CN101457211B - 一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents
一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2,3-丁二醇中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097及其在制备2，3-丁二醇中的应用。本发明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDMCCTCC NO：M 208097具有营养要求范围广、产物浓度高、生产周期短等特点，培养基和操作方法简单，成本低，发酵罐补料分批发酵2，3-丁二醇产量达到120～160g/L，转化率达到理论转化率的90～94％，2，3-丁二醇最大生产率为4.05g/(L·h)，极具工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株肺炎克雷伯氏菌及其应用，尤其涉及一株高产2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
2，3-丁二醇(2，3-butanediol)，又称2，3-双羟基丁烷，是一种无色无嗅的液体，广泛用于医药、化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域(Xiu ZL，Zeng AP.Appl MicrobiolBiotechnol，2008，DOI 10.1007/s00253-008-1387-4)。2，3-丁二醇可以作为前体物质用于生产在化工领域具有极其广泛用途的甲乙酮和1，3-丁二烯。2，3-丁二醇的燃烧值为27200kJ/kg，同乙醇相当(29055kJ/kg)，是一种潜在价值很高的燃料添加剂。2，3-丁二醇可与甲乙酮缩合并进行加氢反应生成辛烷，辛烷用来产生高质量的航空燃料。2，3-丁二醇的衍生物3-羟基丁酮和2，3-丁二醇二乙酸酯广泛用于食品、香料等行业。2，3-丁二醇还可用来制备聚合物、油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药以及药物的手性载体等等。
2，3-丁二醇的生产方法有化学合成法和微生物发酵法两种。化学合成法的成本较高，而且过程繁琐，不易操作，限制了大工业化生产。2，3-丁二醇的生产主要是微生物发酵法。微生物发酵法生产2，3-丁二醇，与化学合成法相比，环境友好，工艺简单，技术上较为成熟，既符合绿色化工的要求，又可避免化学合成的困难。近年来，随着石油价格的急剧攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇，并对其衍生物进行系统开发应用逐渐引起了人们的关注。细菌是现在唯一对发酵生产2，3-丁二醇有工业价值的微生物。用于发酵生产2，3-丁二醇的细菌菌属主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和气单胞菌属(Aeromonas)等。在这些细菌中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)显示出较高的生产潜力。肺炎克雷伯氏菌虽然缺乏糖化淀粉的能力，但能利用几乎所有的主要的糖，具有宽广的底物范围以及对培养条件适应能力强等优点，2，3-丁二醇生产能力是多粘芽孢杆菌的两倍多，发酵更为彻底，产生副产物量很少，有利于产物的提取。目前用产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca分批发酵生产2，3-丁二醇的最高浓度达到了118g/L，二醇(2，3-丁二醇+乙偶姻)产率为2.40g/(L·h)(Afschar AS et al，Appl Microbiol Biotechnol，1991，34：582-585)。使用肺炎克雷伯氏菌补料分批生产二醇的产量也达到了113g/L，但是二醇产率明显偏低(0.94g/(L·h))(Yu EKC and Saddker JN，Appl Environ Microbial，1983，46：630-635)。
要实现2，3-丁二醇的大规模工业生产，高的2，3-丁二醇产量和生产率有利于降低发酵成本，缩短发酵周期，提高设备利用率，是2，3-丁二醇发酵生产追求的主要目标。因此研究和开发高浓度的2，3-丁二醇发酵生产方法及其专用菌具有重要的现实意义，经检索，目前未见有使用肺炎克雷伯氏菌发酵高产2，3-丁二醇的专利报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是：
(1)提供一株高产2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM；
(2)提供一种的适应于该菌株高产2，3-丁二醇的培养基；
(3)提供一种所述菌在制备2，3-丁二醇中的应用。
本发明所述肺炎克雷伯氏菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097发酵生产2，3-丁二醇；其中涉及的方法是：
(1)菌种筛选及离子束诱变。
本发明所提供的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)菌株SDM是从山东济南南部山区的果园腐殖质土层中筛选诱变得到，所述菌株已于2008年6月23日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山)保藏，保藏号CCTCC NO：M 208097。
本发明所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097，形态学特征：
革兰氏阴性，不运动，有荚膜的直杆菌。VP反应呈阳性。其菌落颜色为米白色或黄白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、柠檬酸盐和丙二酸盐，37℃发酵葡萄糖产酸产气。能在KCN上生长。接触酶阳性，氧化酶阴性，不能水解明胶。其16S rDNA序列(序列表中的序列1)与多株肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA序列比对相似性达到99％。
(2)适用于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097生产2，3-丁二醇的培养基。
斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
发酵培养基组成为：碳源60～120g/L，氮源5～20g/L，乙酸钠1～4g/L，氯化钾1～4g/L，氯化钙0.05～0.1g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸锌0.2～0.6g/L，硫酸亚铁0.2～0.6g/L，pH值调至5.5～7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟。
上述发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木糖中的一种；该碳源单独灭菌，无需调节pH。进一步的优选方式是发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、蔗糖中的一种。
上述发酵培养基中的氮源至少含有玉米浆干粉5～20g/L、酵母粉5～15g/L、大豆蛋白胨5～20g/L、磷酸氢二铵5～20g/L、鱼粉10～20g/L、蛋白胨5～20g/L、氯化铵5～20g/L中的一种。进一步的优选方式是发酵培养基中的氮源至少含有玉米浆干粉5～20g/L、酵母粉5～15g/L、大豆蛋白胨5～20g/L、鱼粉10～20g/L中的一种。
(3)利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097生产2，3-丁二醇的方法
斜面活化培养：将肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097菌种接种于斜面培养基，30～45℃条件下，静置培养10～14小时，备用；
摇瓶发酵种子培养：将上述培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40～60mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到种子培养液；
发酵罐发酵种子培养：
一级种子培养：将上述培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于80～120mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以5～10％(体积比)的接种量接种于0.8～1.2升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到二级种子培养液；
发酵培养：
摇瓶发酵：以5～10％(体积比)的接种量，将种子液接种于装有80～120mL发酵培养基的500mL三角瓶瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养16～30小时，当发酵液中2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵停止。
50升发酵罐发酵：以体积比5～10％的接种量，将二级种子液接种于50升发酵罐中，发酵罐装液量为30升，然后以初始碳源浓度为60～120g/L、温度30～45℃、搅拌转速200～600rpm、通气量0.5～1.5vvm进行通风搅拌发酵培养，培养时间为20～60小时；发酵液初始pH值调至5.5～7.0，发酵过程中，通过流加3～6M的KOH和2～5M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH5.5～6.5；发酵过程中，每隔3～5小时取样测定发酵液中的糖残量和2，3-丁二醇浓度，并依据葡萄糖或蔗糖的浓度流加葡萄糖或蔗糖，当发酵液中2，3-丁二醇浓度超过120g/L时，停止流加，然后直到发酵液中葡萄糖或蔗糖耗完，2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵结束。
上述50升发酵罐发酵培养中流加方式为恒速流加、脉冲流加或恒底物浓度流加。
其中：所述恒速流加的流加速率优选200～500mL/h中的某一速率。所述脉冲流加的方式是当底物浓度降到10～30g/L时，脉冲流加底物，使底物浓度达到50～70g/L。所述恒底物浓度流加，底物浓度范围保持在10～40g/L中的某一浓度。
本发明的显著特点是：
从果园腐殖质土层中筛选得到一株具有发酵潜力的产2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌，经离子束诱变后筛选得到一株高产2，3-丁二醇的菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097。
本发明的用于发酵制备2，3-丁二醇的菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097，结合本发明所优化的培养基和发酵工艺，可以稳定地进行2，3-丁二醇的发酵生产，最终发酵罐补料分批发酵2，3-丁二醇的产量能够达到120～160g/L，2，3-丁二醇生产率最大为4.05g/(L·h)，转化率达到理论转化率的90～94％，该产量和产率均明显高于现有的2，3-丁二醇生产工艺。因此，该菌种具有产物浓度高、发酵周期短等特点，极具工业化应用潜力。
具体实施方式
一般性说明：
糖蜜成分以及处理方法参考(Xiao ZJ，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74：61-68)。
葡萄糖的测定方法为：发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一性测定葡萄糖含量。
木糖、蔗糖检测方法为：Agilent l100高效液相色谱仪，G1311A四元泵，示差折光分析检测器，进样量10μL。Agilent HPLC 2D色谱工作站。色谱柱为ZORBAX碳水化合物分析柱(4.6×150mm)，柱温30～50℃，流动相为乙腈∶水＝80∶20(v/v)，流速1.2mL/min。以保留时间定性，外标法定量。
2，3-丁二醇的测定方法：VARIAN CP-3380气相色谱仪检测。乙酸丁酯为萃取剂，体积比1∶1萃取，取上层有机相检测。具体测定的条件是：火焰离子监测器(FID)温度为280℃，进样器温度为220℃，而毛细管柱温是从50℃升温到180℃，升温速度20℃/min，载气为氮气。利用2，3-丁二醇标准品(德国Sigma-Aldrich公司，货号：361461)做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中2，3-丁二醇的含量。
实施例1：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097的分离诱变筛选及鉴定
该实施例中所用的培养基的组成如下：
营养液体培养基：葡萄糖140g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH为6。
营养琼脂培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH为6。
发酵培养基：葡萄糖140g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH为6。
营养肉汤培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH为6。
该实施例的具体操作过程如下：
1、分离诱变筛选
从果园取得腐殖质土层，每1g加入300mL三角瓶中(装有灭菌的营养液体培养基50mL)，在37℃条件下，置于摇床上以180rpm的转速培养48小时。将培养液以10-3、10-4两个稀释度涂布在固体营养琼脂培养基的培养皿中，37℃培养36小时，待长出单菌落后，挑选菌落面积大的菌落，接种到发酵培养基中，置于摇床上以180rpm的转速，37℃培养24小时，通过VP反应进行初筛，根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。筛选原理是2，3-丁二醇在碱性条件下氧化为二乙酰，与肌酸或胍类衍生物缩合成红色物质，加入α-萘酚、肌酸可以促进反应。然后测定初筛的阳性菌株的2，3-丁二醇的产量，挑选产量最高的菌，用于下一步离子束诱变。
将挑选的菌株在营养琼脂培养皿上划线培养，挑出单菌落，接种于基本培养基中，在37℃条件下，置于摇床上以180rpm的转速培养14小时至对数中期，用生理盐水洗涤后悬浮，制成菌悬液。吸取100μL涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上，涂布直径约1.5cm，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，离子能量30keV，注入剂量分别为0、5×1014ions/cm2、20×1014ions/cm2、100×1014ions/cm2。离子注入后的平皿用1mL生理盐 水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，稀释103倍，分别涂布于营养琼脂培养基的培养皿中，在37℃条件下，静置培养24小时，待长出单菌落后，挑选菌落面积大、生长良好的菌落，接种到发酵培养基中，置于摇床上以180rpm的转速，37℃培养24小时，测定2，3-丁二醇的产量，挑选产量最高的菌株。其中得到产量最高的菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM。
2、菌株的鉴定
根据“伯杰系统鉴定手册(第八版)”和“常见细菌系统鉴定手册”(科学出版社)提供的鉴定方法对该菌株进行鉴定，鉴定结果表明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM为革兰氏阴性，不运动，有荚膜的直杆菌。VP反应呈阳性。其菌落颜色为米白色或黄白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、柠檬酸盐和丙二酸盐，37℃发酵葡萄糖产酸产气。能在KCN上生长。接触酶阳性，氧化酶阴性，不能水解明胶。其16S rDNA序列(序列表中的序列1)与多株肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA序列比对相似性达到99％。
上述菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM，已于2008年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，邮政编码：430072，其保藏编号为CCTCC NO：M 208097。
实施例2：利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在三角瓶中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，37℃条件下，摇床培养10小时，转速150rpm，制得种子液；
(4)发酵培养：在装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中接入10mL步骤(3)的种子培养液，37℃条件下，摇床培养16小时，结束发酵，该摇床的转速为180rpm。实验共设30次重复。每2个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为1.1±0.2g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度55.7±0.4g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的93.7±0.7％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为3.48±0.02g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L， 硫酸镁0.05～0.1g/L。该培养基的初始pH为6.5，蒸馏水配制。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，酵母粉15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。葡萄糖分消。
实施例3：利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在三角瓶中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，40℃条件下，静置培养14小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，40℃条件下，摇床培养11小时，转速150rpm，制得种子液；
(4)发酵培养：在装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中接入10mL步骤(3)的种子培养液，40℃条件下，摇床培养13小时，结束发酵。该摇床的转速为180rpm。实验共设30次重复。每2个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度，计算2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为1.6±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度28.7±0.5g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.21±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为5.5。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L。该培养基的初始pH为5.5，蒸馏水配制。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：糖蜜110g/L，大豆蛋白胨15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为5.5。115℃条件下灭菌20分钟。糖蜜分消。
实施例4：利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在三角瓶中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，45℃条件下，静置培养14小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，45℃条件下，摇床培养11小时，转速150rpm，制得种子液；
(4)发酵培养：在装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中接入10mL步骤(3)的种子培养液，45℃条件下，摇床培养20小时，结束发酵。该摇床的转速为180rpm。实验共设30次重复。每2个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、蔗糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得蔗糖的浓度为0.9±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度52.4±0.6g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的91.1±1.0％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.62±0.03g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为6.0。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L。该培养基的初始pH为6.0，蒸馏水配制。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：蔗糖116g/L，磷酸氢二铵15g/L，鱼粉15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为6.0。115℃条件下灭菌20分钟。蔗糖分消。
实施例5：利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在三角瓶中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，35℃条件下，静置培养14小时；
(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，35℃条件下，摇床培养11小时，转速150rpm，制得种子液；
(4)发酵培养：在装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中接入10mL步骤(3)的种子培养液，35℃条件下，摇床培养17小时，结束发酵。该摇床的转速为180rpm。实验共设30次重复。每2个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、木糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得木糖的浓度为1.2±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度55.8±0.5g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的93.9±0.8％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为3.28±0.03g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为7.0。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L。该培养基的初始pH为7.0，蒸馏水配制。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：木糖120g/L，玉米浆干粉10g/L，氯化铵15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为7.0。115℃条件下灭菌20分钟。木糖分消。
实施例6、利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在50升发酵罐中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，35℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，35℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，35℃培养12小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速300rpm，35℃条件下发酵18小时。实验共设10次重复。每3个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、木糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得木糖的浓度为1.4±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度55.7±0.7g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的93.9±1.2％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为3.09±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，蒸馏水配制。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：木糖120g/L，酵母粉15g/L，氯化铵15g/L，乙酸钠3g/L， 氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。木糖分消。
实施例7、利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在50升发酵罐中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养12小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速500rpm，37℃条件下共发酵39.5小时。其中，发酵到7小时(经检测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为25g/L)后，开始补加葡萄糖，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在20～40g/L。实验共设10次重复。每3个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为2.8±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度158.6±1.4g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的92.2±0.9％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为4.02±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为7.0。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，蒸馏水配制。该培养基的初始pH为7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖65g/L，磷酸氢二铵15g/L，玉米浆干粉10g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为7.0。115℃条件下灭菌20分钟。葡萄糖分消。
实施例8、利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在50升发酵罐中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，45℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，45℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，45℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速400rpm，45℃条件下共发酵46小时。其中，发酵到8小时(经检测，此时发酵液中蔗糖的浓度为12g/L)，开始以300mL/h的恒速流加800g/L的蔗糖，补加24小时。然后直到发酵液中蔗糖耗完。实验共设10次重复。每3个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、蔗糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得蔗糖的浓度为3.3±0.6g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度122.0±1.6g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的90.6±1.3％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.65±0.03g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为6.0。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，蒸馏水配制。该培养基的初始pH为6.0。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：蔗糖80g/L，大豆蛋白胨15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为6.0。115℃条件下灭菌20分钟。蔗糖分消。
实施例9、利用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097在50升发酵罐中发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M208097；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，40℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速600rpm，40℃条件下共发酵42小时。其中，发酵到5小时(经检测，此时发酵液中葡萄糖的浓度为14g/L)，开始脉冲流加葡萄糖。定时取样，当发酵液中葡萄糖浓度降到20g/L左右时，脉冲流加葡萄糖使葡萄糖浓度到50g/L左右，如此反复。当发酵液中2，3-丁二醇浓度超过120g/L时，停止流加葡萄糖，然后直到发酵液中葡萄糖耗完。实验共设10次重复。每3个小时取发酵液，用于产物测定。
(5)产物检测：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度，计算2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为2.9±0.6g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度135.8±1.3g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为3.23±0.03g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，该培养基的初始pH为6.5。115℃灭菌20分钟。
上述种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，蒸馏水配制。该培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。
上述发酵培养基组成为：糖蜜100g/L，氯化铵15g/L，鱼粉15g/L，乙酸钠3g/L，氯化钾1g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.3g/L。该发酵培养基的初始pH为6.5。115℃条件下灭菌20分钟。糖蜜分消。
序列表
<110>山东大学
<120>一株肺炎克雷伯氏菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用
<141>2008-7-18
<160>1
<210>1
<211>660
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
<221>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097 16S rDNA
<222>(1)…(660)
<400>1
cctacggcta ccttgttacg acttcacccc agtcatgaat cacaaagtgg taagcgccct 60
cccgaaggtt aagctaccta cttcttttgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt 120
gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgtag cattctgatc tacgattact aacgattccg 180
acttcatgga gtcgagttgc agactccaat ccggactacg acatacttta gaggtccgct 240
tgctctcgcg aggtcgcttc tctttgtata tgccattgta gcacgtgtgt agccctggtc 300
gtaagggcca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cagtttatca ctggcagtct 360
cctttgagtt cccggccgga ccgctggcaa caaaggataa gggttgcgct cgttgcggga 420
cttaacccaa catttcacaa cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tctcacagtt 480
cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctgtggatg tcaagaccag gtaaggttct 540
tcgcgttgca tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcat 600
ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga tttaacgcgt tagctccgga 660
Claims (10)
1.一株产2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌，其特征在于：该菌株名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM，菌株已于2008年6月24日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NO：M 208097。
2.权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097发酵生产2，3-丁二醇；其中涉及的方法是：
斜面活化培养：将肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDM CCTCC NO：M 208097菌种接种于斜面培养基，30～45℃条件下，静置培养10～14小时，备用；
摇瓶发酵种子培养：将上述培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40～60mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到种子培养液；
发酵罐发酵种子培养：
一级种子培养：将上述培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于80～120mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以体积比5～10％的接种量接种于0.8～1.2升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养10～16小时，得到二级种子培养液；
发酵培养：
摇瓶发酵：以体积比5～10％的接种量，将种子液接种于装有80～120mL发酵培养基的500mL三角瓶瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～45℃培养16～30小时，当发酵液中2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵停止；
50升发酵罐发酵：以体积比5～10％的接种量，将二级种子液接种于50升发酵罐中，发酵罐装液量为30升，然后以初始碳源浓度为60～120g/L、温度30～45℃、搅拌转速200～600rpm、通气量0.5～1.5vvm进行通风搅拌发酵培养，培养时间为20～60小时；发酵液初始pH值调至5.5～7.0，发酵过程中，通过流加3～6M的KOH和2～5M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH5.5～6.5；发酵过程中，每隔3～5小时取样测定发酵液中的糖残量和2，3-丁二醇浓度，并依据葡萄糖或蔗糖的浓度流加葡萄糖或蔗糖，当发酵液中2，3-丁二醇浓度超过120g/L时，停止流加，然后直到发酵液中葡萄糖或蔗糖耗完，2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵结束；
其中：上述培养中涉及的培养基及配方是：
斜面培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
种子培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，磷酸氢二铵5～20g/L，氯化钾1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
发酵培养基组成为：碳源60～120g/L，氮源5～20g/L，乙酸钠1～4g/L，氯化钾1～4g/L，氯化钙0.05～0.1g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸锌0.2～0.6g/L，硫酸亚铁0.2～0.6g/L，pH值调至5.5～7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟。
3.如权利要求2所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述50升发酵罐发酵培养中流加方式为恒速流加、脉冲流加或恒底物浓度流加。
4.如权利要求3所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述恒速流加的流加速率为200～500mL/h。
5.如权利要求3所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述脉冲流加的方式是当底物浓度降到10～30g/L时，脉冲流加底物，使底物浓度达到50～70g/L。
6.如权利要求3所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述恒底物浓度流加，底物浓度范围保持在10～40g/L。
7.如权利要求2所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木糖中的一种；该碳源单独灭菌，无需调节pH。
8.如权利要求7所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、蔗糖中的一种。
9.如权利要求2所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的氮源至少含有玉米浆干粉5～20g/L、酵母粉5～15g/L、大豆蛋白胨5～20g/L、磷酸氢二铵5～20g/L、鱼粉10～20g/L、蛋白胨5～20g/L、氯化铵5～20g/L中的一种。
10.如权利要求9所述肺炎克雷伯氏菌在制备2，3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的氮源至少含有玉米浆干粉5～20g/L、酵母粉5～15g/L、大豆蛋白胨5～20g/L、鱼粉10～20g/L中的一种。
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| 秦加阳等.一种简单的高产2,3-丁二醇发酵生产方法.《生物加工过程》.2005,第3卷(第4期),71-73. * |
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| CN101457211A (zh) | 2009-06-17 |
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