CN104388514B - 利用复合菌种发酵制备γ‑氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于利用微生物发酵制备天然产物的技术领域，具体涉及利用复合菌种发酵制备γ‑氨基丁酸的方法。本发明的发酵菌株包括植物乳杆菌ZSM‑002、卡斯特酒香酵母ZSM‑001和保藏号为CCTCC NO：M 2014376的根霉(Rhizopus oryzae)zsm‑005，其特征在于，以谷物种子或含胚副产物为原料，经清洗消毒、γ‑氨基丁酸富集、分离提取、精制与纯化等过程制备高浓度液态γ‑氨基丁酸产品，液态γ‑氨基丁酸经干燥过程制备高浓度固态γ‑氨基丁酸产品。与现有技术相比，本发明采用多菌种协同发酵，可以提高谷物或含胚副产物富集γ‑氨基丁酸的能力。

Description

利用复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于利用微生物发酵制备天然产物的技术领域，具体涉及利用复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸的方法。本发明的发酵菌株涉及乳酸菌、酵母菌和根霉菌。

背景技术

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，简称GABA)是一种由四碳非蛋白质组成的天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有增强脑细胞代谢、降血压、活化肾功能、改善肝功能、防止肥胖、促进乙醇代谢等生理功能。随着对其生理功能研究的深入，γ-氨基丁酸已发展成为一种新型的活性功能因子，被广泛应用于食品工业、医药、食品保健、化工及农业等领域。

GABA由L-谷氨酸经谷氨酸脱竣酶催化发生脱羧反应制得，主要有生物合成法和微生物发酵法，相比而言，利用微生物发酵法较为安全，成本较低。现有技术公开的菌株大多都是以大肠杆菌为发酵GABA的菌株，但其存在安全方面的隐患。最近发现乳酸菌、酵母菌和根霉中同样拥有谷氨酸脱羧酶活性，可以催化底物L-谷氨酸合成GABA，可被应用于GABA的合成领域。另外，酵母菌、乳酸菌和根霉三者可以共生，具有相近的生长条件，都可以利用果糖、葡萄糖、麦芽糖等进行发酵。乳酸菌和根霉在发酵过程中水解淀粉、蛋白质及脂肪等，产生易于吸收的单糖、游离氨基酸和挥发性脂肪酸以及多种维生素(VB₁、VB₂、叶酸等)，这些小分子物质为酵母菌的生长提供了丰富的营养来源。酵母大分子物质能诱导乳酸菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸含量增加，从而促进乳酸菌的生长。因此，酵母菌、乳酸菌和根霉能相互依存，共生发酵，其代谢产物也对人体有益。所以采用乳酸菌、酵母菌和根霉复合菌种发酵制备GABA可提高GABA的生成率。

米类、豆类、麦类等谷物种子胚乳中都含有丰富的蛋白质，谷氨酸含量高，可以作为生产GABA的良好底物。谷物种子中含有谷氨酸脱羧酶等内源酶，可以通过控制环境条件，激活谷氨酸脱羧酶，转化L-谷氨酸，富集GABA。另外，米糠、麸皮等是谷物加工的副产物，是谷物表皮及胚等的混合物，富含多种营养物质和生理活性物质，蛋白质及氨基酸种类较齐全，被誉为“天赐营养源”。用谷物副产物作为发酵合成GABA的培养基，具有配方简单、原料价格低廉、纯天然、无污染等优点。

目前，利用发酵方法制备γ-氨基丁酸的工艺已有一些进展：

申请号为CN201210302371.6的专利申请公开了一种微生物发酵合成γ-氨基丁酸的方法，将短乳杆菌L2菌株经MRS培养平盘活化后，转接到GYP种子培养基中用作发酵种子，再以1～5％体积比的接种量接种于培养基(小米糠10～100g/L、L-谷氨酸钠30～80g/L，培养基初始pH为3.00～5.00)中，20～45℃静止培养50～80h，即得到高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液，浓度可达到12～32g/L。与本发明比较接近的专利文献是申请号为CN02113140.6的专利，该专利以乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作为菌种，以0.5％的接种量接入PY培养基，添加0.5％～3％的碳源，0.5％～5％的氮源，于25℃～40℃静置培养14～16h，所得发酵液中γ-氨基丁酸含量可达300～500mg/100mL。发酵液经中和、脱臭后可直接干燥成粉剂，粉剂中γ-氨基丁酸含量在5％以上。但是该专利制备的γ-氨基丁酸产品中GABA含量较低。

尽管有上述文献报道了一些利用微生物发酵制备γ-氨基丁酸方法，但目前尚未见到利用乳酸菌、酵母菌和根霉复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸的方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种利用复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸的方法，本发明的复合菌种为自主筛选的乳酸菌(植物乳杆菌)、酵母菌和根霉，具有酶系丰富，协同发酵能力强。本发明制备、富集γ-氨基丁酸的工艺方法操作简便、产量高、所得产物易于分离纯化，生产过程无污染。

本发明的技术方案如下所述：

一种利用复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸(简称GABA)的方法，包括如下步骤：

(1)原料的清洗消毒：将新鲜的谷物种子或含胚副产物清理后用1％次氯酸钠溶液消毒，并用蒸馏水清洗；

(2)GABA富集

1)利用内源酶富集GABA

将清洗消毒后的原料用1％氯化钙溶液于25～38℃下浸泡1～6h，用水清洗后于25～38℃下培养4～24h，使其发芽，得到内源酶富集的高GABA谷物；

2)利用复合菌种发酵富集GABA

将上步得到的高GABA谷物加水，使谷物与水的体积比为1：1，然后磨浆，在浆液中加入L-谷氨酸钠30～80g/L、葡萄糖10～50g/L、米糠10～100g/L，按体积比为0.2～5％的接种量接种复合菌株，所述的复合菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZSM-002、卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)ZSM-001和保藏号为CCTCC NO：M 2014376的根霉(Rhizopus sp.)zsm-005，三菌株的体积比为0.001～3：0.001～3：0.001～3，搅拌混匀后于20～45℃下密封发酵50～80h，得含γ-氨基丁酸的发酵液；

(3)GABA的分离提取

1)离心：将所得的发酵液引入高速离心机中，于4～10℃、6000～12000r/min条件下离心10min，收集上清液；

2)絮凝：向上步所得的上清液加入0.15～0.5g/L的壳聚糖，于20～50℃下搅拌絮凝，得絮凝液；

3)过滤：将上步所得的絮凝液过滤，得滤液；

(4)GABA的精制与纯化

1)脱色：向所得的滤液中加入重量比为0.5～2％的活性炭，混合均匀后于50～80℃下搅拌10～50min，过滤得未纯化的GABA溶液；

2)浓缩：将上步未纯化的GABA溶液于50～90℃温度，5～30kPa压力下浓缩20～100min，使浓缩液体积为浓缩前的1/3～1/2，灌装，得到浓缩的GABA溶液；

3)灭菌：将上步所得的浓缩GABA溶液于80～120℃下灭菌20～40min，得到高浓度液态GABA产品；

(5)将浓缩后的GABA溶液用喷雾干燥法干燥，得到固态GABA产品(粉剂)。

作为本发明的优选方案，上述步骤(2)中2)的植物乳杆菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-001和根霉zsm-005的体积比为2：2：1。

本发明的特点或优势在于：

(1)本发明采用复合菌种发酵，有利于发酵产物GABA浓度的提高：本发明采用植物乳杆菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-001和根霉zsn-005复合菌种发酵就是为了建立一种制备GABA的微生物复合体系，该复合体系能有效与本发明的工艺相结合，所述的植物乳杆菌、卡斯特酒香酵母和根霉三者能相互依存、共生发酵，其代谢产物也对人体有益，采用复合菌种发酵制备GABA可提高GABA的生成率。

(2)本发明在发酵底物上具有特色，采用内源酶富集GABA后的发芽谷物(或含胚副产物)为发酵底物：谷物(或含胚副产物)发芽时，谷氨酸脱羧酶活性增加，将L-谷氨酸转化为GABA，以发芽谷物(或含胚副产物)为发酵底物，可提高产品GABA的浓度。

(3)本发明的发酵培养基采用谷物加工后的副产物米糠作为天然培养基，具有配方简单、原料价格低廉，易于分离纯化等优点。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明的根霉(Rhizopus sp.)zsm-005的18SrDNA核苷酸序列。

图1：是本发明GABA总体生产工艺流程图。

图2：是发酵温度对GABA生成的影响。

图3：是发酵时间对GABA生成的影响。

图4：是复合菌种接种量对GABA生成的影响。

图5：是根霉(Rhizopus sp.)zsm-005的微观形态图。

图中标记说明：图5中的a图是zsm-005的假根；图5中的b图是zsm-005的孢子囊；图5中的c图是zsm-005的孢囊孢子；图5中的d图是zsm-005的厚垣孢子。

图6：是本发明的根霉(Rhizopus sp.)zsm-005的进化树图。

具体实施方式

实施例1：根霉(Rhizopus sp.)zsm-005的分离、鉴定、菌学特征及其他微生物相关信息

1、根霉(Rhizopus sp.)zsm-005的分离、鉴定、保藏

申请人从湖北省孝感地区的民间传统甜米酒的酒曲中分离得到一株根霉(Rhizopus sp.)zsm-005菌株，将其命名为Rhizopus sp.zsm-005。

具体步骤如下：

(1)分离方法(稀释平板法)

在无菌操作条件下，取10.0g来自湖北省孝感市的民间传统甜米酒曲，加入到90ml无菌水的三角瓶中(瓶中预先放一定数量的小玻璃珠)，振动摇晃30min，然后进行梯度稀释，选择稀释度为10-3、10-4、10-5的稀释液。无菌条件下取1ml稀释样液，转移至培养皿中，然后倒入PDA培养基，混匀后于30℃下培养。12h后开始挑取平面优势霉菌菌丝体，分别点种于查氏培养基中(李健容,蔡爱群.民间传统酒曲卡要微牛物的分离及鉴定[J].酿酒科技,2007,l：111-121.)，30℃培养48h。平板纯化四代后，转PDA斜面(为常用培养基)贮藏。

(2)鉴定方法

1)本发明的根霉Rhizopus sp.zsm-005的分离、筛选和鉴定，普通微生物学鉴定方法参照周德庆主编，《微生物学实验手册》，上海科学技术出版社，1986年；以及胡瑞卿译，《常见与常用真菌》，科学出版社，1973年报道的方法进行。

2)利用插片法观察霉菌微观形态：将无菌盖玻片以45°左右的角度并排插入PDA平板培养基中，插入深度为盖玻片的1/3左右。用无菌接种环挑取霉菌菌丝点种于盖玻片与培养基的交界线处，在30℃培养24h。用镊子将盖玻片小心取出，擦净盖玻片背面的培养基和菌丝，放在载片上(有菌丝的一面朝下)，置于显微镜下直接观察。

(3)根霉zsm-005菌株的菌落形态特征：

根霉zsm-005菌株在马铃薯培养基培养12h后，菌落直径约为1～1.5cm，菌丝较致密，气生菌丝生长较慢。24h后铺满平板，出现白色和黑色孢子。其微观形态特征为：有假根，孢囊梗直立生长，孢子囊近球形，灰褐色，直径50～200um，孢囊孢子球形或椭圆形，有厚垣孢子，经鉴定为根霉Rhizopus sp.。

本发明的根霉zsm-005菌株的微观形态特征见图5所示。

(4)根霉(Rhizopus sp)zsm-005的分子鉴定

对上述分离筛选的根霉(Rhizopus sp)zsm-005菌株的18SrDNA序列进行了鉴定，具体鉴定步骤如下：

1)根霉基因组的提取：将供试菌株活化后转接于50mL的PDA液体培养基中，30℃摇床(200r/min)培养过夜。离心收集菌丝体，采用CTAB法(许璐.分子标记技术在红曲菌菌种鉴别中的应用.2007.)提取基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取质量。若质量合格，-20℃保存备用。

2)PCR扩增：采用真菌l 8SrDNA通用引物：P1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')、P2(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3')以根霉的DNA基因组为模板，PCR扩增根霉18S rDNA的部分基因序列。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸7min。取2uL的PCR物于0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

3)将经0.8％琼脂糖凝胶电泳检验后的PCR扩增产物进行18SrDNA序列分析序列测定(由南京金斯瑞生物技术有限公司完成)。将测序结果在NCBI数据库中采用Blast软件进行在线比对分析，检索结果为Rhizopus sp.zsm-005的序列与根霉Rhizopus sp.的序列高度相似，同源性高达99％，并通过MEGA4软件构建进化树(见图6)。确定本发明的菌株为根霉(Rhizopus sp.)。

4)菌株的保藏：申请人将以上所得到的根霉(Rhizopus sp)zsm-005菌株命名为Rhizopus sp.zsm-005，于2014年8月8日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2014376.

本发明根霉zsm-005具有以下优点：

(1)该菌株生长速度较快，在发酵过程产生黑色孢子较少。

(2)该菌株可以作为优质专用发酵剂应用：例如该发酵剂应用在酿制的甜米酒汁中游离氨基酸含量较高，含有麦芽糖等功能性低聚糖等，糖类组成丰富，营养价值更高，且产品质量稳定，风味良好(在同日申请中，本发明应用举例略)；该菌株应用在米面包专用粉的生产上亦能够显著改善米面包专用粉的品质(在同日申请中，本发明应用举例略)。

(3)该菌株可以与其他发酵菌株混合使用制成复合发酵剂，克服了传统的单一菌种发酵的缺陷，实现了多菌种协同发酵的优化模式，能够显著改善食品或提取的天然产物的品质或得率。

2、本发明中其他菌株的相关信息：

(1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZSM-002，从米浆的发酵液分离得到，保藏号为CCTCC NO：M209127，华中农业大学授权专利，参照文献：专利号:ZL2009100638581。

(2)卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)ZSM-001，从米浆的发酵液分离得到，其保藏号为CCTCC NO：M207150，华中农业大学授权专利,参照文献：专利号：ZL2007100536112。

(3)相关培养基及制备

1)菌株的保藏培养基(即：琼脂试管斜面培养基，以g/L计)：葡萄糖15g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，乙酸钠2g/L，MgSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·4H2O 0.001g/L，NaCl0.001g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，琼脂15g/L，pH6.8，用于菌株的保藏。

2)菌株的活化培养基(即：改良MRS培养基，以g/L计)：蛋白胨10.0g/L，牛肉提取物10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，乙酸钠2.0g/L，柠檬酸二胺2g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，pH6.5，用于菌株的活化。

3)发酵种子培养基(即：GYP种子培养基，以g/L计)：胰蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，丁二酸钠5g/L，pH6.5，用于复合菌株发酵种子的制备。

4)发酵培养基(以g/L计)：L-谷氨酸钠30～80g/L，葡萄糖10～50g/L、米糠10～100g/L，pH3～5，用于发酵合成GABA。

3.其他试验材料

实施例中所用的米糠由江苏省徐州丰禾粮油有限公司提供。其它试剂从中国医药(集团)上海化学试剂公司采购。

4.制备工艺

将植物乳杆菌ZSM-002菌株、卡斯特酒香酵母ZSM-001菌株和根霉zsm-005三菌株接入MRS菌株活化培养基的液体培养基中，于30℃下静止活化培养16h，取一环菌种转接到GYP种子培养基中，培养20～35h，用作发酵种子。然后按体积比为0.2～5％的接种量接种复合菌株，再与试验材料一起充分混匀在20～45℃下密封发酵50～80h，得到未提纯的GABA的发酵液；发酵液经分离提取、精制纯化等得到液态GABA产品，将液态GABA采用喷雾干燥法干燥，即可得到固态GABA产品(粉剂)。

GABA的测定方法：参照文献中GABA的测定方法(房克敏等.HPLC法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量[J].食品科学,2006,27(4):208-211.)。

实施例2利用复合菌种发酵法生产GABA的举例

(1)原料的清洗消毒：将新鲜糙米清理，去除碎粒、霉变粒和异色粒，用1％浓度的次氯酸钠溶液消毒，并用自来水清洗，得洁净糙米；

(2)GABA富集

1)利用内源酶富集GABA

将洁净糙米用1％浓度的氯化钙溶液按体积比1：2(糙米：氯化钙溶液)的比例在30℃下浸泡6h，之后用蒸馏水清洗3次，沥去水分后，于35℃下培养16h，使其发芽。培养过程中用营养液(配方：乳酸钙110mg/L、谷氨酸钠2000mg/L)以水雾方式(具体方法参照：黄汉英.赵思明,尹涛,等.一种适用于芽菜生产的智能化培养方法及智能化培养装置[P].专利号:ZL 2010102213926)喷洒在糙米表面，保持培养室内相对湿度为92％，并每隔2h用5mg/L的臭氧气体喷洒1次；培养完毕后，用蒸馏水清洗糙米3次，得到内源酶富集的发芽糙米；

2)利用复合菌种发酵富集GABA

将上步得到的发芽糙米加水(发芽糙米：水＝1：1，v/v)磨浆，向浆液中加入L-谷氨酸钠50g/L、葡萄糖40g/L、米糠60g/L，按体积比为3％的接种量向浆液中接种复合菌种(植物乳杆菌ZSM-002：卡斯特酒香酵母ZSM-001和根霉zsm-005，体积比为2：2：1)，搅拌混匀后于30℃下密封发酵70h，得到含GABA的发酵液；

(3)GABA的分离提取

1)离心：将所得的发酵液引入高速离心机中，于4℃、10000r/min条件下离心10min，收集清液；

2)絮凝：向上步的清液加入0.25g/L的壳聚糖，于40℃下搅拌絮凝，得絮凝液；

3)过滤：将所得的絮凝液过滤，得过滤液；

(4)GABA的精制与纯化

1)脱色：向过滤液中加入1％(重量比)活性炭，混合均匀后于70℃下搅拌30min，过滤后得未纯化的GABA溶液；

2)浓缩：将上步未纯化的GABA溶液于60℃、25kPa压力下浓缩60min，使浓缩液体积约为浓缩前的1/3左右，灌装得浓缩的GABA溶液；

3)灭菌：将上述浓缩的GABA溶液于90℃下灭菌40min，得高浓度液态GABA产品；

(5)或将浓缩后的GABA溶液用喷雾干燥法(具体方法参照：陈启聪等，香蕉喷雾干燥工艺优化[J].农业工程学报,2010,26(8):331-336)干燥，得高浓度固态GABA产品(粉剂)。

本发明制备出的液态GABA产品中GABA含量可达29.59g/L，固态GABA产品中GABA含量可达60g/100g。

实施例3发酵条件试验

(1)适宜发酵温度的确定

将复合菌种(植物乳杆菌ZSM-002：卡斯特酒香酵母ZSM-001：根霉zsm-005菌株按体积比＝2：2：1)按复合菌种与发酵培养基体积比为3％的接种量将复合菌株接种到发酵培养基中(发酵培养基配方：L-谷氨酸钠50g/L、葡萄糖40g/L、米糠60g/L，补充水分至1L)中，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃六个温度下发酵培养70h，用高效液相色谱测定发酵液中GABA的含量。结果表明利用复合菌种发酵生产GABA的温度以30℃为宜(见图2)。

(2)适宜发酵时间的确定

将复合菌种(ZSM-002：ZSM-001：zsm-005菌株按体积比＝2：2：1)按复合菌种与发酵培养基体积比为3％的接种量将复合菌株接种到发酵培养基(发酵培养基配方同前)中，30℃发酵培养120h，每10h取样测定发酵液中GABA的含量。结果显示随着发酵时间的延长，GABA的生成量呈先增加后降低的趋势。在发酵70h时，发酵液GABA含量最高(见图3)。

(3)复合菌种接种量的确定

将复合菌种(ZSM-002：ZSM-001：ZSM-005＝2：2：1，体积比)分别按复合菌种与发酵培养基体积比为0.2％、1％、2％、3％、4％、5％的接种量接种到发酵培养基中(发酵培养基配方同前)，30℃温度下发酵培养70h，研究接种量对菌株发酵富集GABA的影响。试验结果表明接种量的变化影响菌体发酵生产GABA的能力，当接种量为3％时，发酵液中GABA含量最高，因此确定最佳接种量为3％(见图4)。

实施例4不同发酵底物生产GABA的应用举例

按照实施例1的工艺步骤，在本实施例中，将利用复合菌种发酵富集GABA中的发酵底物分别采用糙米、米糠、发芽糙米、发芽米糠、发芽小麦、发芽麸皮、发芽绿豆，以探索利用内源酶富集GABA过程对GABA生成量的影响，其它实施步骤与实施例1相同，实验设计和测试数据如表1-2所示。

表1发酵底物配方设计

表2不同发酵底物发酵富集GABA的含量

由表2可以看出，采用发芽糙米(发芽米糠)为发酵底物富集GABA优于直接采用糙米(米糠)，这可能是由于糙米(米糠)发芽时，L-谷氨酸在谷氨酸脱竣酶的催化作用下产生GABA，富含GABA的发芽糙米(米糠)再经微生物发酵过程可进一步富集GABA，提高GABA的含量。而以发芽谷物(副产物)为发酵底物时又以发芽糙米最优，这可能是因为糙米发芽时，其中谷氨酸脱羧酶的酶活最高。

实施例5复合菌种对GABA产量的影响

按照实施例1所述的工艺步骤，在本实施例中，用复合菌种发酵富集GABA过程中设计了不同的菌种及配比，以探索复合菌种(植物乳杆菌ZSM-002：卡斯特酒香酵母ZSM-001：根霉zsm-005)对GABA的影响。试验设计如表3(按待发酵浆液体积为1L计)，试验数据如表4所示。

表3菌种配方设计

表4菌种用量对GABA含量的影响

从表4可以看出，采用复合菌种发酵优于采用单菌种发酵，而复合菌种中又以植物乳杆菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-001和根霉zsm-005复合菌种的体积比为2：2：1时，发酵转化富集所得GABA产品的浓度最高。这可能是因为植物乳杆菌、卡斯特酒香酵母和根霉三者具有相近的生长条件，且乳酸菌和根霉在发酵过程中产生的小分子物质为酵母菌的生长提供营养，酵母大分子物质能诱导乳酸菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸含量增加，从而促进乳酸菌的生长，三菌株共生发酵可以明显提高GABA的含量。

实施例6壳聚糖添加量对GABA产量的影响

按照实施例1所述的工艺步骤，在本实施例中，将步骤(3)中2)絮凝过程采用不同浓度的壳聚糖，以探索壳聚糖添加量对GABA的影响。本实施例的测试数据如表5所示。

表5壳聚糖添加量对GABA浓度的影响

由表5可以看出，絮凝时添加0.25g/L的壳聚糖，产物中GABA溶液浓度最高。这说明一定程度上添加壳聚糖的用量，可以增加絮体的体积，使之易于沉降，但若壳聚糖过量，可能会使产生胶体的复稳现象破坏并且絮体的体积过大，在搅拌的作用下会使絮团破碎，不利于絮凝。

实施例7不同浓缩条件对GABA产量的影响

按照实施例1所述的工艺步骤，在本实施例中，将步骤(4)中2)浓缩过程设计了不同浓缩条件，以探索浓缩条件对GABA的影响。试验设计及测试数据如表6、表7所示。

表6不同浓缩条件试验设计

表7不同浓缩条件对GABA含量的影响

由表7看出，采用浓缩方式2，即发酵液在温度60℃、压力25kPa下浓缩40min，浓缩效果较好，浓缩液中GABA浓度较高。

Claims (1)

1.一种利用复合菌种发酵制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法，其特征包括如下步骤：

(1)原料的清洗消毒：将新鲜的谷物种子或含胚副产物清理后用1％次氯酸钠溶液消毒，并用蒸馏水清洗；

(2)GABA富集

1)利用内源酶富集GABA

将清洗消毒后的原料用1％氯化钙溶液于25～38℃下浸泡1～6h，用水清洗后于25～38℃下培养4～24h，使其发芽，得到利用内源酶富集的高GABA谷物种子；

2)利用复合菌种发酵富集GABA

将步骤1)得到的高GABA谷物种子加水，使谷物种子与水的体积比为1：1，然后磨浆，在浆液中加入L-谷氨酸钠30～80g/L、葡萄糖10～50g/L、米糠10～100g/L，按体积比为0.2～5％的接种量接种复合菌种，所述的复合菌种为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZSM-002、卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)ZSM-001和保藏号为CCTCC NO：M2014376的根霉(Rhizopus sp.)zsm-005，三菌株的体积比为2：2：1，搅拌混匀后于20～45℃下密封发酵50～80h，得含GABA的发酵液；

(3)GABA的分离提取

1)离心：将所得的发酵液引入高速离心机中，于4～10℃、6000～12000r/min条件下离心10min，收集上清液；

2)絮凝：向步骤1)所得的上清液中加入0.15～0.5g/L的壳聚糖，于20～50℃下搅拌絮凝，得絮凝液；

3)过滤：将步骤2)所得的絮凝液过滤，得滤液；

(4)GABA的初步纯化

1)脱色：向所得的滤液中加入重量比为0.5～2％的活性炭，混合均匀后于50～80℃下搅拌10～50min，过滤得初步纯化的GABA溶液；

2)浓缩：将步骤1)所得的初步纯化的GABA溶液于50～90℃温度，5～30kPa压力下浓缩20～100min，使浓缩液体积为浓缩前的1/3～1/2，灌装，得到浓缩的GABA溶液；

3)灭菌：将步骤2)所得的浓缩的GABA溶液于80～120℃下灭菌20～40min，得到高浓度液态GABA产品；或

将步骤2)所得的浓缩的GABA溶液用喷雾干燥法干燥，得到固态GABA产品；

其中：

步骤(1)中所述谷物种子包括糙米、玉米、黄豆、绿豆、小麦、大麦，所述的含胚副产物包括米糠、麸皮。