CN113293106A

CN113293106A - 一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用

Info

Publication number: CN113293106A
Application number: CN202110785215.9A
Authority: CN
Inventors: 张梁; 方亚坤; 望子龙; 辛瑜; 顾正华; 李由然; 徐沙; 丁重阳; 石贵阳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2041-07-12
Also published as: CN113293106B

Abstract

本发明公开了一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.22187。本发明菌株能够耐受高浓度的香紫苏醇且能以其为原料产生香紫苏内酯及其类似物。

Description

一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用。

背景技术

香紫苏醇(sclareol)是一种来源于植物的双环二萜醇，广泛存在于自然界内。是一种不溶于水，易溶于有机溶剂的白色粉末状物质。该物质具有类似龙涎香气，香气细腻、扩散强烈且气味持久，能给予香精生动和谐持久的香气。因其具有特殊的香味，而被广泛的用于香精香料以及香水行业，也可用于烟草工业中的调味剂，同时也可作为肥皂、洗涤剂、面霜、乳液、食品中的香味成分。此外，有研究表明香紫苏醇对人类多种癌细胞如结肠癌细胞、白血病细胞，具有一定的细胞毒性，因此可作为潜在的抗肿瘤药物。目前，香紫苏醇主要的用途是合成香紫苏内酯，及进一步合成龙涎香的替代品降龙涎香醚。

香紫苏内酯(sclareolide)是一种类倍半萜类物质，和香紫苏醇一样是一种不溶于水，易溶于有机溶剂的白色结晶状粉末。同样具有特殊的香味而被用于香精香料等行业，是一种优良的烟草增香矫味剂。因其能够增大和提高食品的感官，而广泛用于食品工业。此外在没有心血管刺激作用情况下，当减少身体脂肪时，香紫苏内酯能够帮助增进变瘦身体的质量，因此已经广泛用于减肥产品。降龙涎香醚无色至白色结晶，具有龙涎香味，普遍应用于高级香水及化妆品的香精中，以及化妆品等领域。目前降龙涎香醚等香紫苏内酯的类似物主要通过化工合成来获得。

香紫苏内酯的生产是以香紫苏醇为底物经过一系列的氧化还原反应而获得。传统的合成方法是铬酸酐氧化法，即用铬酸酐氧化香紫苏醇来合成，工艺操作容易，收率较低，然而在生产过程中产生的含铬废水对环境污染较大，现在基本不再采用。而目前开发的比如瑞士芬美意公司的臭氧化法；西班牙专利中提出用高碘酸钠和四氧化锇在四氢呋喃中氧化香紫苏醇的方法；美国 Reynolds公司的高锰酸钾两部氧化法及中国上海香料所开发出了高锰酸钾低温氧化工艺等均是用化学试剂对香紫苏醇进行氧化而获得香紫苏内酯。但是化学试剂的残留以及立体选择性较差等原因极大的限制了香紫苏内酯的应用。因此，研究者们逐渐的开始关注香紫苏内酯的生物合成。然而，目前有关生物合成方面的报道很少，因此生物合成香紫苏内酯的菌株的开发仍需进一步加强。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用。本发明菌株能够耐受高浓度的香紫苏醇且能以其为原料产生香紫苏内酯及其类似物。

本发明的技术方案如下：

一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.22187。

所述真菌的生化鉴定结果见表2-4。

所述真菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；所述真菌的18S序列如SEQ ID NO.2所示。

一种所述子囊菌纲Filobasidium属的真菌的应用，用于催化香紫苏醇。

采用所述真菌将香紫苏醇催化为香紫苏内酯或香紫苏内酯类似物。

所述香紫苏内酯类似物为降龙涎香醚(Ambrox)，香紫苏醚(Sclareol oxide)龙涎酮物质。

催化方法为：将菌株按照5％-10％的量接入含有5-30g/L香紫苏醇及所需营养物质的发酵培养基中，置于恒温摇床中25-30℃培养60-84h，GC-MS检测。

所述发酵培养基组成为：10-30g/L香紫苏醇，4-9g/L蛋白胨，2-8g/L酵母粉，0.5-2g/L NH₄Cl，0.5-2g/L NaNO₃，0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O，0.5-2g/L KH₂PO₄， 1-4g/L葡萄糖，pluronicF-127 1-3g/L，发酵培养基起始pH为4-9，培养温度 25-30℃。

一种所述子囊菌纲Filobasidium属的真菌的筛选方法，所述方法是将采集的土壤置于无菌水中，放置于恒温摇床中振荡1-2h，然后吸取50-200μL菌液均匀涂布于以香紫苏醇为唯一碳源的培养基上，于25-30℃培养箱中培养2-4d，挑取形态差别较大的菌株，接种于发酵培养基，于25℃培养后，加入等体积的乙醇处理，之后离心取上清，利用乙酸乙酯萃取稀释后，气相色谱质谱联用仪GC-MS对发酵液进行定性和定量检测，确定可以转化香紫苏醇生产香紫苏内酯及其类似物的菌株。

培养基的组成成分为：50-80g/L香紫苏醇，4-9g/L蛋白胨，2-8g/L酵母粉， 0.5-2g/L NH₄Cl，0.5-2g/L NaNO₃，0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O，0.5-2g/L KH₂PO₄， pluronicF-1271-3g/L，15-20g/L琼脂粉，培养基起始pH为4-9，培养温度 25-30℃。

本发明分离菌株具有真菌学的特性，通过全基因组序列(PRJAN732470)测定得到其ITS和18S序列。

本发明从土壤中取样，制得菌液涂布于香紫苏醇60g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，琼脂粉20g/L，pH＝5的筛选培养基上，培养3-4d。挑取长出的菌株接种于香紫苏醇 20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L， KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pluronicF-127 2g/L，pH＝5的液体培养基中， 25℃培养2-3d，取发酵液离心，稀释100倍，利用GC-MS定性定量检测，色谱条件为：载气为：高纯He；Rtx-5ms(0.2um x 0.25mm x 30m)色谱柱；进样口温度280℃；梯度升温程序：180℃，2min；5℃/min升至280℃维持1min；接口温度250℃，离子源温度200℃。经过多轮的大量菌株初筛和复筛选工作，从中分离出1株可耐受高浓度香紫苏醇来生产香紫苏内酯及其类似物的菌株，将其命名为JD1025。香紫苏醇对菌株的生长影响如表1所示。

表1

香紫苏醇浓度(g/L)	菌株的OD<sub>600nm</sub>
		0	20.18
10	20.21
		20	20.16
30	20.12
		40	20.08
50	20.09
		60	20.1
70	19.99
		80	19.98

由表1可以看出，在添加香紫苏醇的发酵过程中，底物香紫苏醇的添加对菌株的生长影响较小，因此该菌株可以耐受高浓的香紫苏醇。

碳源同化实验结果如表2所示；

表2

检测项目	结果	检测项目	结果
				D-葡萄糖	+	赤藓糖醇	+
果糖	+	海藻糖	+
				甘露糖	-	核糖醇	-
D-核糖	-	D-甘露醇	+
				D-半乳糖	+	柠檬酸盐	-
蔗糖	+	甲醇	-
				麦芽糖	+	乙醇	+
L-山梨糖	+	Ca2-酮-葡糖酸	-
				D-阿拉伯糖	+	琥珀酸盐	+
L-阿拉伯糖	+	乳酸盐	+
				D-木糖	+	乳糖	+
L-鼠李唐	+	蜜二糖	+
				D-纤维二糖	+	棉子糖	+
水杨苷	-	松三糖	+
				菊糖	-	a-甲基-D-葡萄糖苷	+
淀粉	W	香紫苏醇	+
				甘油	+

糖发酵实验结果如表3所示。

表3

检测项目	结果	检测项目	结果
				葡萄糖	+	蔗糖	+

氮同化实验结果如表4所示。

表4

检测项目	结果	检测项目	结果
				硝酸盐	+	无机铵盐	+
亚硝酸盐	+

本发明有益的技术效果在于：

本发明利用香紫苏醇为原料来发酵生产高附加值产品香紫苏内酯及其类似物，该方法可持续生产，且对环境友好。

附图说明

图1为Filobasidium magnum(1-a，b，c)和Saccharomyces cerevisiae(1-d)的电镜图片。

图2为香紫苏醚的气相色谱图。

图3为香紫苏醚的质谱图。

图4为降龙涎香醚的气相色谱图。

图5为降龙涎香醚的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

发酵过程中所需的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖等单糖或者多糖，也可以直接使用底物香紫苏醇作为碳源。根据培养基的需要，这些碳源可以单独使用，也可以混合使用；发酵过程中所需的氮源包括硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵等无机铵盐，也可以是氨基酸，尿素，蛋白胨，酵母粉，玉米浆等含氮有机物质，根据培养基的需要，这些氮源可以单独使用，也可以混合使用；发酵过程中所需的无机盐包括硫酸镁，氯化镁，硫酸锌，硫酸亚铁，硝酸铁，硝酸镁等，根据培养基的需要，这些金属离子可以单独使用，也可以混合使用。

本菌体培养的过程中条件具有较宽的适用范围，不受特别条件的限制，但是培养可以在最适的条件下进行。具体的最理性的pH水平是3-10，优选4-9，最优选5-7。最理想的温度为15-32℃，优选20-30℃，更优选温度为22-27℃，培养可以在普通摇瓶、挡板摇瓶中震荡培养，也可以在发酵罐中进行。此外静息细胞和固定化细胞也可以用来反映。

发酵过程中，底物香紫苏醇浓度的添加不受特别的限制，优选浓度在 0.05％-20％，可以在发酵前一次性加入，也可以发酵过程中恒流速或者恒浓度的补加进行。同时可以添加一些助溶剂，比如pluronic，表面活性剂，消泡剂等。

实施例1菌株的筛选：

1、初筛：从无锡市区内不同地点取样，取样种类包括市区内各个地方土壤等共取样15份。将取得的样品进行研碎处理，将上述样品加入无菌水中，置于恒温摇床中进行振荡1-2h，然后取上清菌液进行梯度稀释，取稀释10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍三个梯度的菌液涂布于筛选培养基(香紫苏醇60g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L， pluronicF-127 6g/L，琼脂粉20g/L)中，于25℃恒温培养箱中培养2-4d。挑取长出菌落形态相差较大的单菌落进行再次复筛。

2复筛：将上述初筛所得到的菌株分批次接种于发酵培养基(香紫苏醇20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pluronicF-127 2g/L，pH＝5)中，在25℃恒温摇床中 200rpm培养3d。之后取发酵液5mL于12000r/min下离心10min，取上清液 1mL先用稀释10mL乙酸乙酯萃取之后再取上清用乙酸乙酯稀释10倍，利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行定性检测。其中几乎全部分菌株的是无法转化香紫苏醇生产香紫苏内酯。仅有其中1株菌株可以利用香紫苏醇生产香紫苏内酯，且通过代谢物分析发现该菌株也来可以将香紫苏醇转化成其他的具有香气的物质(结构类似于香紫苏内酯)。

将上述复筛所得到的菌株进行甘油管保存，然后置于-80℃冰箱中保存。

实施例2菌株的鉴定及形态观察：

本发明对菌株的全基因组进行了测序，并上传至NCBI，其ID：PRJAN732470，通过如表1-3所示的真菌学特性以及全基因组序列比对发现该菌株是属于 Filobasidium属的酵母。真菌学特性方面的分类根据以下文献进行Barnett,J.A. etc.2000,Yeasts:Characteristics and Identification,3rd edition.Kurtzman,C.P.etc. 1998,Theyeasts,a taxonomic study 4th edition.

该菌株在YPD平板上培养3d发现菌株较小、湿润、圆形、隆起、不透明、颜色呈淡白色。同时利用电子显微镜对该菌株的形态进行了观察，发现该菌株是呈椭圆形状态(图1-a)，细胞表面不光滑(图1-b)，出芽生殖进行分裂(图1-c)，但又不同于典型的酵母模式菌株(如酿酒酵母图1-d)，该菌株在分裂过程中单个菌体只出一个芽，生化特性实验结果如表1-3所示，其中符号“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果，“w”代表阳性结果。

实施例3：

利用所述菌株JD1025发酵香紫苏醇生产香紫苏内酯及其类似物的方法，具体步骤为：按5％的接种量将菌株JD1025接种到一级种子培养基中，25℃恒温摇床培养36h，将培养好的一级种子按5％的接种量接入二级种子培养基中，25℃恒温摇床培养24h，然后将培养好的二级种子按5％的接种量接入含有不同浓度的香紫苏醇的发酵培养基中，于25℃恒温培养箱中200rpm下培养2-3d。取发酵液离心经乙酸乙酯萃取稀释后利用GC-MS进行检测。不同香紫苏醇浓度下菌株JD1025的香紫苏内酯的产量的测得结果如表5所示。

一级种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，pH＝5。

二级种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，pH＝5。

发酵培养基：香紫苏醇10-80g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L， KH₂PO₄2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pluronicF-127 1-8 g/L，pH＝5。

种子培养基和发酵培养基灭菌温度和时间分别为：115℃，20min。

表5不同香紫苏醇浓度下菌株JD1025的香紫苏内酯的产量

实施例4：

利用所述菌株JD1025催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：将培养好的菌株JD1025的二级种子按5％的接种量直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖4g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pluronicF-127 3g/L， pH＝5。)，25℃发酵培养72h；测得发酵液中香紫苏内酯的含量为20.76g/L，其摩尔转化率和底物转化率分别为85.26％和89.6％。

实施例5：

利用所述菌株JD1025催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：将培养好的菌株JD1025的二级种子按5％的接种量直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pluronicF-127 3g/L， pH＝5。)，30℃发酵培养72h；测得发酵液中香紫苏内酯的含量为13.58g/L，其摩尔转化率和底物转化率分别为55.77％和58.07％。

实施例6：

利用所述菌株JD1025催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：将培养好的菌株JD1025的二级种子按5％的接种量直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，pH＝5。)，25℃发酵培养 72h；测得发酵液中香紫苏内酯的含量为10.07g/L，其摩尔转化率和底物转化率分别为41.36％和43.87％。

实施例7：

用所述菌株JD1025催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：将培养好的菌株JD1025的二级种子按5％的接种量直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，大豆油30mL/150mL 培养基，pH＝5。)，25℃发酵培养72h；测得发酵液中除了有产物香紫苏内酯，还含有香紫苏醚(Sclareol oxide)，结果如下图2和图3所示。

图2是菌株发酵后的菌体经处理萃取后的气相色谱质谱图，其中横坐标是物质的出峰时间，总长度即程序的运行时间，横坐标为物质的响应值。其中红色标定的的第一个峰是香紫苏醚的峰，其出峰时间为6.67min，对其进行普库对比得出香紫苏醚的离子碎片峰(图3)和其标准品比对率达到97％。图3中横坐标是m/z，纵坐标是离子碎片的丰度。由图2和图3可知该物质是香紫苏醚。另外红色标定的第二和三个峰分别是香紫苏内酯和香紫苏醇的峰。

实施例8

用所述菌株JD1025催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：将培养好的菌株JD1025的二级种子按5％的接种量直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 2g/L，NaNO₃ 2g/L，MgSO4·7H₂O 1g/L，吐温80 10g/L，pH＝5。)，25℃发酵培养48h；收集菌体，利用无水乙醇清洗菌体一次，然后在液氮中研磨，之后用乙酸乙酯抽提，GC-MS检测存在痕量的降龙涎香醚，结果如图4和图5所示。

图4是菌体发酵后的菌体经液氮研磨处理后的气相色谱质谱图，其中横坐标是物质的出峰时间，总长度即程序的运行时间，横坐标为物质的响应值。其中箭头指示的红色标定的第一个峰，其出峰时间为5.24min，对其进行普库对比得出降龙涎香醚的离子碎片峰(图5)和其标准品比对率达到98％。图5中横坐标是m/z，纵坐标是离子碎片的丰度。由图4和图5可知该物质是降龙涎香醚。另外紧随其后红色标定的第二、三和四峰分别是香紫苏醚、香紫苏内酯和香紫苏醇的峰。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> ITS 序列

<400> 1

ttgaaccata ggcgaaagcc agtggttctt ctttcatatc cataacacct gtgcactgtt 60

ggatgcttgc atccactttt aaactaaaca ttattgtaac aaatgtagtc ttattataac 120

ataataaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 180

tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg 240

cgctccttgg tattccgagg agcatgcctg tttgagtgtc atgaaaccct caaacccaag 300

ttttggattt cgatccatgc ttgagtttgg atttggatgt ttgccggtga tgaaccgact 360

catcttaaaa gtattagctt ggatctgtct atatgactgg tttgacttgg cataataagt 420

attttgctga ggacatcttc ggatggccag gacctagact actgtctgct aactaaacca 480

tcactttaag tgcatctttg gatgttactc 510

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> 18S序列

<400> 2

ttgatggtaa cttgctacat ggataactgt ggtaattcta gagctaatac atgctgaaaa 60

gccccgactt ctggaagggg tgtatttatt agataaaaaa ccaatgggtg caagcccttc 120

ttggtgattc atgataactt ctcgaatcgc atggccttgt gccggcgatg cttcattcaa 180

atatctgccc tatcaacttt cgatggtagg atagaggcct accatggtgg caacgggtaa 240

cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga 300

aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc gacacgggga ggtagtgaca ataaataaca 360

atacagggcc ctttgggtct tgtaattgga atgagtacaa tttaaatccc ttaacgagga 420

acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata 480

ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaacttca ggcttggcgg ggtggtctgc 540

ctaacggtat gtactatccg gctgagcctt acctcctggt gagcctgcat gtcgtttatt 600

cggtgtgtag gggaaccagg aattttactt tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcat 660

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tctaggatcg ccgtaatgat taatagggac ggttgggggc attagtattc agttgctaga 780

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cagtaaacta tgccgactag ggatcgggcc acgttcatct tttgactggc tcggcacctt 960

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gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1080

gaaactcacc aggtccagac atagtaagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1140

atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt taattccgat 1200

aacgaacgag accttaacct gctaaatagt ccggccggct tttgctggtc gctgacttct 1260

tagagggact aacagcgttt agctgttgga agtttgaggc aataacaggt ctgtgatgcc 1320

cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac actgactgag ccagcgagtt tataaccttg 1380

gccgaaaggt ctgggtaatc ttgtgaaact cagtcgtgct ggggatagag cattgcaatt 1440

attgctcttc aacgaggaat gcctagtaag cgtgagtcat cagctcacgt tgattacgtc 1500

cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg aatggcttag tgagatctcc 1560

Claims

1.一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌，其特征在于，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.22187。

2.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌的生化鉴定结果见表2-4。

3.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；所述真菌的18S序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种权利要求1所述子囊菌纲Filobasidium属的真菌的应用，其特征在于，用于催化香紫苏醇。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用所述真菌将香紫苏醇催化为香紫苏内酯或香紫苏内酯类似物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述香紫苏内酯类似物为降龙涎香醚(Ambrox)，香紫苏醚(Sclareol oxide)龙涎酮物质。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，催化方法为：将菌株按照5％-10％的量接入含有5-30g/L香紫苏醇及所需营养物质的发酵培养基中，置于恒温摇床中25-30℃培养60-84h，GC-MS检测。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：10-30g/L香紫苏醇，4-9g/L蛋白胨，2-8g/L酵母粉，0.5-2g/L NH₄Cl，0.5-2g/L NaNO₃，0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O，0.5-2g/L KH₂PO₄，1-4g/L葡萄糖，pluronicF-127 1-3g/L，发酵培养基起始pH为4-9，培养温度25-30℃。

9.一种权利要求1所述子囊菌纲Filobasidium属的真菌的筛选方法，其特征在于，所述方法是将采集的土壤置于无菌水中，放置于恒温摇床中振荡1-2h，然后吸取50-200μL菌液均匀涂布于以香紫苏醇为唯一碳源的培养基上，于25-30℃培养箱中培养2-4d，挑取形态差别较大的菌株，接种于发酵培养基，于25℃培养后，加入等体积的乙醇处理，之后离心取上清，利用乙酸乙酯萃取稀释后，气相色谱质谱联用仪GC-MS对发酵液进行定性和定量检测，确定可以转化香紫苏醇生产香紫苏内酯及其类似物的菌株。

10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，培养基的组成成分为：50-80g/L香紫苏醇，4-9g/L蛋白胨，2-8g/L酵母粉，0.5-2g/L NH₄Cl，0.5-2g/L NaNO₃，0.1-1g/L MgSO₄·7H₂O，0.5-2g/L KH₂PO₄，pluronicF-127 1-3g/L，15-20g/L琼脂粉，培养基起始pH为4-9，培养温度25-30℃。