CN114854617A - 高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法，所述方法包括如下步骤：将菌株与无菌水混合，得到菌悬液；水浴加热；将水浴后的菌悬液接种于富集培养基培养，得到培养液；将得到的培养液梯度稀释，涂布于固体培养基上培养；挑取得到的菌落，继续在固体培养基上进行分离纯化；将得到的单个菌落挑选出，接种于液体培养基中进行培养，制备种子液；将制备的种子液接种于固态麸皮培养基中培养，测定四甲基吡嗪生成情况，筛选出高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌；所述菌株四甲基吡嗪产量可达1260mg/kg，在目前已报道的生产水平中属于较高水平。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法。
背景技术
四甲基吡嗪TTMP，又名川芎嗪，为一种含氮杂环化合物，具有特殊的香气，可作为天然食品添加剂，来提升食品的香气，同时TTMP还有很重要的药用价值，可用于治疗心血管疾病、呼吸系统疾病以及慢性肾衰竭，有研究表明，四甲基吡嗪还有扩张血管改善微循环及抑制血小板集聚等作用。四甲基吡嗪会在白酒制曲、堆积等阶段产生，并随蒸馏进入酒体中，在酱香、芝麻香型等白酒中具有较高的含量，白酒中四甲基吡嗪的发现，给相关学者和白酒行业提供了一个关于研究健康白酒的重要方向。
关于白酒中四甲基吡嗪的来源，有学者认为其是美拉德反应的产物，氨基化合物与还原糖之间发生的非酶催化的褐变反应,反应经过复杂的历程。也有学者提出，TTMP在白酒中的来源是微生物合成，首先某些芽孢杆菌利用葡萄糖等碳源生成3-羟基-2丁酮，而3-羟基-2丁酮作为TTMP的前体物质，和氨经过非酶促的缩合反应，在高温的促进下，产生TTMP。虽然现有的菌种筛选方法都能检测到TTMP的存在，但是白酒中TTMP的含量总体偏低。
发明内容
本发明提供了一种高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法，解决了现有技术存在的四甲基吡嗪产量低的问题，其应用于高温大曲及白酒酿造过程，增加酒中四甲基吡嗪的含量，从而提升酒的风味与口感，为健康白酒的研究与发展提供一定参考。
为了解决该技术问题，本发明提供了如下技术方案：
一方面，提供了一株高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌，由所述解淀粉芽孢杆菌制得的细菌曲中四甲基吡嗪的量≥1260mg/kg。
所述的一种高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌的固态发酵模拟方法，包括如下步骤：
(1)将菌株与无菌水混合，得到菌悬液；水浴加热；
(2)将水浴后的菌悬液接种于富集培养基培养，得到培养液；
(3)将步骤(2)得到的培养液梯度稀释，涂布于固体培养基上培养；
(4)挑取步骤(3)中的菌落，继续在固体培养基上进行分离纯化；
(5)将步骤(4)中得到的单个菌落挑选出，接种于液体培养基中进行培养，制备种子液；
(6)将步骤(5)中制备的种子液接种于固态培养基中培养。
优选的，所述步骤(1)中的菌株从酱香型高温大曲中筛选而得；水浴温度80-85℃，水浴时间10-20min。
所述步骤(2)富集培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖2g/L，MgSO4·H2O0.01g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为水；pH＝7.8，所述步骤(2)富集培养基培养时间为24h。
所述步骤(3)和(4)中固体培养基包括牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2，所述步骤(3)培养时间为24h，培养温度为37℃。
所述步骤(5)中液体培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2。
优选的，所述步骤(5)培养时间为24h，培养温度为37℃。
所述步骤(6)固体培养基为麸皮：大豆：高粱：稻壳为3:3:3:1，水分为36％-40％，高温蒸30min-60min制备得到，培养时间为4-10天。
升温前生物量达到4x108CFU/g以上，培养结束后四甲基吡嗪含量高于1000mg/kg。
优选的，所述种子液接种量为1％-5％。
另一方面提供了一种含有四甲基吡嗪的功能菌液，所述含四甲基吡嗪的功能菌液由如所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备而得。
含四甲基吡嗪的功能菌液的制备过程如下：
(1)将保藏的菌株活化，活化完成后接种于种子培养基制备种子液；
(2)将步骤(1)中的种子液接种于发酵培养基中制备功能菌液。
优选的，步骤(1)所述种子培养基包括葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2。
优选的，步骤(1)培养时间为48h，培养温度为37℃。
优选的，步骤(2)所述发酵培养基包括蜂蜜60-80g/L，酵母粉10-20g/L，蛋白胨30-40g/L。
优选的，步骤(2)发酵时间为6天。发酵温度为37℃2天，45℃2天，60℃2天。
含有四甲基吡嗪的功能菌液的保藏方法，将功能菌液存于经灭菌的密闭不锈钢罐内，置于-20℃下短期保存。
本发明还提供了一种高产四甲基吡嗪的功能细菌曲，所述高产四甲基吡嗪的细菌曲是由所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备而得，发酵第四天发酵液菌含量达到4x1010CFU/mL以上，发酵结束后四甲基吡嗪含量大于2.0mg/L。
高产四甲基吡嗪细功能菌曲的制备方法包括：利用高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备功能菌种子液，种子液接种于发酵培养基中制备功能菌液，将生小麦分装于不锈钢铁盆，所述含四甲基吡嗪的功能菌液以10％的接种量接种于生小麦中，混合均匀后置于培养箱内培养，37-45℃培养4-6天，45-50℃培养3-5天，55-65℃培养4-6天，前期每天翻拌一次，发酵后期三天翻拌一次，得到所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。四甲基吡嗪含量达到1260mg/kg以上。
本发明还提供了一种提高白酒中四甲基吡嗪含量的方法，将功能菌液按10％-20％的接种量，在蒸馏取酒前与酒醅和原料混合，在蒸馏过程中四甲基吡嗪溶于酒精中，提高所得白酒中四甲基吡嗪的含量，在原料出甑后分别再以5％-10％和0.5％-1.5％的接种量接种所述功能菌液和细菌曲。
本发明和现有技术相比，具有以下优点：可以通过筛选高产TTMP的微生物应用于白酒生产，从而提高白酒中TTMP的含量。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明中检测四甲基吡嗪液相色谱标准曲线；
图2为本发明中四甲基吡嗪的检测结果；
图3为本发明中解淀粉芽孢杆菌的菌落形态；
图4为本发明中解淀粉芽孢杆菌的个体形态；
图5为基于16SrDNA基因序列同源性构建的系统发育树结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
种子液培养：
(1)将菌株与无菌水混合，得到菌悬液；将所得的菌悬液进行80℃高温水浴20min。
(2)将上述高温处理后的菌悬液在无菌环境下冷却，并在超净工作台上吸取5ml菌悬液，接种于95ml富集培养基，在摇床培养箱中培养，以获得培养液；富集培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖2g/L，MgSO4·H2O 0.01g，KH2PO42g，pH7.8；培养条件为37℃，140r/min，培养24h。
(3)将步骤(2)所获得的培养液，稀释成10-4-10-7梯度，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，在培养箱中培养；牛肉膏蛋白胨培养基包括牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2；培养温度37℃，培养时间24h。
(4)挑取步骤(3)中的形态规则完整的菌落，继续在牛肉膏蛋白胨培养基上进行涂布操作培养，直到得到完整的单菌落为止，以进行纯化；
(5)将步骤(4)中的单个菌落用接种环挑出，接种于50ml液体培养基中，在摇床培养箱培养，以制备种子液。液体培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0-7.2；培养条件为37℃，140r/min，培养24h。
实施例2
模拟固态发酵：
(1)制备固态小麦培养基：制备培养基的原料来自于某工厂，经过碾磨的小麦，将原料小麦过20目筛，得到麸皮，将麸皮：大豆：高粱：稻壳按3:3:3:1混合，加入38％的热水，混匀，热水温度为60℃，稍微浸润10min左右，将混合后的原料在沸水上蒸30min，将蒸后的原料摊凉，装入250ml锥形瓶中，每个锥形瓶分装50g原料，最后将原料在121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)接种：在超净工作台上，将实施例1中制备的种子液按3％接种于步骤(1)所制得的固体培养基中，充分混匀，放入摇床培养箱中培养，摇床转速140r/min，升温程序为前两天37℃。第三天45℃，第四五天60℃。
(3)TTMP提取：将步骤(2)中发酵5天后的糟醅取出，进行TTMP的提取，称取5g样品，加入0.1g的无水氯化钙和57％vol的乙醇溶液15mL，浸泡摇匀，在25℃条件下经超声波浸提30min，10000r/min离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，得到待测样品。
(4)测定：用高效液相色谱法检测TTMP含量，配置浓度为5、20、40、80、100、500μg/ml的TTMP标准溶液，TTMP的检测条件为：色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm，0.5μm)；检测器：VWD检测器；检测波长278nm；流动相：水溶液(加0.05％三氟乙酸)∶甲醇＝3∶7；流速1mL/min。标准曲线如图1；
将待测样品进行测试，测定色谱图如图2，经计算TTMP含量达1260mg/kg。
实施例3
功能菌液和细菌曲制备
(1)制备种子液：将活化好的菌株接种于种子培养基，种子培养基包括葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2。
(2)制备功能菌液：将种子液接种于发酵培养基，以150L发酵罐为发酵容器，装液量为100L，接种量为10％，通气量为1.0vvm，搅拌转速为500rpm，发酵时间为6天。发酵温度为37℃2天，45℃2天，60℃2天。发酵培养基包括蜂蜜60-80g/L，酵母粉10-20g/L，蛋白胨30-40g/L。
(3)功能曲制备：将生小麦分装于不锈钢铁盆，所述含四甲基吡嗪的功能菌液以10％的接种量接种于生小麦中，混合均匀后置于培养箱内培养，37-45℃培养5天，45-50℃培养4天，55-65℃培养5天，前期每天翻拌一次，发酵后期三天翻拌一次。
实施例4
功能菌液和功能曲的应用：
(1)高粱粉碎：将高粱初步粉碎，整粒与碎粒之比约为7:3，粉碎完毕用后润粮；
(2)配料：润粮后的原料加6％左右的母糟，再接种10％功能菌液拌匀。
(3)蒸酒蒸料：将混合均匀的原料和母糟上甑蒸酒，同时蒸原料。
(4)摊晾：蒸好的原料和糟醅进行摊晾，加曲粉、泼洒酒尾，在此过程泼洒功能菌液8％，功能曲1％。
(5)堆积：将原料堆积3-4天。
(6)入池发酵：堆积完成后入池发酵。
实施例5
形态观察及分子生物学鉴定：
通过实施例1和2筛选得到的高产TTMP的菌株进行菌落形态和个体形态的观察，其菌落形态如图3，边缘不规则，呈乳白色，中间有凸起，表面粗糙。个体形状在显微镜下呈短杆状，如图4。对其进行16srDNA序列同源性分析法进行鉴定，碱基序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1
将所得碱基序列，与Genbank数据库进行比对，选取与所述菌同源性高的相关菌的碱基序列，使用MEGA7软件建立系统发育树，结果如图5，所述高产四甲基吡嗪芽孢杆菌编号为B2，鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
<120> 高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其固态发酵模拟方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 1
aggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60
gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120
actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgc ttgtttgaac cgcatggttc 180
agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240
ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360
atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420
ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600
cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720
gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc 1020
gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140
ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260
taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga g 1431
Claims (10)
1.一株高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，由所述解淀粉芽孢杆菌制得的细菌曲中四甲基吡嗪的量≥1260mg/kg。
2.如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌的固态发酵模拟方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菌株与无菌水混合，得到菌悬液；水浴加热；
(2)将水浴后的菌悬液接种于富集培养基培养，得到培养液；
(3)将步骤(2)得到的培养液梯度稀释，涂布于固体培养基上培养；
(4)挑取步骤(3)中的菌落，继续在固体培养基上进行分离纯化；
(5)将步骤(4)中得到的单个菌落挑选出，接种于液体培养基中进行培养，制备种子液；
(6)将步骤(5)中制备的种子液接种于固态培养基中培养。
3.根据权利要求2所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌的固态发酵模拟方法，其特征在于，所述步骤(2)富集培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，淀粉3g/L，MgSO4·H2O0.01g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为水；pH＝7.8，所述步骤(2)富集培养基培养时间为24h；所述步骤(3)和(4)中固体培养基包括牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2，所述步骤(3)培养时间为24h，培养温度为37℃；所述步骤(5)中液体培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水；pH＝7.0-7.2；所述步骤(6)固体培养基为麸皮：大豆：高粱：稻壳为3:3:3:1，水分为36％-40％，高温蒸30min-60min制备得到，培养时间为4-10天。
4.一种含有四甲基吡嗪的功能菌液，其特征在于，所述含四甲基吡嗪的功能菌液由如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备而得。
5.如权利要求4所述的高产四甲基吡嗪功能菌液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菌株活化，活化完成后接种于种子培养基制备种子液；
(2)将步骤(1)中的种子液接种于发酵培养基中制备功能菌液。
6.根据权利要求5所述的高产四甲基吡嗪功能菌液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述种子培养基包括葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水；步骤(2)所述发酵培养基包括：蜂蜜60-80g/L，酵母粉10-20g/L，蛋白胨30-40g/L。
7.如权利要求4所述含有四甲基吡嗪的功能菌液的保藏方法，其特征在于，将功能菌液存于经灭菌的密闭不锈钢罐内，置于-20℃下短期保存。
8.一种高产四甲基吡嗪的功能细菌曲，其特征在于，所述高产四甲基吡嗪的细菌曲是由如权利要求1所述的高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备而得。
9.如权利要求8所述的高产四甲基吡嗪细功能菌曲的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：利用高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌制备功能菌种子液，种子液接种于发酵培养基中制备功能菌液，将功能菌液接种于生小麦中，培养后得到所述高产四甲基吡嗪的细菌曲。
10.一种提高白酒中四甲基吡嗪含量的方法，其特征在于，将权利要求9所述的功能菌液按10％-20％的接种量，在蒸馏取酒前与酒醅和原料混合，在原料出甑后分别再以5％-10％和0.5％-1.5％的接种量接种所述功能菌液和细菌曲。
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| CN101445786A (zh) * | 2008-12-08 | 2009-06-03 | 江南大学 | 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法 |
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