CN113980821B - 一株转化橙皮苷的黑曲霉及其应用 - Google Patents

一株转化橙皮苷的黑曲霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株黑曲霉(Aspergillus niger)，其保藏号为：GDMCC No:61088，并将其命名为：Aspergillus niger CP‑2。本发明的黑曲霉分离自陈皮，该黑曲霉具有将橙皮苷转化成橙皮素的作用，其橙皮素的产率能达到60％以上。

Description

一株转化橙皮苷的黑曲霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株转化橙皮苷的黑曲霉及其应用。
背景技术
橙皮苷是一种二氢黄酮苷，是柑桔中含量最为丰富的黄酮类物质之一，由苷元(橙皮素)和芸香糖组成，研究证实橙皮苷具抗炎、抗氧化、干扰肿瘤形成等多种生物活性，但是橙皮苷在柑桔果实中是以活性较低的糖苷形式存在，提取得到的橙皮苷其糖苷键并没有断开，这种糖苷键的存在特别是鼠李糖糖苷键的存在，阻碍了其被生物体消化吸收，降低了其生物利用率。橙皮苷的溶解性很差，它的水溶性和脂溶性都相当低，使得它不易被生物酶类利用，也不易透过生物细胞膜，因而也限制了它在食品等领域中的应用。药代动力学研究表明苷类成分肠道内难以吸收、肠内滞留时间较长而易受到肠道菌群的水解作用。苷经肠道细菌代谢后被水解，生成苷元而发挥其药理作用。因此，通过将苷类化合物转化成其相应苷元来提高苷类化合物生物利用度的研究是近年研究热点。
在上世纪70年代从柑桔中提取橙皮苷就已经工业化生产了，这些橙皮苷大部分应用于医药和化妆品领域中，在食品和保健品领域几乎没有应用。因为橙皮苷中糖基的存在，经人体口服后需要经人体大肠中微生物分解后才能被吸收，未被分解的部分则随大便排出体外，而对于肠胃功能不好的人则橙皮苷的药效也会降低。至于人体皮肤吸收，也由于糖基的存在，降低了橙皮苷的亲脂性，不易通过皮肤细胞，因此也会降低它对皮肤作用的效果。而去除糖基或部分糖基后，橙皮苷的衍生物在水溶性、脂溶性和生物利用率上面都会改善。
目前生产橙皮素主要是采用酸水解法和酶水解的。酶法水解温度较低，水解反应较好控制，但是经发酵产酶的产率并不高，价格昂贵，而且水解率较低，若酶系中含有多种酶，得到的反应产物仍然复杂，使得分离纯化困难。酸水解能耗高，损失大，对环境污染严重。因此筛选一株高效转化生产橙皮素的微生物具有非常重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明从陈皮中分离出一株黑曲霉，将其命名为：Aspergillus niger CP-2。该菌株黑曲霉能转化橙皮苷，本申请人已将该菌株于2020年7月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC No:61088，分类学名称为：Aspergillus niger。本发明还针对该菌株的转化橙皮苷的生产条件进行了优化，最大限度的提高本发明菌株的橙皮素的产率。
本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：
本发明的第一个目的在于提供一株黑曲霉(Aspergillus niger)将其命名为：Aspergillus niger CP-2，保藏号为GDMCC No:61088。该菌株黑曲霉能转化橙皮苷，其产率能达到60％以上。
进一步地，所述黑曲霉的基因组含有如SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明的第二个目的在于提供所述黑曲霉在生产橙皮素中的应用。
进一步地，将所述的黑曲霉制备成如下所述的任一种制剂置于至含有橙皮苷的PDA培养基中发酵：
(a)所述Aspergillus niger CP-2冻干菌粉；
(b)所述Aspergillus niger CP-2的菌悬液；
(c)所述Aspergillus niger CP-2的发酵液。
可将本发明的Aspergillus niger CP-2制备成冻干菌粉、菌悬液或发酵液，将其投入含有橙皮苷的溶液中，可将橙皮苷转化成橙皮素。
本发明的第三个目的在于提供使用本发明黑曲霉制备橙皮素的方法，包括以下步骤：将本发明所述的黑曲霉的种子液接种至含有橙皮苷的PDA培养基中发酵，所述发酵条件为：温度25～40℃，转速0～200rpm，pH值6～8，橙皮苷的浓度为0.25～4mmol/L，接种的黑曲霉菌丝球数量为10～50个。发明人对本发明黑曲霉制备橙皮素的方法进行了研究，发现在上述条件范围内本发明黑曲霉均可生产橙皮素。
优选地，所述发酵条件为：温度35℃，转速200rpm，pH值7.5，橙皮苷的浓度为1mmol/L，接种的黑曲霉菌丝球数量为30个。经试验验证，当所述黑曲霉采用上述发酵条件时，其橙皮素的产率最高。
本发明的第四个目的在于提供一种分离本发明黑曲霉所用的培养基，包括以下浓度质量的组分：MgSO4.7H2O 0.5％；陈皮粉1.0％；K2HPO4 0.5％；KCl0.5％；FeSO4.5H2O0.01％，琼脂2.0％。使用本发明的培养基能将所述黑曲霉从陈皮中有效的筛选分离。
本发明的有益效果为：本发明的一种黑曲霉分离自陈皮，该黑曲霉具有将橙皮苷转化成橙皮素的作用，其橙皮素的产率能达到60％以上。
附图说明
图1为本发明菌株的电镜图
图2为本发明菌株的系统树示意图
图3为菌丝球数量对本发明菌株橙皮素产率的影响的示意图
图4为pH值对本发明菌株橙皮素产率的影响的示意图
图5为底物浓度对本发明菌株橙皮素产率的影响的示意图
图6为最佳反应条件下本发明菌株橙皮素的产率的示意图
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1本发明黑曲霉的获取
1.菌种的分离纯化
(1)培养基配制
陈皮粉分离培养基：MgSO4·7H2O，0.5％；陈皮粉，1.0％；K2HPO4，0.5％；KCl，0.5％；FeSO4·5H2O，0.01％；琼脂，2.0％；pH值自然；配置100ml。后于121℃灭菌15min，待培养基冷却至约60℃，在超净工作台上倒平板，得到陈皮粉培养基。
(2)陈皮样品处理
随机取样陈皮，称取陈皮30g置于已灭菌的自封袋中，后于超净工作台中撕碎，混合均匀后从30g中称取1g陈皮样品备用，达到均匀取样，使所取样品具有代表性。
(3)陈皮菌悬液制备
真菌菌悬液：将1g陈皮样品于40mL的马铃薯葡萄糖培养液中，于30℃下恒温摇床培养3d，得到陈皮菌悬液，并进行梯度稀释，每个年份批次平行三组。
(4)陈皮中真菌的分离纯化
真菌的分离纯化：在超净工作台中，吸取每组菌悬液各100μL，于陈皮粉培养基上分别进行均匀涂布并标记，后于30℃培养箱中恒温培养3d后，从平板中挑取形态不同的菌落于新的相对应的培养基上进行平板划线，继续30℃下培养3d后观察所生长的菌落大小、形态特征，重复以上操作，直至平板上的菌落大小、形态特征一致，用石炭酸复红染液染色后镜检，确定其纯化，得到纯培养物。纯化后的菌株用接种针从培养好的平板上取菌块4-7环(带少量培养基)，接入菌株保藏管中，拧紧盖子，充分剧烈震荡，用无菌吸管将溶液吸走后马上放入冰箱中，置于-80℃冰箱中保存，温度越低越有利于保存，备用。
2.菌种的鉴定
(5)菌株DNA提取
使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
(6)PCR扩增及电泳检测
PCR扩增：真菌利用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)对IS-PCR进行扩增，PCR反应体系及反应条件如表1和表2所示。
电泳检测：用西班牙琼脂糖配置1.5％的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用1X TAE，电压按5V/CM进行琼脂糖凝胶电泳，电泳上样量为5μl。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
(7)陈皮真菌分子鉴定
PCR扩增后于4℃保存，产物交由上海生物技术有限公司测序，基于18SrDNA基因测序。将所得碱基序列在NCBI官网上进行BLAST，分析代表性菌株序列和相似性较高的模式菌株序列，从而鉴定菌株种类，在Bing和Google官网翻译得到中文名称为黑曲霉，在本发明中的命名为：Aspergillus niger CP-2。
实验结果：
1、形态特征：将本发明经初筛、复筛出1株高效产橙皮素菌株的形态如图1所示；
2、菌株鉴定：利用引物ITS1和ITS4对菌株CP-2进行IS-PCR扩增，产物交由上海生物技术有限公司进行测序，结果其18S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO:1)：
AAATTTGACGGCGAATGTCGTGCTGTAACGTGTTTGACAGCGCGGTTGATATTTCGAGCAACGCCTAACCGGGGGTTAGAGGGGATGCGACGCTCAAACAGGCATGCCTCGAGGAATGCCTCGAGGCGCAATGGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAGTCATACTACGTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTGAAAGTTTTGAT
通过MEGA5.1软件绘制系统树，结果见图2。由此可知，本发明中的菌株CP-2为与黑曲霉(Aspergillus niger)的亲缘关系最近，同源性为99％，进而判定该菌株为黑曲霉。
将上述获得的黑曲霉保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，获得保藏号为GDMCC No:618088，其分类名为：Aspergillus niger。
实施例2优化菌株Aspergillus niger CP-2的转化条件
1、菌种的活化与扩大培养
无菌条件下，用接种环从保藏的斜面培养基中取一满环实施例1的黑曲霉菌接种至装有30mL的PDA液体培养液的100mL三角瓶，在30℃、150rpm条件下，培养24h，制得种子液。用移液枪移取1mL种子液至装有30mL的PDA培养液的100mL三角瓶，在30℃、150rpm条件下，培养24h，制得菌液。
2、单因素水平优化实验
分别从菌丝接种量(菌丝球数量10个、20个、30个、40个、50个)、pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、底物浓度(0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L)三个方面进行单因素实验，以产物橙皮素的得率为指标筛选三个因素最佳值。
3、正交实验设计
以单因素实验结果为依据，选用菌丝球数量、pH、底物浓度这三个因素为主要探究因素，每个因素选取3个水平，设计正交实验。通过测定橙皮素的产率来确定最适的转化制备条件。正交实验设计表如表3所示。
表3黑曲霉制备橙皮素的优化工艺正交实验设计
4、不同发酵液中橙皮素含量的测定
(1)橙皮素标准曲线的绘制
准确称取橙皮素标准品(HPLC级)10mg，在100mL容量瓶中用40％甲醇溶解后，继续加入40％甲醇直至液面最低处刻度线，摇匀后得到质量浓度为100μg/mL的橙皮素标准溶液。
精确移取橙皮素标准溶液、40％甲醇按0：5、1：4、2：3、3：2、4：1、5：0加入于10mL容量瓶中；充分摇匀后得橙皮素系列标准溶液，浓度分别为0、20、40μg/mL、60、80、100μg/mL，各移取1mL橙皮素系列标准溶液于1.5mL液相样品瓶中，进行高效液相色谱(HPLC)分析。使用WPS 2019软件进行统计处理并绘图，得到橙皮素峰面积与橙皮素浓度标准曲线如图3，得到公式y＝5842.5x；R2＝0.9999。式中：y——峰面积；x——橙皮素浓度(μg/mL)；R——相关系数。
(2)样品处理
分别将10mL甲醇、乙醇、乙腈与90mL蒸馏水混合，制得10％甲醇，10％乙醇和10％乙腈。
准确称取橙皮苷89.0μg加入100mL容量瓶中，分别加入蒸馏水、10％甲醇，10％乙醇和10％乙腈；配制80μg/mL橙皮苷溶液，10％甲醇-80μg/mL橙皮苷溶液，10％乙醇-80μg/mL橙皮苷溶液，10％乙腈-80μg/mL橙皮苷溶液。
分别移取80μg/mL橙皮苷溶液、10％甲醇-80μg/mL橙皮苷溶液、10％乙醇-80μg/mL橙皮苷溶液、10％乙腈-80μg/mL橙皮苷溶液9mL和1mL菌液于20mL样品瓶内，每组三个平行样。
将上述样品瓶于30℃，200rpm恒温摇床内发酵24h后用1mL一次性注射器吸取1mL发酵液通过孔径0.22μm、直径13mm的PES滤膜注入1.5mL液相瓶待进行HPLC分析。
(2)HPLC分析
使用XBridge Shield RP18色谱柱(4.3x250mm，5μm)，柱温40℃，流动相A为超纯水、流动相D为甲醇，流速为1mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱条件见表4：
表4：HPLC液相色谱梯度洗脱条件
记录波长为284nm、出峰时间为11.9±0.1处峰面积，并代入橙皮素标准曲线后得出发酵液中橙皮素含量c产物(μg/mL)用Grigin 2018软件进行绘图。
产率的计算方法如下：
黑曲霉菌株转化橙皮苷制备橙皮素的产率按式(1)计算。
式中：c0、c产物分别为反应起始底物的浓度和反应结束时产物的浓度
实验结果：
1、接种菌丝球数量对黑曲霉转化橙皮素的影响
菌丝球数量对黑曲霉转化橙皮素的影响结果见图3所示。菌丝球数量对黑曲霉将橙皮苷转化为橙皮素的产率有重要影响。有研究表明，黑曲霉菌丝球中具有橙皮苷酶，橙皮苷酶能够将橙皮苷水解为橙皮素。当反应体系中的菌丝球数量为10～30个时，橙皮素的产率随着菌丝球数量的增加而上升。而当菌丝球数量继续增加时，橙皮素的产率反而下降。橙皮素的产率在菌丝球数量为30个时达到最大值，为64.34％。
2、不同pH对黑曲霉转化橙皮素的影响
pH对黑曲霉转化橙皮素的影响结果见图4所示。当反应体系中的pH为6-7.5时，橙皮素的产率随着pH的上升而增加。其中，在pH为6.0-6.5时，橙皮素产率缓慢上升，橙皮素产率为18.67％；在pH为6.5-7.5的条件下，橙皮素产率快速升高，橙皮素产率可达到51.71％。而当pH继续增加时，橙皮素的产率开始下降。这是因为不同的pH值与黑曲霉中相关酶的活性有着重要关联，同时也会对底物橙皮苷的溶解度造成影响。橙皮素的产率在pH为7.5时达到最大值，为51.71％。
3、不同底物浓度对黑曲霉转化橙皮素的影响
底物浓度对黑曲霉转化橙皮素的影响结果见图5所示。底物浓度对橙皮素的产率有明显的影响。伴随反应体系中底物浓度的升高，橙皮素的产率呈现先增加后下降的态势。在底物浓度等于1mmol/L时，橙皮素的产率为最高值。而当底物浓度继续升高时，橙皮素的产率反而下降。推测其原因可能是，发酵反应体系的转化能力是有限的，随着底物浓度的上升，反应体系的转化能力趋向于饱和状态，从而对橙皮素的产率造成影响。橙皮素的产率在底物浓度为1mmol/L时达到最大值，为61.71％。
4、正交实验结果分析
表5黑曲霉转化制备橙皮素优化工艺正交实验结果
表6黑曲霉转化制备橙皮素优化工艺方差分析
黑曲霉转化制备橙皮素优化工艺的正交实验结果见表5所示。对正交实验结果进行方差分析，所得结果见表6所示。从表5可以知道，菌丝球数量的极差最大，是影响橙皮素产率的最关键因素。影响橙皮素产率的因素顺序依次为：A＞B＞C，即在菌丝球数量、pH、底物浓度这三个因素中，菌丝球数量对橙皮素产率的影响最大，然后是pH，底物浓度次之。其中，菌丝球数量对于橙皮素的产率有显著影响(P＜0.05)。黑曲霉转化制备橙皮素的最适制备条件为A3B2C2，即在菌丝球数量为30个，pH为7.5，底物浓度为1mmol/L的反应体系下，橙皮素的产率最高，为63.90％。
根据正交实验的优化结果，在最佳反应条件下进行验证实验，实验进行3个平行实验操作，结果如图6所示，黑曲霉在最佳发酵工艺条件下发酵12h后，与发酵前相比，多了11.9min处出峰，即说明发酵后部分橙皮苷被转换成橙皮素，发酵36h后得到橙皮素的产率为57.21％，转化制备效果较明显。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
<120> 一株转化橙皮苷的黑曲霉及其应用
<130> 8.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 240
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
aaatttgacg gcgaatgtcg tgctgtaacg tgtttgacag cgcggttgat atttcgagca 60
acgcctaacc gggggttaga ggggatgcga cgctcaaaca ggcatgcctc gaggaatgcc 120
tcgaggcgca atggcgttca aagattcgat gattcacgtc tgcaagtcat actacgtatc 180
gcaattcgct gcgttcttca tcgatgcgag aaccaagaga tccgttgtga aagttttgat 240

Claims (4)

1.一株黑曲霉（Aspergillus niger），其特征在于，其保藏号为：GDMCC No: 61088，所述菌株分离自陈皮，命名为：Aspergillus niger CP-2；所述黑曲霉的基因组含有如SEQ IDNO:1所示的序列。
2.如权利要求1所述的黑曲霉在生产橙皮素方法中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的黑曲霉制备成如下所述的任一种制剂置于含有橙皮苷的PDA培养基中发酵：
（a）所述Aspergillus niger CP-2冻干菌粉；
（b）所述Aspergillus niger CP-2的菌悬液；
（c）所述Aspergillus niger CP-2的发酵液。
4.一种使用如权利要求1所述黑曲霉制备橙皮素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述黑曲霉的种子液接种至含有橙皮苷的PDA培养基中发酵，所述发酵条件为：温度35℃，转速200 rpm，pH值7.5，橙皮苷的浓度为1 mmol/L，接种的黑曲霉菌丝球数量为30个。
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