CN111218415A - 一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用 - Google Patents

一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCC No.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪的特性，将其应用到生料固态培养工艺中，可以生产富含四甲基吡嗪的曲，对进一步提高酒体中健康活性物质具有重要作用。

Description

一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和 应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其涉及一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用。
背景技术
四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是我国首先从常用中药川芎中提取出的生物碱，它是川芎治疗心脑血管疾病的有效成分之一，已被证明具有保肝、扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，广泛应用于心脑血管疾病、肾小球疾病和呼吸系统疾病等的治疗。在中国白酒中亦检测到一定浓度的四甲基吡嗪，主要通过制曲和高温堆积发酵中经微生物和美拉德热反应共同作用产生，经蒸馏带入酒中，赋予了中国白酒以健康功能。
CN101445786A公开了一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208157。该菌株来源自酱香型白酒的高温大曲，该菌株能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆饼粉为底物，以大量积累内源前体来提高四甲基吡嗪的产量。解决了微生物发酵生产四甲基吡嗪中产物浓度低、需外源添加前体和前体利用率低的问题。
CN107446860A公开了一种产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其应用，其中所述地衣芽孢杆菌的分类命名为地衣芽孢杆菌GJBL055，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月24日，保藏编号为CCTCC NO：M2017204。使用中温架子培养模式，将地衣芽孢杆菌接入到平板大曲中，通过对功能微生物的预培养、架子曲空间模型的构建，区房温度的四阶段调控，形成一种中温条件下高产四甲基吡嗪的大曲制造工艺，使大曲中四甲基吡嗪含量提高到提高到400mg/kg。
CN101955980A公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，具体地说是一种微生物利用还原糖发酵积累前体乙偶姻、以及乙偶姻和氨经非酶促反应合成四甲基吡嗪的两步法生产工艺，属于生物工程技术领域。菌株利用还原糖发酵获得生物量并积累内源前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应合成四甲基吡嗪。乙偶姻积累量得以有效提高(38-44g/L)，高浓度的内源前体乙偶姻和氨在适宜的条件下可快速反应生成四甲基吡嗪(16-20g/L)，内源乙偶姻的积累以及原位发酵环境，显著提高了前体的利用率(40.3％)。且该方法是在液态条件下，通过添加外源铵盐来提高四甲基吡嗪的含量。
但是，制曲和堆积过程为开放式发酵模式，微生物组成和结构比较复杂，很难进行过程参数控制来调控四甲基吡嗪的高效积累。同时，制曲过程周期长(30天)、效率低，且主要为酸性环境，不利于四甲基吡嗪的高效合成，致使四甲基吡嗪含量相对较低。同时，细菌麸曲纯种培养可以提高四甲基吡嗪含量，但该过程麸曲需要蒸煮，需消耗一定量的能耗。同时，大曲中产四甲基吡嗪的菌株主要为好氧菌，而白酒酿造为固态发酵模式，过程中大多为厌氧和兼性厌氧状态。因此，如何筛选一株能在兼性厌氧状态下且可在生料状态下高产四甲基吡嗪的菌株是非常有意义的，并将其用于白酒酿造过程，对增强酒体的功能性具有重要作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，尤其提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，具体包括一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌、其分离培养方法、其在制曲或食品酿造中的应用、一种高产四甲基吡嗪的细菌曲及其制备方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCC No.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述“高产四甲基吡嗪”是指将该地衣芽孢杆菌以5％的接种量应用于细菌曲制作工艺中时，培养6天后，相对于每kg曲，四甲基吡嗪的含量可达到1590mg/kg。
本发明筛选得到了一种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪特性的地衣芽孢杆菌，将该菌株应用到生料固态培养工艺中，生产富含四甲基吡嗪的曲，提高了生产效率，对进一步提高酒体中健康活性物质具有重要作用。同时，对功能性酿造微生物资源的强化利用和传统制曲过程的创新升级具有深远的社会和经济意义。
第二方面，本发明提供一种如上所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：
(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并高温处理后于无菌固体培养基上进行培养，获得菌落；
(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行分离纯化，获得单个纯种菌落并筛选出所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。
所述高温大曲为江苏今世缘酒业股份有限公司生产的高温大曲。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基。
优选地，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉18-22g/L、溶剂为水；pH＝7.0-7.4。
所述牛肉膏的浓度可以是2g/L、3g/L或4g/L等。
所述蛋白胨的浓度可以是8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或12g/L等。
所述氯化钠的浓度可以是4g/L、5g/L或6g/L等。
所述琼脂粉的浓度可以是18g/L、19g/L、20g/L、21g/L或22g/L等。
所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH值可以为7.0、7.1、7.2、7.3或7.4等。
优选地，步骤(2)所述高温处理是指在80-85℃(例如80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃等)下处理15-30min(例如15min、18min、20min、22min、25min、28min或30min等)。
优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行5-10次划线培养，达到分离纯化的目的。
优选地，步骤(3)所述筛选包括四甲基吡嗪产量能力测定和分子生物学鉴定。
优选地，所述四甲基吡嗪产量能力测定的方法为：挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上35-40℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等)培养18-30h(例如18h、20h、22h、25h、28h或30h等)，测定四甲基吡嗪含量。此操作是为了获得潜在的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。
所述分子生物学鉴定是指采用26S rDNA序列同源性分析法进行鉴定。
优选地，所述麸皮固体培养基包括麸皮和水，每mL水中含有2-3g麸皮，例如2g、2.5g或3g等。
优选地，所述筛选得到的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌保藏于无菌固体斜面培养基中备用。
第三方面，本发明提供一种如上所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌在制曲或食品酿造中的应用。
第四方面，本发明提供一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，所述高产四甲基吡嗪的细菌曲是利用如上所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌制备得到的。
第五方面，本发明提供一种如上所述的高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法，所述制备方法包括：利用高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌制备功能菌种子液，将其接种于生小麦中，培养，得到所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
具体地，将制备得到的功能菌种子液通过管道逐步加入生料小麦固体基质中，并通过绞龙混匀，完成接菌。小麦进入圆盘后，经绞龙输送、搅拌、铺平，厚度控制在约35cm，采用通风和加热搅拌系统进行培养。
优选地，所述功能菌种子液的制备方法包括：
(1)挑取地衣芽孢杆菌菌株于液体培养基中，培养，获得一级种子液；
(2)将步骤(1)获得的一级种子液接种于发酵罐中，培养，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)获得的二级种子液接种于发酵罐中，培养，获得所述功能菌种子液。
优选地，步骤(1)所述液体培养基按质量浓度计包括牛肉膏0.2-0.4％，蛋白胨0.8-1.2％，氯化钠0.4-0.6％，溶剂为水；pH＝7.0-7.4。
所述牛肉膏的质量浓度可以为0.2％、0.3％或0.4％等。
所述蛋白胨的质量浓度可以为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％或1.2％等。
所述氯化钠的质量浓度可以为0.4％、0.5％或0.6％等。
所述液体培养基的pH值可以为7.0、7.1、7.2、7.3或7.4等。
优选地，步骤(1)至步骤(3)中所述培养的温度为35-40℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等；培养的时间为20-28h，例如20h、22h、23h、24h、25h、26h、27h或28h等。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中接种时的接种量为3-7％，例如3％、4％、5％、6％或7％等。
所述接种量为一级种子液或二级种子液的体积占发酵罐中培养液体积的比例。
所述将功能菌种子液接种于生小麦的接种量为3-7％，例如3％、4％、5％、6％或7％等。
所述接种量为功能菌种子液的质量占生小麦质量的比例。
优选地，所述培养的方法为依次在35-40℃(例如35℃、36℃、37℃、38℃或40℃等)、40-50℃(例如40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等)和55-65℃(例如55℃、58℃、60℃、62℃或65℃等)下分别培养44-52h、、44-52h和44-52h(例如44h、46h、48h、50h、51h或52h等)。
上述培养方法为最佳的培养温度控制条件，为实现酿造过程功能微生物的利用奠定了基础。
作为本发明的优选技术方案，所述高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法具体包括如下步骤：
(1)挑取地衣芽孢杆菌菌株于液体培养基中，35-40℃下110-130rpm摇床培养20-28h，获得一级种子液；
(2)将步骤(1)获得的一级种子液以3-7％的接种量接种于发酵罐中，35-40℃下90-110rpm摇床培养20-28h，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)获得的二级种子液以3-7％的接种量接种于发酵罐中，35-40℃下90-110rpm摇床培养20-28h，获得所述功能菌种子液；
(4)将步骤(3)获得的功能菌种子液以3-7％的接种量接种于生小麦中，依次在35-40℃、40-50℃和55-65℃下分别培养44-52h，获得所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到了一种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪特性的地衣芽孢杆菌，本发明将现代生物技术与生产技术相结合，将该菌株应用到生料固态培养工艺中，生产富含四甲基吡嗪的曲，提高了生产效率，对进一步提高酒体中健康活性物质具有重要作用。同时，对功能性酿造微生物资源的强化利用和传统制曲过程的创新升级具有深远的社会和经济意义。
附图说明
图1是本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的菌落形态图；
图2是本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的个体形态图；
图3是四甲基吡嗪标准品的色谱图；
图4是从实施例6样品中提取到的四甲基吡嗪的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所用高温大曲来自于江苏今世缘酒业股份有限公司生产的高温大曲。
实施例1
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，分离方法包括如下步骤：
(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并在80℃下处理20min后于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养，获得菌落；牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉20g/L、溶剂为水；pH＝7.2；
(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行划线培养，获得单个纯种菌落；
(4)挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上37℃培养24h，测定四甲基吡嗪含量，对获得的潜在的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌进行分子生物学鉴定，最终获得所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。
实施例2
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，分离方法包括如下步骤：
(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并在85℃下处理15min后于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养，获得菌落；牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏2g/L、蛋白胨12g/L、氯化钠6g/L、琼脂粉22g/L、溶剂为水；pH＝7.3；
(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行划线培养，获得单个纯种菌落；
(4)挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上37℃培养24h，测定四甲基吡嗪含量，对获得的潜在的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌进行分子生物学鉴定，最终获得所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。
实施例3
对实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌进行菌落形态和个体形态的观察，结果如图1和图2所示(图1为本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的菌落形态图，图2为本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的个体形态图)。由图1可知：本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶。由图2可知：在光学显微镜下观察看出，本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌个体形状为杆状，有单个存在，也有成对和链状存在，上述这些特征均与细菌的菌落及个体特征相符。
实施例4
对实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌进行生理生化特性鉴定实验，结果如表1所示(“-”代表阴性，“+”代表阳性)。
表1
Figure BDA0002324221180000091
Figure BDA0002324221180000101
由表1结果可知：根据以上生理生化特征结果结合菌落形态特征及个体形态特征结果，最终可以确定为地衣芽孢杆菌。
实施例5
对实施例1筛选得到的地衣芽孢杆菌进行16S rDNA分子生物学鉴定。将单菌落挑取，利用无菌水混匀，加入细菌通用引物，进行菌落PCR扩增，对其基因序列进行测定。本发明高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的16S rDNA碱基序列如下：
Figure BDA0002324221180000102
实施例6
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，其制备方法为：
(1)挑取实施例1获得的地衣芽孢杆菌菌株于液体培养基中，37℃下120rpm摇床培养24h，获得一级种子液；所述液体培养基按质量浓度计包括牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，溶剂为水；pH＝7.2；
(2)将步骤(1)获得的一级种子液以5％的接种量接种于发酵罐中，37℃下100rpm培养24h，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)获得的二级种子液以5％的接种量接种于发酵罐中，37℃下100rpm培养24h，获得所述功能菌种子液；
(4)将步骤(3)获得的功能菌种子液以5％的接种量接种于生小麦中，依次在37℃、45℃和60℃下分别培养48h，获得所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
实施例7
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，其制备方法为：
(1)挑取实施例2获得的地衣芽孢杆菌菌株于液体培养基中，35℃下110rpm摇床培养24h，获得一级种子液；所述液体培养基按质量浓度计包括牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，溶剂为水；pH＝7.2；
(2)将步骤(1)获得的一级种子液以6％的接种量接种于发酵罐中，35℃下110rpm培养24h，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)获得的二级种子液以7％的接种量接种于发酵罐中，40℃下90rpm培养24h，获得所述功能菌种子液；
(4)将步骤(3)获得的功能菌种子液以5％的接种量接种于生小麦中，依次在35℃、42℃和65℃下分别培养48h，获得所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
实施例8
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，其制备方法与实施例6的区别仅在于步骤(4)中将步骤(3)获得的功能菌种子液以5％的接种量接种于生小麦中，依次在28℃、37℃、45℃和60℃下分别培养48h，获得所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。其他均一致。
实施例9
本实施例提供一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，其制备方法与实施例6的区别仅在于步骤(4)中将步骤(3)获得的功能菌种子液以5％的接种量接种于生小麦中，依次在37℃、60℃和65℃下分别培养48h，获得所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。其他均一致。
实施例10
本实施例对实施例6-9制得的细菌曲分析四甲基吡嗪的含量。
称取10g曲，于烘箱135℃30min烘干，测量水分。再称取10g绝干曲，加入100mL蒸馏水，超声提取30min，离心，收集上清液。
四甲基吡嗪提取采用顶空固相微萃取，萃取头为DVB/CAR/PDMS，吸取5mL上清液于20mL顶空瓶中，加入2g NaCl和20μL 40mg/L内标(2-乙酰基吡啶)，50℃萃取40min，进样检测。
四甲基吡嗪检测条件为：GC7890B气相色谱仪，使用CP-Wax 57CB柱，载气为氮气(N2)，进样口温度220℃，检测器温度230℃，程序升温：60℃维持1min，然后以5℃/min的速度升到100℃，再以8℃/min的速度升到210℃，保持5min；流速1mL/min，不分流。
首先制备标准曲线：将四甲基吡嗪储备液，用纯水稀释至1.488μg/L、3.72μg/L、7.44μg/L、74.4μg/L、116μg/L和148.8μg/L系列梯度，吸取5mL上清液于20mL顶空瓶中，加入2g NaCl和20μL 40mg/L内标(2-乙酰基吡啶)，顶空固相微萃取后进样分析。以四甲基吡嗪浓度作为横坐标，四甲基吡嗪与内标峰面积比为纵坐标作图，得到标准曲线，并以此测定各组细菌曲中四甲基吡嗪的含量，结果如表2所示。四甲基吡嗪标准品的色谱图如图3所示：四甲基吡嗪的保留时间为12.715min，内标品的保留时间为14.637min。实施例6样品的色谱图如图4所示。
表2
组别 四甲基吡嗪含量(mg/kg)
实施例6 1590
实施例7 1593
实施例8 9.85
实施例9 328
由表2数据可知：本发明所涉及的地衣芽孢杆菌是一种具有在兼性厌氧固态发酵条件下，利用生料高产四甲基吡嗪特性的地衣芽孢杆菌，利用其制备得到的曲也能富含四甲基吡嗪，含量高达1590mg/kg及以上。且在制备细菌曲的过程中，其培养条件是非常关键的因素，其会影响最终的四甲基吡嗪含量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏今世缘酒业股份有限公司
<120> 一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其分离培养方法和应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌S1001菌株
<400> 1
cgggcccccc ttctagcggc tggctccaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa 60
ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120
gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac 180
tgagaacaga tttgtgggat tggcttagcc tcgcggcttc gctgcccttt gttctgccca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga 360
tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa ggggaagccc tatctctagg gttgtcagag 480
gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540
ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg 600
agtgcttaat gcgtttgctg cagcactaaa gggcggaaac cctctaacac ttagcactca 660
tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgcgcc 720
tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac 780
gcatttcacc gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt 840
ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg 900
cgcgctttac gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960
ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtc 999

Claims (10)

1.一种高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)S1001菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为CGMCCNo.17255，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括如下步骤：
(1)将高温大曲与无菌生理盐水混合后得到菌悬液；
(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释并高温处理后于无菌固体培养基上进行培养，获得菌落；
(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行分离纯化，获得单个纯种菌落并筛选出所述高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌。
3.如权利要求2所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基；
优选地，所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括牛肉膏2-4g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂粉18-22g/L、溶剂为水；pH＝7.0-7.4；
优选地，步骤(2)所述高温处理是指在80-85℃下处理15-30min；
优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌固体培养基上进行5-10次划线培养，达到分离纯化的目的。
4.如权利要求2或3所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选包括四甲基吡嗪产量能力测定和分子生物学鉴定；
优选地，所述四甲基吡嗪产量能力测定的方法为：挑取单菌落进行液体培养，制备种子液，接种于麸皮固体培养基上35-40℃培养18-30h，测定四甲基吡嗪含量；
优选地，所述筛选得到的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌保藏于无菌固体斜面培养基中备用。
5.如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌在制曲或食品酿造中的应用。
6.一种高产四甲基吡嗪的细菌曲，其特征在于，所述高产四甲基吡嗪的细菌曲是利用权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌制备得到的。
7.如权利要求6所述的高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：利用高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌制备功能菌种子液，将其接种于生小麦中，培养，得到所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
8.如权利要求7所述的高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法，其特征在于，所述功能菌种子液的制备方法包括：
(1)挑取地衣芽孢杆菌菌株于液体培养基中，培养，获得一级种子液；
(2)将步骤(1)获得的一级种子液接种于发酵罐中，培养，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)获得的二级种子液接种于发酵罐中，培养，获得所述功能菌种子液。
9.如权利要求8所述的高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基按质量浓度计包括牛肉膏0.2-0.4％，蛋白胨0.8-1.2％，氯化钠0.4-0.6％，溶剂为水；pH＝7.0-7.4；
优选地，步骤(1)至步骤(3)中所述培养的温度为35-40℃；培养的时间为20-28h；
优选地，步骤(2)和步骤(3)中接种时的接种量为3-7％。
10.如权利要求7所述的高产四甲基吡嗪的细菌曲的制备方法，其特征在于，所述接种时的接种量为3-7％；
优选地，所述培养的方法为依次在35-40℃、40-50℃和55-65℃下分别培养44-52h、44-52h和44-52h。
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