腈-80μg/mL橙皮苷溶液。
分别移取80μg/mL橙皮苷溶液、10％甲醇-80μg/mL橙皮苷溶液、10％乙醇-80μg/mL橙皮苷溶液、10％乙腈-80μg/mL橙皮苷溶液9mL和1mL菌液于20mL样品瓶内，每组三个平行样。
将上述样品瓶于30℃，200rpm恒温摇床内发酵24h后用1mL一次性注射器吸取1mL发酵液通过孔径0.22μm、直径13mm的PES滤膜注入1.5mL液相瓶进行HPLC分析。
3.HPLC分析
使用XBridge Shield RP18色谱柱(4.3x250mm，5μm)，柱温40℃，流动相A为超纯水、流动相D为甲醇，流速为1mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱条件见表3。
表3 HPLC液相色谱梯度洗脱条件
Figure RE-GDA0002781620710000071
记录波长为284nm、出峰时间为11.9±0.1处峰面积，并代入橙皮素标准曲线后得出发酵液中橙皮素含量(μg/mL)用Grigin 2018软件进行绘图。
4.产率的计算方法
葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)菌株转化橙皮苷制备橙皮素的产率按式(1)计算。
Figure RE-GDA0002781620710000072
式中：c0、c产物分别为反应起始底物的浓度和反应结束时产物的浓度。
a)在发酵条件：转速为200rpm，温度为30℃，pH自然，底物浓度为80μg/mL，改变溶剂(各为磷酸缓冲液pH7.5、10％甲醇、10％乙醇、10％乙腈)进行试验，结果见图3。
可以看出溶剂为磷酸缓冲液(pH7.5)时，橙皮素产率最高，为61.38％；溶剂为10％乙腈时次之，橙皮素产率为47.52％；溶剂为10％甲醇、10％乙醇时，橙皮素产率仅有3.82％和0.90％，因此确定最佳溶剂为磷酸缓冲液。
b)静息状态下，酵母细胞位于培养体系底层，通过摇床振荡有利于酵母细胞与培养体系中底物更充分的接触且避免酵母细胞周围代谢产物大量积累抑制酶活性，从而促进葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)转化制备橙皮素。
在发酵条件：溶剂为磷酸缓冲液，温度为30℃，pH7.5，底物浓度为80μg/mL，改变转速(各为0rpm、100rpm、150rpm、200rpm)，进行试验，结果见图4。
可以看出在0～200rpm范围内，橙皮素产率随转速的增大而增大，在0～150rpm范围内，橙皮素产率随转速增加有缓慢的增长；在150rpm～200rpm范围内，转速的增加会使得橙皮素产率有更明显的提高；但当摇床转速过高时，则增加剪切力对菌体的伤害，降低酵母细胞活性，降低了橙皮素产率，确定最佳转速为200rpm。
c)在发酵条件：溶剂为磷酸缓冲液，转速为200rpm，改变温度(各为25℃、30℃、35℃、 40℃)，进行试验，结果见图5。
可以看出在温度为30～35℃范围内，橙皮素产率随温度升高而缓慢增加；在35℃时，橙皮素产率达到最大值；但温度超过35℃后，产率逐渐降低。在预实验中，温度与底物溶解度呈正相关关系；但葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)并不耐热，在一定温度内，温度越高，葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)活性越强；但高于某个温度后，温度升高会使得葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)活性降低。在葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)活性与溶解度达到协调时，才能使橙皮素产率达到最高，因此最佳温度为35℃。
d)不同的缓冲体系pH会影响底物的解离度和菌体的酶活性，进而影响转化橙皮素的产率。
在发酵条件：溶剂为磷酸缓冲液，转速为200rpm，温度为35℃，改变pH(各为5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0)，进行试验，结果见图6。
由图6可知，在pH为4～8时，橙皮素产率呈上升趋势；在pH为8～10时，橙皮素产率呈急速下降趋势；当pH＝8时，橙皮素产率最大，因此最佳缓冲液pH为8.0。
e)底物浓度是水解反应中重要的影响因素之一。在发酵条件：溶剂为磷酸缓冲液，转速为200rpm，温度为35℃，pH为8.0，改变底物浓度(各为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、 80μg/mL、100μg/mL)，进行试验，结果见图7。
从图7可以看出，底物浓度在20～80μg/mL时，增加底物浓度，橙皮素产率也会随之增加，但增长速度逐渐降低；在底物浓度为80μg/mL时，橙皮素产率达到最大，但是进一步增加底物浓度后，橙皮素产率并没有随之增加，反而开始下降，因此最佳底物浓度为80μg/mL。
根据单因素优化结果最终确定了葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniaeCP-1)生物转化制备橙皮素最佳发酵工艺条件为：溶剂为磷酸缓冲液，摇床转速为200rpm，发酵温度为 35℃，缓冲体系pH为8，初始底物(橙皮苷)浓度为80μg/mL。在最佳发酵工艺条件下，发酵24h后，测得橙皮素峰面积为347235，由标准曲线公式得出：橙皮素浓度为59.43μg/mL；代入式(1)中产率公式计算得出橙皮素产率为74.29％。
图8为橙皮苷标准品HPLC色谱图，图9为橙皮素标准品HPLC色谱图，图10为葡萄牙棒孢酵母CP-1(Clavispora lusitaniae CP-1)在最佳发酵工艺条件下发酵24h后，发酵液的 HPLC色谱图。可以看出与发酵前相比，多了11.9min处出峰，即说明发酵后部分橙皮苷被转换成橙皮素。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
<120> 一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 220
<212> DNA
<213> 葡萄牙棒孢酵母18S rDNA
<400> 3
tgacggcgaa tgtcgtgctg taacgtgttt gacagcgcgg ttgatatttc sgagcaacgc 60
ctaaccgggg gttagagggg atgcgacgct caaacaggca tgcctcgagg aatgcctcga 120
ggcgcaatgk gcgttcaaag attcgatgat tcacgtctgc aagtcatact acgtatcgca 180
attcgctgcg ttcttcatcg atgcgagaac caagagatcc 220

Claims (10)

1.一株葡萄牙棒孢酵母，保藏编号为GDMCC No:61036，其命名为Clavisporalusitaniae CP-1。
2.权利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母在发酵生产橙皮素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以葡萄牙棒孢酵母为菌种，以橙皮苷为转化底物，发酵法生物转化制备橙皮素。
4.一种发酵生产橙皮素的方法，包括如下步骤：
S1：菌种活化：将葡萄牙棒孢酵母接种至麦芽汁培养液，活化培养得种子液；
S2：扩大培养：取步骤S1中种子液加入麦芽汁培养液中，扩大培养得菌液；
S3：将步骤S2中菌液加入橙皮苷溶液中，发酵生产橙皮素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述活化培养的条件为：28～37℃，140～200rpm培养12～24h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述扩大培养的条件为：28～37℃，140～200rpm培养12～24h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述所述橙皮苷溶液为：橙皮苷，0.1molNaOH，50mmol磷酸缓冲液，pH 7.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述所述磷酸缓冲液的pH为7～8.5。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述橙皮苷溶液的初始浓度为60～100μg/mL。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述发酵的条件为：30～37℃，180～200rpm发酵10～24h。
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