CN113875887A - 柑橘渣基发酵制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其包括：将柑橘渣与辅料混合均匀，得到固体培养基；提供发酵菌，将其活化培养；将活化培养后的发酵菌接入所述固体培养基发酵培养，即得柑橘渣基发酵制剂成品；其中，所述辅料选用米糠和/或麸皮，所述发酵菌由地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉组成。相应的，本发明还公开了一种由上述制备方法制备而得的柑橘渣基发酵制剂及其应用。实施本发明，可有效提升柑橘渣基发酵制剂中黄酮、有机酸、氨基酸的含量，提升其营养价值。

Description

柑橘渣基发酵制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及一种柑橘渣基发酵制剂及其制备方法与应用。
背景技术
柑橘渣是柑橘产业的副产品，约占加工产品的65％。据统计，柑橘渣年产量1331～1664万吨。由于产量大，柑橘渣目前是一种未被充分利用的资源。研究表明，柑橘渣含有丰富的纤维、果胶以及生物活性化合物，具有很高的生物学价值和健康益处。柑橘渣还含有动物健康生长所需的碳水化合物、粗蛋白质和粗脂肪等，是一种有价值的饲料原料。但柑橘渣的粗蛋白含量非常低，因此如果要将其用于动物饲料，则必须增加一种丰富废弃物营养价值的方法。
现有技术也有将柑橘渣应用于发酵饲料，如专利CN106035990A采用柑橘渣、麦麸、酒糟、红糖作为培养基，采用热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、短乳杆菌进行发酵。通过发酵提升了粗蛋白和粗脂肪的含量。专利CN109907161A采用柑橘渣，红薯渣，果渣，麸皮，棉籽饼为培养基，经发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母发酵制得。上述专利中均只考察了发酵对于粗蛋白、粗脂肪含量的影响，并未公开对于其他有利物质的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，制备得到发酵制剂的总黄酮含量高，营养价值高。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种柑橘渣基发酵制剂。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述的柑橘渣基发酵制剂在在动物饲料中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其包括：
将柑橘渣与辅料混合均匀，得到固体培养基；
提供发酵菌，将其活化培养；
将活化培养后的发酵菌接入所述固体培养基发酵培养，即得柑橘渣基发酵制剂成品；
其中，所述辅料选用米糠和/或麸皮，所述发酵菌由地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉组成。
作为上述技术方案的改进，所述固体培养基中柑橘渣与米糠的重量比为8:2。
作为上述技术方案的改进，所述固体培养基的含水率为50～70％。
作为上述技术方案的改进，所述发酵菌的接种量为5～10％。
作为上述技术方案的改进，所述发酵菌中地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉的接种比例为1:1:1。
作为上述技术方案的改进，所述发酵培养为有氧发酵，发酵培养温度为20～35℃，发酵培养时间为4～8d。
作为上述技术方案的改进，所述活化培养的步骤包括：将各种发酵菌分别接种至液体培养基培养。
相应的，本发明还公开了一种柑橘渣基发酵制剂，其由上述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法制备而得。
相应的，本发明还公开了上述的柑橘渣基发酵制剂在动物饲料中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明采用柑橘渣、米糠和/或麸皮作为固体培养基，接种地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉复合发酵菌进行发酵，得到的柑橘渣基发酵制剂中黄酮、有机酸、氨基酸含量较高，营养价值更高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供了一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将柑橘渣和辅料混合均匀，得到固体培养基；
其中，辅料选用米糠和/或麸皮，但不限于此。优选的，辅料选用米糠。其中柑橘渣与米糠的重量比为(6～9)：(1～4)，示例性的为6:4、7:3、8:2、9:1，但不限于此。进一步优选的，柑橘渣与米糠的重量比为8:2。
其中，固态培养基的含水率为50～70％，示例性的为51％、55％、57％、62％、64％、67％或69％，但不限于此。
本发明采用固态培养基进行固态发酵，其可降低能耗，提升产量，降低有害物排放。
(2)提供发酵菌，将其活化培养；
其中，发酵菌由地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉组成。这三种菌是生物安全微生物，能够产生丰富的酶，有助于大分子底物的降解、成分转化以及新化合物的合成，从而改善发酵后底物的营养和功能特性。此外，这三种菌可在木质素和糖类化合物上有氧生长，故可采用有氧发酵工艺。采用以上三种菌混合发酵所得的发酵制剂中粗脂肪、总黄酮含量有明显的增长。
其中，活化培养的步骤包括：将各种发酵菌分别接种至液体培养基培养。具体的，在本发明的一个实施例中，地衣芽孢杆菌的活化培养方法为：将地衣芽孢杆菌保存液于灭菌营养肉汤培养基中，30～40℃振荡培养20～30h，然后用灭菌水调整至菌液浓度为1～2×105CFU/mL。葡萄牙棒孢酵母的活化培养方法为：取葡萄牙棒孢酵母保存液于灭菌马铃薯葡萄糖培养基中，25～35℃振荡培养20～30h，然后用灭菌水调整至菌液浓度为1～2×105CFU/mL。黑曲霉的活化培养方法为：将黑曲霉孢子液涂布到马铃薯葡萄糖琼脂培养基的表面，25～35℃培养5～7天，然后用无菌水调整之浓度为1～1.5×107个/mL的孢子悬浮液。
需要说明的是，步骤(1)和步骤(2)不分先后，在实施过程中，可先实施步骤(1)，再实施步骤(2)；也可先实施步骤(2)，再实施步骤(1)；或者可同时实施步骤(1)和(2)。
(3)将活化培养后的发酵菌接入所述固体培养基发酵培养，即得柑橘渣基发酵制剂成品；
具体的，发酵菌的接种量为5～10％，示例性的为5％、5.5％、6％、7％、8％或9.5％，但不限于此。其中，三种菌的接种量相同或不同；优选的，三者的接种量相同，为1:1:1。
具体的，发酵为有氧发酵，其温度为20～35℃，示例性的为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃或34℃，但不限于此。发酵时间为4～8d，示例性的为4d、4.5d、5d、5.5d、6d、7d或7.5d，但不限于此。
下面以具体实施例对本发明进行说明。
以下实施例中地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉均来源来自广东省农科院动物科学研究所。
实施例1
本实施例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其包括：
(1)将发酵菌活化培养；
取0.1mL地衣芽孢杆菌保存液于100mL灭菌营养肉汤培养基中，37℃振荡培养24h，用灭菌水调整上述菌液浓度为1.0×105CFU/mL的种子液，备用。
取0.1mL葡萄牙棒孢酵母保存液于100mL灭菌马铃薯葡萄糖培养基中，28℃振荡培养24h。用灭菌水调整上述菌液浓度为1.0×105CFU/mL的种子液，备用。
将0.2mL2×108个/mL黑曲霉孢子液涂布到马铃薯葡萄糖琼脂培养基的表面，28℃培养6天。用无菌水获得孢子悬浮液(浓度为1×107个/mL)，作为种子液。
(2)将柑橘渣与米糠按照8:2质量比混合均匀，控制含水量为60％，每菌接种量为2％，pH自然，每个发酵瓶200g发酵基质，松散储存，采用透气膜封口进行有氧发酵，发酵7d，即得。
对比例1
本对比例采用未发酵的柑橘渣。
对比例2
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，仅接种地衣芽孢杆菌，接种量为2％。
对比例3
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，仅接种葡萄牙棒孢酵母，接种量为2％。
对比例4
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，仅接种黑曲霉，接种量为2％。
对比例5
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，接种地衣芽孢杆菌和葡萄牙棒孢酵母，每种菌种的接种量为2％。
对比例6
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，接种地衣芽孢杆菌和黑曲霉，每种菌种的接种量为2％。
对比例7
本对比例提供一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于，接种葡萄牙棒孢酵母和黑曲霉，每种菌种的接种量为2％。
将实施例1、对比例2～7的发酵产物冷冻干燥，然后粉碎过40目筛；将对比例1的柑橘渣粉碎过40目筛，然后一起进行测试。其中，粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮仪(FOSS8400)测定，粗脂肪(EE)含量采用全自动脂肪仪(FOSS)测定，粗纤维(CF)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)采用纤维仪(Ankom 220)测定，钙、磷含量分别EDTA滴定法和钼酸铵分光光度法测定，碳水化合物＝100-CP-EE-灰分，黄酮含量测定参考文献(Wang J,CaoF,Su E,et al..Improvement of Animal Feed Additives of Ginkgo Leaves throughSolid-state Fermentation using Aspergillus niger[J].International Journal ofBiological Sciences,2018,14(7):736-747.)。水解氨基酸采用酸水解法用氨基酸分析仪(Hitachi L8900)测定。根据《GB 5009.157-2016食品有机酸的测定》测定乳酸、苹果酸、柠檬酸含量。根据文献(白杰,李德芳,陈安国,等.HPLC法测定红麻青贮饲料中的有机酸[J].中国麻业科学,2016,38(3):105-110.)测定乙酸、丙酸、丁酸含量。
具体结果如以下几表所示。表中数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法进行多重比较。结果用平均值±标准误差表示，P<0.05为差异显著。
表1实施例1、对比例1～7所得发酵制剂的营养成分和总黄酮含量表
Figure BDA0003266666330000051
Figure BDA0003266666330000061
从表1可以看出，对比例2～7、实施例1的pH均在4.20以下，小于对比例1(未发酵柑橘渣)，这表明发酵效果较优。其中，对比例4～7，实施例1的pH显著低于对比例1～3。
此外，由表1可知，与未发酵的对比例1相比，发酵的对比例2～7、实施例1均显著增加了粗蛋白质含量(9.81％～27.22％)和总黄酮含量(180％～303.33％)，其中对比例4、对比例6～7、实施例1的粗蛋白含量和总黄酮含量显著高于对比例2、对比例3和对比例5(P<0.05)，实施例1的总黄酮含量显著最高(P<0.05)。与未发酵的对比例1相比，对比例3～4、对比例6～7、实施例1的粗脂肪含量均显著增加(P<0.001)，实施例1的粗脂肪含量显著最高(P<0.001)，对比例1与对比例2、对比例5的粗脂肪含量差异不显著(P>0.05)。与对比例1～对比例3、对比例5相比，对比例4、对比例6～7、实施例1的粗纤维含量、酸性洗涤纤维含量、中性洗涤纤维含量、钙含量显著增加(P<0.001)，但碳水化合物含量显著下降(P<0.001)。与对比例1相比，对比例2、对比例3、对比例5的粗纤维含量、酸性洗涤纤维含量、中性洗涤纤维含量、钙含量差异不显著(P>0.05)。实施例1的磷含量显著高于其他组(P<0.001)。对比例6～7、实施例1的灰分含量显著高于对比例2～3(P<0.05)。
表2实施例1、对比例1～7所得发酵制剂的水解氨基酸含量表(g/kg DM)
Figure BDA0003266666330000062
Figure BDA0003266666330000071
由表2可知，与对比例1～3、对比例5相比，对比例4、对比例6～7、实施例1的苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸的含量和必需氨基酸/总氨基酸比例显著增加(P<0.001)，但脯氨酸含量和非必需氨基酸/总氨基酸比例显著降低(P<0.001)。对比例4、对比例6～7、实施例1发酵柑橘渣苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、必需氨基酸含量较对比例1分别提高了35.29％、56.25％～68.75％、25％、26.31％～31.57％、17.39％～26.09％、25％～33.33％、12.75％～26.85％。与对比例1～3、对比例5相比，对比例4、对比例7、实施例1的亮氨酸、苯丙氨酸、总氨基酸显著提高(P<0.05)。实施例1的缬氨酸、异亮氨酸、精氨酸、总必需氨基酸含量显著高于对比例2～7(P<0.05)。对比例2～7的精氨酸含量显著低于实施例1和对比例1(P<0.05)，实施例1的精氨酸含量与对比例1差异不显著(P>0.05)。
表3实施例1、对比例1～7所得发酵制剂的必需氨基酸组成表
Figure BDA0003266666330000072
由表3可知，与对比例1～3、对比例5相比，对比例4、对比例6～7、实施例1的赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸+苯丙氨酸、必需氨基酸的组成显著提高(P<0.001)。对比例4、对比例6～7、实施例1的赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、赖氨酸+苯丙氨酸组成高于或接近于鸡蛋蛋白模式，均高于FAO模式。实施例1的缬氨酸和异亮氨酸组成显著高于对比例(P<0.001)，且高于FAO模式。实施例1、对比例1～8的胱氨酸+蛋氨酸组成均低于鸡蛋蛋白模式和FAO模式。
表4实施例1、对比例1～7所得发酵制剂的有机酸含量表(g/kg DM)
Figure BDA0003266666330000081
由表3可知，对比例4、对比例6～7、实施例1的柠檬酸、乳酸、总有机酸含量显著高于对比例1、对比例2～3、对比例5(P<0.001)。实施例1的柠檬酸含量显著高于对比例4、对比例6～7(P<0.001)。与柠檬酸、乳酸相反，对比例4、对比例6～7、实施例1的苹果酸含量显著低于对比例1、对比例2～3、对比例5(P<0.001)，对比例6～7的苹果酸含量显著最低(P<0.001)。对比例3、对比例5的乙酸含量显著高于其他组(P＝0.009)。对比例4、实施例1的丙酸含量显著高于对比例1、对比例2～3、对比例5～6(P＝0.001)。对比例1、对比例2～3未检出丁酸。
通过表1～4的数据说明，采用本发明中的地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉作为复合菌对柑橘渣进行发酵，可有效提升发酵制剂中的营养成分含量，尤其是提升黄酮、有机酸、氨基酸的含量。
实施例2
以实施例1得到的发酵制剂进行饲喂价值评定。试验分为5个处理组，每个处理组6个重复，每个重复30只肉鸡(22～42日龄商品鸡)。逐栏称重后调整值各处理组体重无明显差异。在基础日粮中分别添加0％，10％，15％，20％，30％(干物质基础)的实施例1得到的发酵制剂，各组充分混合，即可饲喂。饲喂20天后，测定的生长性能，具体数据如下表所示：
0％ 10％ 15％ 20％ 30％
始重(kg) 0.38±0.11 0.38±0.10 0.38±0.11 0.38±0.09 0.38±0.11
末重(kg) 1.01±0.23 1.12±0.15 1.09±0.13 1±0.31 0.98±0.15
日采食量(g) 68±0.5 71±0.6 72±0.6 66±0.3 62±0.4
日增重(g) 30±0.4 34±0.6 33±0.8 29±0.7 28±0.3
料重量比 2.25±0.44 2.12±0.12 2.15±0.36 2.31±0.21 2.3±0.35
从表中来看，饲喂肉鸡10％和15％发酵柑橘渣，降低了肉鸡料重比，提高生产性能。添加20％和30％发酵柑橘渣不影响肉鸡料重比，可以降低肉鸡生产的饲料成本。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，包括：
将柑橘渣与辅料混合均匀，得到固体培养基；
提供发酵菌，将其活化培养；
将活化培养后的发酵菌接入所述固体培养基发酵培养，即得柑橘渣基发酵制剂成品；
其中，所述辅料选用米糠和/或麸皮，所述发酵菌由地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉组成。
2.如权利要求1所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述固体培养基由柑橘渣和米糠组成，所述柑橘渣与米糠的重量比为(6～9)：(1～4)。
3.如权利要求1所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述固体培养基中柑橘渣与米糠的重量比为8:2。
4.如权利要求1至3任一项所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于所述固体培养基的含水率为50～70％。
5.如权利要求1所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵菌的接种量为5～10％。
6.如权利要求5所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵菌中地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母、黑曲霉的接种比例为1:1:1。
7.如权利要求1所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养为有氧发酵，发酵培养温度为20～35℃，发酵培养时间为4～8d。
8.如权利要求1所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法，其特征在于，所述活化培养的步骤包括：将各种发酵菌分别接种至液体培养基培养。
9.一种柑橘渣基发酵制剂，其特征在于，其由如权利要求1至8任一项所述的柑橘渣基发酵制剂的制备方法制备而得。
10.如权利要求9所述的柑橘渣基发酵制剂在动物饲料中的应用。
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CN115404242A (zh) * 2022-07-04 2022-11-29 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 农业废弃物环保化生物处理方法、生物制剂和用途
CN115404242B (zh) * 2022-07-04 2023-08-18 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 农业废弃物环保化生物处理方法、生物制剂和用途

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