CN115404242B - 农业废弃物环保化生物处理方法、生物制剂和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农业废弃物环保化生物处理方法，所述农业废弃物为柑桔类果皮，所述方法具体为：将果皮打浆、灭菌后得到浆料，将浆料采用复合菌有氧发酵；所述复合菌为黑曲霉、葡萄牙棒孢酵母、发酵乳杆菌，其比例为0.9‑1.1：0.9‑1.1：0.9‑1.1。该方法对柑桔类果皮废弃物处理后能够显著提高总黄酮和总酚的含量、提高抗氧化活性；同时，本发明还提供了基于该方法制备的生物制剂以及其用途。

Description

农业废弃物环保化生物处理方法、生物制剂和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农业废弃物环保化生物处理方法、生物制剂和用途。
背景技术
D1：CN2016102347203公开了一种黑曲霉(Aspergillus niger)HC306及在生物转化柚皮苷制备柚皮素中的应用，所述黑曲霉HC306保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号 GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075；该发明黑曲霉HC306无毒无害，使用安全，生长迅速，抗杂菌能力强，批次稳定；发酵培养基成分简单，市场价格低，从而柚苷酶的生产成本较低；将含柚苷酶的粗酶液直接运用于根皮素的制备，免去了酶的分离纯化步骤，有助于降低生产成本；柚皮素的转化得率高，最高可达93.4％，且具有副产物少，产物容易提取等优点。
D2：CN2017103919276公开了一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法。该方法是在缓冲溶液中加入有机溶剂或者离子液体，混匀后加入柚皮苷，以黑曲霉细胞为催化剂催化柚皮苷水解反应，在20～50℃下震荡反应0～48小时，反应结束后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物分离提纯得到高价值、高纯度的柚皮素。该发明柚皮素的制备方法避免了化学法污染大、对设备要求高等缺点，具有选择性好，产物纯度高，且反应条件温和、操作简便、成本低等优点，有利于工业化生产，在食品及医药生产中具有广泛用途。
可见，黑曲霉用于转化桔皮/柚皮中的柚皮苷。
D3：CN202111347934.9公开了一株黑曲霉(Aspergillus niger)，其保藏号为：GDMCC No:61088，并将其命名为：Aspergillus niger CP-2。本发明的黑曲霉分离自陈皮，该黑曲霉具有将橙皮苷转化成橙皮素的作用，其橙皮素的产率能达到60％以上。
D4：CN202010624949.4公开了一株葡萄牙棒孢酵母，其命名为Clavisporalusitaniae CP-1，保藏编号为GDMCC No:61036；该发明还涉及葡萄牙棒孢酵母在发酵生产橙皮素中的应用以及生物转化橙皮苷的方法。该菌株来源于陈皮，属于公认安全菌株，可以在食品中应用，容易培养和保存，通过发酵所得的橙皮素产率可高达74.29％，达到了显著提高产量的目的。
可见，葡萄牙棒孢酵母用于转化桔皮中的橙皮苷。
D5：CN202111088521.3公开了一种柑桔渣基发酵制剂的制备方法，其包括：将柑桔渣与辅料混合均匀，得到固体培养基；提供发酵菌，将其活化培养；将活化培养后的发酵菌接入所述固体培养基发酵培养，即得柑桔渣基发酵制剂成品；其中，所述辅料选用米糠和/或麸皮，所述发酵菌由地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉组成。
D6：CN202110150958.9公开了一种生物发酵制剂及其制备方法。将发酵菌经活化培养后接入由柑桔渣、青梅果提取物、麸皮和尿素组成的固体发酵培养基中进行发酵培养，得到柑桔渣生物发酵制剂；所述发酵菌由黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌组成；该案采用黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌进行发酵以利于黄酮获取。
D7：CN201810895452.9公开了一种复合微生物发酵剂、使用该发酵剂制备的生物发酵饲料及其制备方法。所述复合微生物发酵剂中的黑曲霉、酵母菌和枯草芽孢杆菌在特定比例下协同增效，增强发酵效果。
可见：地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌中一株或多株菌株的复合对柑桔渣、柑桔皮进行发酵处理，以获得黄酮等物质是可行并且广泛使用的。
通过研究发现，对于柑桔渣、柑桔类果皮的发酵处理大多关注总黄酮、总酚等含量，对于总黄酮、总酚的氧化自由基吸收能力的考察现阶段研究的大多在文献中报道较多，具体如下：
D8：《不同酵母菌与植物乳杆菌复合发酵对新会柑酵素品质的影响》，食品工业科技， 2022年3月第43卷第6期，公开了马克斯克鲁维酵母发酵后其发酵液羟自由基清除率和总还原力分别为82.48％和1.09，显著高于其他酵母发酵(P<0.05)；同时，其SOD活力、 DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力分别为161.62U/mL、0.293mg/mL、0.489mg/mL，与其他发酵体系相当，表明该体系发酵条件下新会柑酵素的抗氧化活性更高。综上，马克斯克鲁维酵母与植物乳杆菌复合发酵制备新会柑酵素在活性物质含量和抗氧化能力提升方面优于其他两种复合发酵体系。
D9：《黑曲霉发酵对陈皮黄酮类成分及抗氧化活性的影响》，食品科技，2019年第44卷第12期，公开了发酵陈皮黄酮类成分含量及抗氧化能力较未发酵陈皮均有提高，且随着发酵时间延长，总黄酮、橘皮素含量及清除DPPH自由基能力呈现先增后减趋势，橙皮苷、川陈皮素含量及清除ABTS自由基能力则一直呈现上升趋势。结论：黑曲霉发酵可提高陈皮黄酮类成分含量及抗氧化活性，发酵时间对其影响显著。
通过上述记载，不同的发酵菌会对活性物质含量和抗氧化能力提升有着不同的促进作用，但是要达到最优的效果，需要对发酵菌进行广泛的筛选才能得到。
本案所要解决的技术问题是：如何提高柑桔类果皮废弃物进行废料处理后的总黄酮和总酚的含量、提高抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种农业废弃物环保化生物处理方法，该方法对柑桔类果皮废弃物处理后能够显著提高总黄酮和总酚的含量、提高总黄酮和总酚的抗氧化活性。
同时，本发明还提供了基于该方法制备的生物制剂以及其用途。
本发明的技术方案为：
一种农业废弃物环保化生物处理方法，所述农业废弃物为柑桔类果皮，所述方法具体为：
将果皮打浆、灭菌后得到浆料，将浆料采用复合菌有氧发酵；
所述复合菌为黑曲霉、葡萄牙棒孢酵母、发酵乳杆菌，其比例为0.9-1.1：0.9-1.1：0.9-1.1。在上述的农业废弃物环保化生物处理方法中，接种后的浆料中的复合菌的接种量为 0.9×109-9×109CFU/ml。
在上述的农业废弃物环保化生物处理方法中，发酵条件为：30-40℃条件下发酵12-36h。
在上述的农业废弃物环保化生物处理方法中，所述浆料采用果皮和2倍果皮重量的水打浆制备得到。
同时，本发明还提供了一种生物制剂，采用如上任一所述的方法制备得到。
在上述的生物制剂的用途中，用于柑桔皮渣的发酵，所得发酵产物用于提取活性黄酮类化合物
本发明的有益效果如下：
本发明的方法对柑桔类果皮废弃物处理后能够显著提高总黄酮和总酚的含量、提高抗氧化活性。
附图说明
图1为总黄酮含量测定标准曲线；
图2为总酚含量测定标准曲线；
图3为总黄酮的氧化自由基吸收能力测定标准曲线；
图4为总酚的自由基清除能力测定标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1：
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/ml，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌的比例为1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/ml。其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期 2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavispora lusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌(拉丁文名称：Lactobacillus fermentum) (保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5 楼，保藏日期2018年1月24日，保藏编号GDMCC No：60317)为本实验室从青梅发酵物中分离鉴定，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
实施例2
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量3.0×109CFU/ml，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌0.9:1:1.1，接种量分别为0.9×109CFU/mL、1.0×109CFU/mL和1.1×109CFU/mL。其中黑曲霉(拉丁文名称： Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100 号大院59号楼5楼，保藏日期2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavispora lusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌(拉丁文名称：Lactobacillus fermentum)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2018年1月24日，保藏编号GDMCC No：60317) 为本实验室从青梅发酵物中分离鉴定，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
实施例3
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量9.0×109CFU/mL，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌1.1:1:0.9，接种量分别为3.3×109CFU/mL、3.0×109CFU/mL和2.7×109CFU/mL。其中其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088) 和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavispora lusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌(拉丁文名称：Lactobacillus fermentum)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2018年1月24日，保藏编号GDMCC No： 60317)为本实验室从青梅发酵物中分离鉴定，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例1
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/ml，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：地衣芽孢杆菌的比例为1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/ml。其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期 2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavispora lusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；地衣芽孢杆菌购自上海联祖生物科技有限公司，货号为LZ-J63433，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：35℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例2
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/ml，黑曲霉：枯草芽孢杆菌：酵母菌的比例为1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/ml。黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液；枯草芽孢杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC 1.1665，经LB培养基活化培养制得菌液；酵母菌为市售酿酒酵母菌，购自商城北纳创联生物科技有限公司，编号为 BNCC336054，经YM培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例3
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/ml，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/ml。其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年 7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavisporalusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌为市售菌种，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，编号为ATCC 14931，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例4
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/mL，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/mL。其中黑曲霉为市售菌种，购自商城北纳创联生物科技有限公司，编号为BNCC186380，经PDA液体培养活化培养制得菌液；葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavispora lusitaniae)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)为本实验室从陈皮中分离鉴定，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌(拉丁文名称：Lactobacillus fermentum)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2018年1月24日，保藏编号 GDMCC No：60317)为本实验室从青梅发酵物中分离鉴定，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例5
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/mL，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：发酵乳杆菌1:1:1，每菌接种量0.3×109CFU/mL。其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年 7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)为本实验室从陈皮中分离鉴定，经PDA液体培养活化培养制得菌液；葡萄牙棒孢酵母菌为市售菌种，购自商城北纳创联生物科技有限公司，编号为BNCC140534，经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；发酵乳杆菌(拉丁文名称：Lactobacillus fermentum)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2018年1月24日，保藏编号GDMCC No：60317) 为本实验室从青梅发酵物中分离鉴定，经MRS培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
对比例6
步骤1：南丰蜜桔果皮加2倍质量的水，10000rpm打浆10min得到浆料；
步骤2：灭菌：高压灭菌锅121℃灭菌20min；
步骤3：接种量0.9×109CFU/mL，黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母的比例为1:1，每菌接种量 0.45×109CFU/mL。其中黑曲霉(拉丁文名称：Aspergillus niger)(保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期2020年7月15日，保藏编号GDMCC No：61088)和葡萄牙棒孢酵母菌(拉丁文名称：Clavisporalusitaniae) (保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5 楼，保藏日期2020年5月27日，保藏编号GDMCC No：61036)均为本实验室从陈皮中分离鉴定，黑曲霉经PDA液体培养活化培养制得菌液，葡萄牙棒孢酵母菌经麦芽汁培养基活化培养制得菌液；
步骤4：30℃有氧发酵，24h，中间无需补充活菌，得产物。
性能测试
1.总黄酮含量测试方法
(1)总黄酮提取
分别取果皮发酵前的果浆和发酵后的产物各10ml于100ml烧杯中，加入10ml4.0g/L 的氢氧化钠溶液，用160g/L的氢氧化钠溶液调节pH至13.0；摇匀，静置30min后，再用柠檬酸溶液调节pH至6.0，转移到100ml容量瓶中，定容；过滤，收集滤液，即得总黄酮待测液，备用。
(2)标准曲线绘制
橙皮苷标准品(C28H34O15)，CAS号520-26-3，纯度大于99.0％)。
橙皮苷标准溶液配制(200mg/L)：称取20.0mg橙皮苷，置于50mL烧杯中，加20mL 氢氧化钠溶液(4.0g/L)，待其完全溶解后，用柠檬酸溶液(200g/L)调节pH至6.0，转入100mL容量瓶中，用水定容。此标准溶液需现用现配。
试剂空白溶液：量取20mL氢氧化钠溶液(4.0g/L)于50mL烧杯中，用柠檬酸溶液(200g/L)调节pH至6.0，转入100mL容量瓶中，用水定容。
分别准确吸取0mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL上述橙皮苷标准溶液于六支10mL具塞试管中，用上述试剂空白溶液定容至5.00mL，摇匀；再依次准确加入5mL二甘醇溶液(90％)与0.1mL氢氧化钠溶液(160g/L)，摇匀，配制成0mg/L、 20.0mg/L、40.0mg/L、60.0mg/L、80.0mg/L和100mg/L系列标准溶液。将各试管置于40℃水浴中保温10min；取出，在冷水浴中冷却5min。以零标准溶液调零，在波长420nm处测定各标准溶液的吸光度；绘制标准曲线，参考图1，计算线性回归方程。
(3)测定
吸取1.00mL～5.00mL上述待测液于l0 mL具塞试管中，用试剂空白溶液定容至5.00 mL，准确加入5mL二甘醇溶液(90％)，摇匀后加0.1mL氢氧化钠溶液(160g/L)，摇匀；同时吸取一份等量的待测液，不加氢氧化钠溶液，作为本底空白。将各试管置于40℃水浴中保温10min；取出，在冷水浴中冷却5min。以本底空白溶液调零，测定待测液吸光度，根据标准曲线求出试样溶液的总黄酮质量浓度。
同一样品平行测三次。
(4)结果计算
试样中总黄酮的含量x以橙皮苷当量(mg HE/g)计，按下式计算：
x＝(p×10×100)/(m×V)
式中：p为标准曲线上查出的待测液中橙皮苷的质量浓度，单位为mg/L；V为测定时吸取待测液的体积，单位为mL；m为果皮称取质量，单位为g；10为显色定容体积，单位为mL；100为试料提取体积，单位为mL。
计算结果以重复性条件下获得的三次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留小数点后两位。
2.总酚含量测试方法
(1)总酚提取
分别取果皮发酵前的果浆和发酵后的产物各10ml于100ml烧杯中，加入30mL70％乙醇溶液超声(50kHz，常温)提取30min，超声过程中振摇数次，保持固相完全分散。提取液在9000rpm 4℃下离心5min，上清液即为总酚待测液，备用。
(2)标准曲线绘制
没食子酸标准品(C7H6O5，CAS：149-91-7)，纯度≥98％。
0.5mg/mL没食子酸标准储备液：精确称取12.5mg没食子酸标准品于25mL棕色容量瓶中，用甲醇定容稀释至刻度，4℃避光保存待用，即浓度为0.5mg/mL。
没食子酸标准溶液配制：分别吸取上述没食子酸标准储备液0.0、0.125、0.25、0.50、 1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00mL于25mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，4℃保存待用。没食子酸标准系列浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、60.0、80.0、100.0μg/mL。现用现配。
分别吸取上述没食子酸标准溶液1.00mL于25mL刻度试管中，加入6.00mL去离子水，1.0mol/L Folin-Phenol试剂1.00mL，摇匀，放置6min，再各加入10.6％的碳酸钠溶液4.00mL，摇匀，室温静置60min，用去离子水稀释至刻度，摇匀，在760nm处测定吸光度。以浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，参考图2。
(3)样品测定
取上述总酚待测液1.00mL于25mL刻度试管中，加入6.00mL去离子水，1.0mol/LFolin-Phenol试剂1.00mL，摇匀，放置6min，再各加入10.6％的碳酸钠溶液4.00mL，摇匀，室温静置60min，用去离子水稀释至刻度，摇匀，以不加待测液的溶液调零，在760nm 处测定吸光度。根据标准曲线计算待测液中总酚浓度。
同一样品平行测定三次。
(4)结果计算
试样中总酚的含量y以没食子酸当量(mg GAE/g)计，按下式计算：
y＝(c×V)/(m×1000)
式中：c为从标准曲线上查出的待测液中没食子酸的质量浓度，单位为μg/mL；V为提取液体积，单位为mL，m为果皮称取质量，单位为g。
计算结果以重复性条件下获得的三次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留小数点后两位。
3.氧化自由基吸收能力(ORAC)测试方法：
(1)Trolox标准溶液的制备
Trolox(水溶性维生素E，C14H18O4，CAS：53188-07-1)，纯度≥99％。
精密称取Trolox标准品0.0562g置于15mL离心管中，加入11.23mL磷酸盐缓冲溶液，溶解摇匀，得20mM Trolox母液，分装后置于-20℃冰箱避光储存。实验时用75mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)稀释成系列浓度的Trolox标准溶液制作标准曲线，参考图3。
(2)ORAC测定
向96孔板各孔依次加入20μL缓冲液(75mmol/L PBS)，20μL不同浓度(0.5、1.0、2.0、6.25、12.0mmol/L)Trolox标准品溶液，20μL总黄酮待测液，50μL 200nmol/L荧光试剂，以及20μL AAPH溶液后，将96孔板置于预热至37℃酶标仪中5min，控制激发波长485nm和发射波长530nm处进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度AUC，测定时间一般设定在荧光衰减呈基线后为止，约90次循环(3h)。根据Trolox标准曲线方程，计算各样品以Trolox当量计的自由基吸收能力，结果以μmol TE/g表示。实验进行3 次重复，取平均值得出最终结果。
计算公式：ORAC值＝(AUC样品-AUC空白)/(AUCTrolox—AUC空白)×(Trolox浓度(mmol/L)/样品浓度(g/L))
测定结果以ORAC值表示，得到所有读数经Excel软件处理，计算各样品ORAC值、平均值和相对标准偏差。
4.自由基清除能力(PTIO)测试方法
(1)标准曲线绘制
槲皮素(C15H10O7，CAS：117-39-5)，纯度≥99％。
槲皮素标准溶液制备：精密称取槲皮素标准品0.0302g置于15mL离心管中，加入10mL无水甲醇，溶解摇匀，得10mM槲皮素母液，置于-20℃冰箱避光储存。实验时用95％乙醇稀释成系列浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L)的槲皮素标准溶液制作标准曲线。
标准曲线绘制：向96孔板各孔依次加入80μLPTIO试液，20μL不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L)槲皮素标准品溶液，37℃水浴30min后，将96孔板置于预热至37℃酶标仪中，于560nm测定A值，以浓度(mmol/L)为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，参考图4。
(2)PTIO测定
向96孔板各孔依次加入80μLPTIO试液，20μL总酚待测液，37℃水浴30min后，将 96孔板置于预热至37℃酶标仪中，于560nm测定A值，根据槲皮素标准曲线方程，计算各样品以槲皮素当量计的自由基清除能力，结果以μmol QE/g表示。实验进行3次重复，取平均值得出最终结果。
具体测试结果可见表1-表4。
表1果皮浆发酵前后总黄酮含量比较分析
表2果皮浆发酵前后总酚的含量比较分析
表3果皮浆发酵前后总黄酮的氧化自由基吸收能力(ORAC)比较分析
表4果皮浆发酵前后总酚的自由基清除能力(PTIO)比较分析
数据分析：
通过上述的实施例和对比例我们可以得到以下结论：
1.本发明采用保藏编号为GDMCC No：61088、GDMCC No：61036、GDMCC No：60317 的黑曲霉、葡萄牙棒孢酵母、发酵乳杆菌，对于总黄酮含量、总酚含量，特别是总黄酮、总酚的自由基清除能力提高有明显的促进作用。
2.实施例1和对比例1的对比可以证明，本案的菌种组合优于黑曲霉：葡萄牙棒孢酵母：地衣芽孢杆菌的组合；
3.实施例1和对比例2的对比可以证明，本案的菌种组合优于黑曲霉：枯草芽孢杆菌：酵母菌的组合；
4.实施例1和对比例3-5的对比可以证明，在菌种类别一致的情况下，本案的菌种组合优于市售的菌种替换的方案。
5.实施例1和对比例6的对比例可以，本案的菌种组合中任一是不可或缺的。
6.实施例1-3可以证明，在合适的比例范围和浓度范围内，均可以达到较优效果，但是基于经济性考虑，优选实施例1的配方。
但是并不代表超过本发明的比例范围的方案达不到本案的效果，只是本案在有限次实验中并未有充分的时间予以验证，我们进行合理性推理，超过本发明的范围的比例和浓度依然是有可能达到本案的效果的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种农业废弃物环保化生物处理方法，其特征在于，所述农业废弃物为柑桔类果皮，所述方法具体为：
将果皮打浆、灭菌后得到浆料，将浆料采用复合菌有氧发酵；
所述复合菌由黑曲霉、葡萄牙棒孢酵母、发酵乳杆菌组成，其比例为0.9-1.1：0.9-1.1：0.9-1.1；
所述黑曲霉（Aspergillus niger）的保藏编号为：GDMCC NO：61088；保藏日期：2020年7月15日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
所述葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）的保藏编号为：GDMCC NO：61036；保藏日期：2020年5月27日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
所述发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的保藏编号为：GDMCC NO：60317；保藏日期：2018年1月24日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.根据权利要求1所述的农业废弃物环保化生物处理方法，其特征在于，接种后的浆料中的复合菌的接种量为0.9×109 -9.0×109 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的农业废弃物环保化生物处理方法，其特征在于，发酵条件为：30-40℃条件下发酵12-36 h。
4.根据权利要求1所述的农业废弃物环保化生物处理方法，其特征在于，所述浆料采用果皮和2倍果皮重量的水打浆制备得到。
5.一种生物制剂，其特征在于，采用如权利要求1-4任一所述的方法制备得到。
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