CN112586596A - 一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法 - Google Patents

一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法。所述方法为以灭菌后的茶渣和玉米粉混合物为发酵基质，其质量比为6:4~7:3，加水混匀，控制料液比为4:6~5:5，然后接种康宁木霉孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中孢子的浓度为1×106~1×108个/mL，接种量为4~10%，物料混匀后透气封口，在25~34℃条件下发酵6~10d，发酵结束后烘干即可。本发明首次以康宁木霉作为发酵菌株对茶渣进行发酵处理，经发酵处理，提高了茶渣中粗蛋白、粗脂肪、还原糖和黄酮含量，分解了皂苷，并保持咖啡碱的含量适中；此外，发酵后茶渣中的氨基酸的丰度和含量均有显著性的提升，一方面提高了茶渣的营养价值，另一方面，改善了茶渣作为动物饲料添加剂的适口性，提高茶渣作为动物饲料添加剂的应用率。

Description

一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法
技术领域
本发明涉及茶渣发酵利用技术领域，更具体地，涉及一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法。
背景技术
茶是中国的传统饮料，是仅次于水的全球第二大最常用的饮料。2018年，全球茶叶产量约为5.68亿吨。中国茶渣的排放量约为每年16万吨。大量茶叶废料在开放的环境中产生和丢弃，这些可再生的生物质资源给环境带来了巨大的压力，同时也浪费了茶叶中的生物活性成分。茶渣的资源化利用已成为亟待解决的问题。
动物研究表明，茶渣不仅能提高动物的免疫力，调节肌肉纤维类型，还能改善动物的消化能力、肉品质、抗氧化能力和肠道形态。因此，茶渣是一种很有前途的饲料添加剂。但茶渣中含有皂甙、咖啡因等抗营养因子，适口性差，不适合作为饲料添加剂直接使用。
康宁木霉(Trichoderma koningii，T.koningii)能够在不利的环境条件下繁殖，以及能够使用不同的碳源和氮源。康宁霉素的应用较为广泛，但多集中在发酵制备纤维素酶、或作为生防菌，防止各种有害病原菌，还暂未见其发酵茶渣的研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于，为扩展康宁木霉的应用价值，同时也为了提高茶渣作为动物饲料添加剂的营养价值，提供一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法。本发明所述固态发酵方法，是以茶渣和玉米粉为发酵基质，康宁木霉的发酵菌株进行固态发酵，经过发酵，提高茶渣中的粗蛋白、粗脂肪、还原糖和黄酮的含量，降低皂苷的含量，保证咖啡碱的含量适中；同时增加茶渣中动物可直接吸收和应用的氨基酸的含量，并提高风味氨基酸的含量，增加茶渣作为动物饲料添加剂的营养和适口性，提高茶渣作为动物饲料添加剂的利用率。
本发明的另一目的在于提供经所述康宁木霉发酵后的茶渣。
本发明的再一目的在于提供经所述康宁木霉发酵后的茶渣作为动物饲料添加剂的应用。
本发明的还一目的在于提供所述康宁木霉在提高茶渣营养价值中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法，以灭菌后的茶渣和玉米粉混合物为发酵基质，其质量比为6:4～7:3，加水混匀，控制料液比(质量比)为4:6～5:5，然后接种康宁木霉孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中孢子的浓度为1×106～1×108个/mL，接种量为4～10％，物料混匀后透气封口，在25～34℃条件下发酵6～10d，发酵结束后烘干即可。
本发明所述经康宁木霉发酵之后茶渣的营养价值，采用综合评分进行评估，主要以粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、还原糖、黄酮、皂苷和咖啡碱的含量进行评估，其占比分别为25％、20％、10％、15％、15％、15％。每个样品的总分是所有指标的总和。每个指标的平均值为平均分数，最佳结果定义为对应的最高分，最低结果定义为0分，最佳/差结果与平均结果设置中间分。
此外，由于发酵后的茶渣作为饲料添加剂进行应用时，除了上述评价指标之外，还涉及到其适口性的提升以及可利用氨基酸，而适口性的影响因素，除了皂苷和咖啡碱之外，其中各种风味氨基酸的含量同样也是影响因素之一。而本申请所述固态发酵方法制备得到的茶渣，其中可被动物直接吸收和利用的氨基酸的含量相比较未发酵的茶渣而言，具有显著性的提升，同时其中的风味氨基酸的种类和含量也明显提升，有利于提高茶渣的风味，改善茶渣的适口性。
优选地，所述孢子悬浮液中孢子的浓度为1×108个/mL。
优选地，发酵结束后，烘干的温度为65℃。
优选地，所述发酵基质中，茶渣和玉米粉的质量比为7:3。
优选地，所述发酵基质和水的料液比(质量比)为5:5。
优选地，所述康宁木霉的接种量为8％。
优选地，发酵的温度为31℃。
优选地，所述发酵的时间为6d。
优选地，所述茶渣为茶叶经冲泡、制备成茶饮料或提取茶功能物质(茶多酚、茶皂素、咖啡碱等)后的茶废弃物，包括碎茶、旧茶、茶修剪枝叶或茶提取残渣。
经过大量的实验筛选后，以上述综合评分标准进行评价，当发酵基质中，茶渣和玉米粉比例、发酵基质和水的比例，康宁木霉的接种量以及发酵温度和时间在上述范围内时，发酵后的茶渣的综合得分最高，其营养价值最高。
本发明同时还保护经由上述所述固体发酵方法制备得到的高营养价值的茶渣。
所述经康宁木霉固体发酵后的茶渣作为动物饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之类。
优选地，所述经康宁木霉固体发酵后的茶渣在动物饲料中的添加质量比例为1％～60％。
优选地，所述动物饲料添加剂为鸡饲料、鸭饲料、猪饲料、反刍动物饲料或鱼饲料的添加剂。
本发明还保护所述康宁木霉在提高茶渣营养价值中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述固态发酵方法，首次以康宁木霉作为发酵菌株对茶渣进行发酵处理，经发酵处理，提高了茶渣中粗蛋白、粗脂肪、还原糖和黄酮含量，分解了皂苷，并保持咖啡碱的含量适中，既有利于茶渣营养价值的提高，又能够改善茶渣的适口性，同时其作为动物饲料添加剂应用时，有利于动物的健康。
此外，经康宁木霉发酵，茶渣中的氨基酸的丰度和含量均有显著性的提升，一方面提高了茶渣的营养价值，另一方面，茶渣中的风味氨基酸的含量增加，改善了茶渣的风味，进而改善了茶渣作为动物饲料添加剂的适口性，提高茶渣作为动物饲料添加剂的应用率。
附图说明
图1为茶渣发酵不同时间后，其发酵产物中各物质的含量变化。
图2为茶渣发酵前后游离氨基酸含量的变化。
图3为茶渣发酵前后风味氨基酸含量的变化。
图4为茶渣发酵前后水解氨基酸含量的变化。
图5为经康宁木霉发酵后的茶渣中不同溶剂提取物的自由基清除作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1茶渣发酵条件的筛选
以下实施例采用的茶渣均由康师傅饮料有限公司提供，为茶饮料生产后产生的茶渣，经60℃干燥后，研磨成粉，过40目筛。所采用的康宁木霉(T.koningii)为GenBank:KY764915.1，与文献Trichoderma koningii isolate CTCCSJ-G-HB40448 small subunitribosomal RNA gene,partial sequence；internal transcribed spacer 1 and 5.8Sribosomal RNA gene,complete sequence；and internal transcribed spacer 2,partial sequence中的菌株为相同。其中，康宁木霉菌液的制备如下：
真菌扩增及孢子液的制备：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用作扩增培养基。将0.2mL 2～3×108个/mL康宁木霉孢子液涂布到PDA培养基的表面，28℃培养5～7天；待真菌长满培养及表面后，采用无菌刀片刮擦培养基表面；再用5mL无菌水把真菌及表面培养基转移到15mL离心管中，匀浆15min；最后，悬浮液过滤两次得孢子悬浮液，并使用血球计数板对孢子的浓度进行计数，控制孢子浓度为1×107个/mL，备用。
发酵过程以茶渣和玉米淀粉为发酵基质进行发酵，具体过程如下：
将40g发酵基质放入200mL瓶中，121℃灭菌20min；冷却后，每个瓶中加入相应量的孢子悬浮液，用无菌玻璃棒将孢子悬液和底物搅拌50次以上均匀，最后用透气盖封口，然后进行发酵。
1、单因素试验
在自然pH下，研究上述发酵过程中，其中的基质比例(茶渣：玉米粉重量比)、料液比(基质：水，m/V)、接种量(菌液的加入量占发酵基质与水总质量的比例)、温度和时间对茶渣发酵效果的影响。以粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、还原糖、黄酮、皂苷和咖啡碱含量为测定指标，选出较好的单因素水平，据此进行下一个单因素试验，每水平3个重复。
(1)基质比例的影响
上述发酵过程中，料液比为4:6，接种量为4％，温度为28℃，时间为8d，发酵基质中，茶渣和玉米粉的质量比分别设定为6:4、7:3、8:2和9:1进行发酵。
(2)料液比的影响
上述发酵过程中，茶渣和玉米粉的质量比按照(1)中确定的最佳比例设定，接种量为4％，温度为28℃，时间为8d，料液比设为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3分别进行发酵。
(3)接种量的影响
上述发酵过程中，茶渣和玉米粉的质量比按照(1)中确定的最佳比例设定，料液比按照(2)中确定的最佳比例设定，温度为28℃，时间为8d，接种量设为2％、4％、6％、8％、10％分别进行发酵。
(4)温度的影响
上述发酵过程中，茶渣和玉米粉的质量比按照(1)中确定的最佳比例设定，料液比按照(2)中确定的最佳比例设定，接种量按照(3)中确定的最佳比例设定，发酵时间为8d，温度设为25、28、31、34、37℃分别进行发酵。
(5)时间的影响
上述发酵过程中，上述发酵过程中，茶渣和玉米粉的质量比按照(1)中确定的最佳比例设定，料液比按照(2)中确定的最佳比例设定，接种量按照(3)中确定的最佳比例设定，发酵温度按照(4)中确定的最佳比例设定，发酵时间设为0、2、4、6、8、10、14、22d分别进行发酵。
2、指标测定
发酵结束后，物料进行冷冻干燥，粉碎过40目筛。其中，CP含量测定参照GB/T6432-1994，EE含量测定参照GB/T6433-2006，还原糖含量采用二硝基水杨酸法测定，黄酮含量测定根据Wang在文章Improvement of animal feed additives of Ginkgo leaves throughsolid-state fermentation using Aspergillus niger中记载的方法，皂苷含量测定参照孙万里在茶皂素提取条件的优化及纯化研究中记载的方法，咖啡碱含量测定参照GB/T8312-2013。
3、发酵效果评价
参照Wang在文章Improvement of animal feed additives of Ginkgo leavesthrough solid-state fermentation using Aspergillus niger和Guarda在文章Different hydrocolloids as bread improvers and antistaling agents中记载的方法，使用综合评分评估发酵效果。CP、EE、还原糖、黄酮、皂苷、咖啡碱分别占比25％、20％、10％、15％、15％、15％。每个样品的总分是所有指标的总和。每个指标的平均值为平均分数，最佳结果定义为对应的最高分，最低结果定义为0分，最佳/差结果与平均结果设置中间分。
发酵效果的评分表如下所示：
Figure BDA0002824278970000061
其中，CP、EE、还原糖和黄酮，是含量最高对应最高分，含量最低对应最低分；而皂苷和咖啡碱含量最低对应的是最高分，含量最高对应最底分。
4、数据处理
用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法进行多重比较。用GraphPad Prism 8.0作图。结果用平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著。
5、结果
1.1基质比例(茶渣：玉米粉)对发酵茶渣的影响
由表2可知，随着茶渣含量的增加，发酵茶渣的CP、皂苷、咖啡碱含量增加(P<0.05)，而还原糖含量则降低(P<0.05)。当茶渣与玉米粉比例为9:1时，发酵茶渣的CP、EE、皂苷和咖啡碱的含量最高(P<0.05)。基质比例对发酵茶渣的黄酮含量无显著影响(P>0.05)。茶渣与玉米粉比例为7:3的发酵茶渣综合评分最高。
表2基质比例(茶渣：玉米粉)对发酵茶渣的影响以及得分情况
Figure BDA0002824278970000062
同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)，下表/图同。
参照上述发酵效果的评分表进行计分，表2中，各项的得分情况如表2所示。
茶渣的CP、皂苷、咖啡碱含量较高，当茶渣添加比例增加，这些成分的含量也随之增加；而还原糖含量的降低主要是由于玉米粉添加比例的降低造成的。由于玉米粉经过高压灭菌后，可产生大量还原糖；因此玉米粉添加量减少，混合物的还原糖含量随之减少。黄酮存在于茶渣中，在玉米粉中未检测到；试验前猜测随着茶渣添加量的增加，黄酮含量应当提高，但结果表明基质比例对发酵茶渣的黄酮含量无显著影响，可见其含量与康宁木霉对黄酮的代谢转化有关。
基质比为7:3的发酵茶渣综合评分最高，即以较少的玉米粉配合茶渣发酵，生产含量较高的CP和还原糖，以及含量较少的皂苷和咖啡碱的发酵产物。
1.2料液比(基质：水)对发酵茶渣的影响
由表3可知，EE含量随着料液比的增大而显著降低(P<0.05)，而还原糖含量则显著增加(P<0.05)。料液比为4:6时，黄酮含量最高，随后是5:5、6:4、3:7，7:3时最低(P<0.05)。料液比为3:7的茶渣皂苷含量显著高于其他比例(15.03％～21.58％)(P<0.05)。料液比为7:3的茶渣咖啡碱含量显著低于其他比例(12.31％～14.72％)(P<0.05)。料液比为5:5的发酵茶渣综合评分最高。
表3料液比(基质：水)对发酵茶渣的影响
Figure BDA0002824278970000071
从表3中可知，随着水分含量的增加，还原糖含量显著降低，这可能由于高水分导致纤维素酶产生的减少，对纤维素降解能力减弱，导致还原糖的减少。高水分改变底物颗粒的结构，气体体积减少，微生物生长减少。结果表明，低水分有利于咖啡碱的降解，不利于EE的生成。料液比为5:5的发酵茶渣综合评分最高，符合霉菌的生长繁殖所需的水分含量为40％～50％。
1.3接种量对发酵茶渣的影响
由表4可知，不同接种量对发酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡碱含量无显著影响(P>0.05)。接种量为8％和10％的茶渣还原糖含量显著高于其他接种量(P<0.05)。接种量为2％、4％、8％的茶渣黄酮含量显著高于6％和10％的发酵茶渣(P<0.05)。接种量为8％的发酵茶渣综合评分最高。
表4接种量对发酵茶渣的影响
Figure BDA0002824278970000081
在发酵过程中，接种量可能会明显影响发酵过程中的微生物生长速率。较高的接种量可能会加快真菌的生长速度，但同时会增加营养物质的消耗速度；从而影响真菌的生长；但当接种量较小，又延长了发酵过程所需的时间，增加了时间成本。从表4中可知，在本次试验中，不同接种量对发酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡碱含量无显著影响。这可能由于8天的生长，所有培养基中康宁木霉均达到了最大的生物量，对茶渣的代谢转化达到最高值。接种量为8％的发酵茶渣还原糖和黄酮含量最高，因此综合评分最高。
1.4温度对发酵茶渣的影响
由表5可知，当温度为31℃时，发酵茶渣的CP含量显高于25和28℃(P<0.05)，31～37℃的CP含量没有显著变化(P>0.05)。25和31℃时，发酵茶渣还原糖含量显著高于其他温度(P<0.05)。25℃发酵茶渣的黄酮含量较其他温度显著提高24.81％～46.12％(P<0.05)。34℃的皂苷含量最低。31～34℃时，咖啡碱含量显著高于其他温度(P<0.05)。温度为31℃的发酵茶渣综合评分最高。
表5温度对发酵茶渣的影响
Figure BDA0002824278970000082
Figure BDA0002824278970000091
发酵过程中，温度对微生物代谢有重要影响。温度过高或过低，均会抑制微生物的生长和代谢。康宁木霉的最佳生长温度是25～30℃，但能生长温度较广。不同生长温度对代谢物的生成或转化同样有重要影响，与最佳生长温度不一定一致。
从表5中可知，发酵温度在25～31℃的范围内，CP产量显著增加。上述结果表明，茶渣CP可能在较高温度下生成；康宁木霉发酵茶渣在25℃和31℃能产生较高含量的还原糖；在25℃的黄酮含量最高，表明康宁木霉在较低温度时累积黄酮。康宁木霉在34℃降解皂苷的效果最佳。咖啡碱含量在31℃和34℃时含量最高，可考虑优化条件富集咖啡碱。可见，不同营养成分/功能成分的最佳生成温度不同。通过综合评分，31℃为最佳发酵温度。
1.5时间对发酵茶渣的影响
茶渣发酵时间不同时，发酵物中各物质的含量变化情况如表1所示，其中标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。由图1可知，发酵时间对茶渣营养成分及功能成分的影响不同。随着发酵时间的增加，CP和咖啡碱含量增加。与未发酵茶渣相比，发酵22d的茶渣CP和咖啡碱含量分别显著提高34.21％和45.61％(P<0.05)。发酵2d的茶渣还原糖含量较未发酵茶渣显著增加1039.13％(P<0.05)，此后随着时间增加而显著减少(P<0.05)，但均显著高于未发酵茶渣(P<0.05)。发酵6d，黄酮含量显著提高并达到最高值(P<0.05)，随着时间增加而逐步降低。随着发酵时间的增加，茶渣皂苷的含量降低。与未发酵的茶渣相比，22d的茶渣皂苷含量显著降低36.23％(P<0.05)。发酵时间对茶渣粗脂肪含量无显著影响(P>0.05)。
由表6可知，发酵6d的茶渣综合评分最高。
表6时间对发酵茶渣评分的影响
时间Time/d 2 4 6 8 10 14 22
得分Scores 48.75 52.5 63.75 61.25 67.5 56.25 60
发酵时间是影响茶渣营养价值的因素之一。从图1中可知，发酵茶渣CP含量随着时间增加而增加，这可能是由于茶渣中菌体蛋白的不断累积所致；而EE不受发酵时间影响，可能是康宁木霉不利用茶渣中的EE，也有可能是康宁木霉代谢与合成的EE成分相互抵消，如康宁木霉的绿色孢子，色素可溶于乙醚；还原糖是许多生物过程和酶反应的最终产物，真菌代谢产生的纤维素酶可以催化纤维素转化为还原糖[28,29]。
还原糖在第2d达到最高值，这是康宁木霉的进入快速增长期，菌体生长迅速，代谢活性高的表现。虽然，还原糖含量随时间延长较第2d下降，但依然高于未发酵的茶渣。这说明，真菌发酵茶渣能产生的大量还原糖。
黄酮含量在第6d最高，此后下降。这说明菌体对黄酮的转化达最高值，随着康宁木霉的生长，黄酮又被吸收代谢。黄酮具有很强的抗氧化能力，这是促进改善动物肠道和免疫功能的主要特性之一。
高水平的皂苷会降低动物对营养的吸收，限制了茶渣在饲料中的使用，因此为了提高茶渣在饲料中的可利用性，需要降低皂苷的含量。从图1中可知，随着发酵时间的延长，茶渣皂苷含量呈现不断降低的趋势，可见，康宁木霉的发酵，可有效增加皂苷的降解，提高茶渣在饲料中的可利用性，本次试验也是首次发现康宁木霉能够降解茶渣中的皂苷。
从图1中可知，发酵茶渣的咖啡碱含量随时间增加而提高。虽然咖啡碱对于茶渣的适口性有所影响，但是因为咖啡具有抗氧化、抗糖尿病、刺激中枢神经系统和血液循环，因此适量的咖啡碱，对于动物具有一定的好处。
综合以上情况，发酵6d的综合评分最高，可见茶渣发酵6d即可使用，同时6～10d的评分接近，说明发酵茶渣在一定时间保存，营养价值不会降低。
综上，经单因素分析表明，康宁木霉发酵茶渣的最佳条件是：茶渣与玉米粉重量比例为7:3，料液比为5:5，接种量为8％，温度为31℃，发酵6d。
实施例2康宁木霉发酵对于茶渣中氨基酸种类和含量的影响
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在体内起重要作用，其缺乏或比例不当，均会影响动物的生长发育。水解氨基酸是氨基酸平衡和蛋白质优良的指标。水解氨基酸组成和含量的改善，有益于增加茶渣的营养价值。
游离氨基酸是动物良好的营养素来源，可以被动物直接吸收和使用，因此FAA含量越高，表明其营养价值越高。另外，游离氨基酸反映了茶渣的感官风味，是主要的风味成分，影响茶渣的适口性。因此，以氨基酸的种类和含量为指标，测试茶渣经康宁木霉发酵前后的营养价值变化。
以实施例1中经过筛选后得到的最佳发酵条件进行发酵，然后测试发酵后的茶渣中氨基酸种类和含量的变化。
提取过程：
测试水解氨基酸含量时，茶渣的提取过程为：用10mL HCl(6mol/L)稀释0.1g发酵的或未发酵的茶渣(TDs)，并在110℃下保存24h。用蒸馏水将水解产物的体积调节至50mL后，将1mL稀释的样品移出并在60℃下蒸发，直至干燥。然后将残留物用2mL HCl(0.02mol/L)复溶，并用0.45μm膜过滤。
测试游离氨基酸，茶渣的提取过程为：将0.1g样品和1mL HCl(0.02mol/L)充分混合15分钟，然后将溶液在4℃下以12,000×g离心15分钟；最后，用0.22μm的膜过滤，取上清液进行测试。
氨基酸种类的检测步骤：使用茚三酮的柱后衍生测定氨基酸的量。用自动氨基酸检测仪(L-8900，HITACHI，东京，日本)测量氨基酸浓度。参考《GB/T 18246-2019饲料中氨基酸的测定》。
测得的结果如图2直图5所示。
其中，图2为茶渣发酵前后游离氨基酸含量的变化。其中，TAA：总氨基酸；TEAA：总必需氨基酸；TNEAA：总非必需氨基酸，具有相同字母的值没有显著差异(P<0.05)。
由图2可知，经康宁木霉发酵前后，茶渣中的游离氨基酸(FAA)含量差异很大。具体而言，总氨基酸(TAA)，总必需氨基酸(TEAA)和总非必需氨基酸(TNEAA)的含量，发酵前后呈现显著差异。经康宁木霉发酵后的TAA含量是2255.55mg/100g，显著高于对照(未进行发酵处理)的1180.26mg/100g；发酵后茶渣中的FAA迅速增加。
经康宁木霉发酵后的茶渣中，组氨酸、精氨酸和苏氨酸(3种氨基酸均为必需氨基酸，其对于动物生长发育十分重要)的含量高于对照组(P<0.05)，甘氨酸，脯氨酸，酪氨酸，丙氨酸和天冬氨酸的含量均低于对照组(P＜0.05)，但由于这5种氨基酸为非必需氨基酸，因此虽然其含量有所降低，但是对于动物而言不会产生影响，其含量的降低，不影响茶渣的营养价值。表明茶渣中的蛋白质和纤维素被真菌分解以产生各种氨基酸。
此外，从图2中可知，牛磺酸的含量通过发酵得到提高(P＜0.05)。牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质，具有维持机体渗透压平衡、维持正常视觉功能、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力等广泛的生物学功能。牛磺酸含量提高，提高了茶渣的营养价值，饲喂动物，改善机体健康。
由此可见，茶渣的营养价值通过康宁木霉的发酵得到改善。
图3为茶渣发酵前后风味氨基酸含量的变化。其中，AA：氨基酸
TUC：总鲜味成分＝天冬氨酸+谷氨酸；
TSC：总甜成分＝丙氨酸+甘氨酸+丝氨酸+苏氨酸；
TBC：总苦味成分＝精氨酸+组氨酸+异亮氨酸+亮氨酸+蛋氨酸+苯丙氨酸+缬氨酸；
TTC：总无味成分＝TAA-TUC-TSC-TBC。
具有相同字母的值没有显著差异(P<0.05)。
风味AA可使食物具有甜，苦和鲜味，并有助于形成丰富的食物口味层次。康宁木霉发酵后的茶渣中，鲜味(TUC)和苦味AA的含量高于对照组。此外，康宁木霉FTD中主要的AA风味是鲜味，其次是苦味。虽然其苦味AA的含量有所提高，但是由于茶渣发酵后的还原糖的含量具有显著性的提升，其可掩盖由于苦味AA含量的提升带来的苦味，且鲜味氨基酸能改善茶渣的适口性，因此总的而言，发酵后的茶渣，其适口性有所改善。
图4为茶渣发酵前后水解氨基酸含量的变化。TAA：总氨基酸；TEAA：总必需氨基酸；TNEAA：总非必需氨基酸；TAAA：总芳香族氨基酸；TBCAA：总支链氨基酸。具有相同字母的值没有显着差异(P<0.05)。
茶渣中不同种类水解AA的含量在发酵后有不同程度的增加。发酵后，不同的AA通常表现出相似的模式，均有所提高。在康宁木霉发酵后的茶渣，TAA，TEAA和TNEAA的含量明显增加，显著高于对照组。经康宁木霉发酵后的茶渣中，各种EAA(8种必需氨基酸：异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸)的含量最高(P<0.05)，显著高于对照；对于NEAA(非必需氨基酸)，康宁木霉发酵后的茶渣中，丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的含量高于对照组(P<0.05)。康宁木霉发酵后的茶渣中，AA含量较高可能是由于茶渣经发酵后的CP含量较高，而CP含量的增加主要归因于康宁木霉真菌菌丝体的生长。由此可见，康宁木霉发酵能提高粗蛋白和氨基酸的含量，改善茶渣的营养价值。
表7发酵产物的必需氨基酸组成。
Figure BDA0002824278970000131
EAA的质量是营养价值的核心指标。发酵产品中TEAA的比例为45.7％，略低于鸡蛋模式，但高于FAO模式(见表7，其中鸡蛋模式和FAO模式是最理想的氨基酸组成模式)。赖氨酸，苏氨酸，缬氨酸和亮氨酸的比例高于鸡蛋和FAO的比例。酪氨酸和苯丙氨酸的比例高于FAO模式，更接近鸡蛋模式。虽然含硫氨基酸和异亮氨酸的比例低于这两个模型中观察到的比例。但总的而言，大部分的氨基酸的含量均高于这两种理想模式，因此发酵后的茶渣的营养价值高，且容易被动物吸收和利用。但若补充一定量的含硫AA和异亮氨酸则效果更佳。
图5为经康宁木霉发酵后的茶渣中不同溶剂提取物的自由基清除作用。
以DPPH、ABTS和OH自由基为检测指标，测试茶渣发酵前后，其清除自由基的作用变化。将所有样品的自由基清除能力与维生素C进行了比较，康宁木霉发酵后的茶渣，乙醇提取物的DPPH清除率显著高于对照(P<0.05)，但与维生素C相似(P>0.05)。康宁木霉发酵后的茶渣，甲醇提取物与维生素C对DPPH的自由基清除率高于对照组(P<0.05)，而康宁木霉组和维生素C差异不显著(P>0.05)。康宁木霉组甲醇提取物中·OH的清除率低于维生素C，但显著高于对照组(P<0.05)。由结果可知，发酵后的茶渣，其对自由基的清除作用，有一定程度的提升，发酵茶渣提取物的抗氧化活性有一定的改善作用，其作为饲料进行添加时，有益与动物健康。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，以灭菌后的茶渣和玉米粉混合物为发酵基质，其质量比为6:4~7:3，加水混匀，控制料液比为4:6~5:5，然后接种康宁木霉孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中孢子的浓度为1×106 ~1×108个/mL，接种量为4~10%，物料混匀后透气封口，在25℃~34℃条件下发酵6~10d，发酵结束后烘干即可。
2.根据权利要求1所述提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，所述发酵基质中，茶渣和玉米粉的质量比为7:3。
3.根据权利要求1所述提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，所述发酵基质和水的料液比为5:5。
4.根据权利要求1所述提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，所述康宁木霉的接种量为8%。
5.根据权利要求1所述提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，发酵的温度为31℃。
6.根据权利要求1所述提高茶渣营养价值的固态发酵方法，其特征在于，所述发酵的时间为6d。
7.一种经康宁木霉固体发酵后的茶渣，其特征在于，经由权利要求1至6任一所述方法发酵后得到的高营养价值的茶渣。
8.权利要求7所述经康宁木霉固体发酵后的茶渣作为动物饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述经康宁木霉固体发酵后的茶渣在动物饲料中的添加质量比例为1%~60%。
10.康宁木霉在提高茶渣营养价值中的应用。
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