CN106967616A - 一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。本发明筛选的菌株，分类命名为米根霉(Rhizopus oryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2016565。本发明从酒曲中筛选获得了高产γ‑氨基丁酸的米根霉株Q1。该菌株在含有0.5％谷氨酸钠的发酵培养基中培养5天后，γ‑氨基丁酸产量为1.08mg/g，淀粉酶活力为150.2U/g。本发明为微生物发酵产γ‑氨基丁酸提供了基础。

Description

一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉生物技术领域，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸米根霉菌株的筛选方法。
背景技术
γ-氨基丁酸的别名为氨酪酸或哌啶酸，化学名为4-氨基丁酸，其分子式为NH2CH2CH2CH2COOH，分子量为103.1。γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。因此，γ-氨基丁酸成为重要的医药与保健原料。γ-氨基丁酸结构式为：
目前，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法等。其中，化学合成方法成本高产率低，且在生产过程中涉及到有毒溶剂，存在化学试剂残留，因此安全方面存在隐患；植物富集法依赖于种植业，收到气候、地域等影响较大，产量不稳定，难以满足日益增长的需要。微生物合成法主要是利用微生物发酵，通过筛选优良、高产且稳定的微生物菌株，发酵生产γ-氨基丁酸，主要包括乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、谷氨酸棒状杆菌等。然而，目前通过微生物发酵生产γ-氨基丁酸的产量还较低，主要有以下几个原因：(1)微生物培养成本过高，培养基比较昂贵，发酵设备投资较大；(2)由于γ-氨基丁酸是水溶性，因而从发酵产物中提取γ-氨基丁酸的工艺比较复杂。因此需要筛选新的能够生产γ-氨基丁酸的菌株。
米根霉是一种常见的霉菌，在自然界中分布十分广泛。米根霉在酿造中扮演着十分重要的角色，由于其能产生活性很强的淀粉酶，在酿酒工业上常用作淀粉质原料的糖化菌，我国最早利用根霉糖化淀粉(阿明诺法)生产酒精。米根霉在生长过程中能够产生苹果酸、γ-氨基丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸等多种有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料以及环境等领域。因此可以采用根霉来生产γ-氨基丁酸，用于食品与医药行业。
本发明筛选到一株高产γ-氨基丁酸米根霉株，对该菌进行了鉴定，对生产γ-氨基丁酸的培养条件进行了初步研究，为微生物合成γ-氨基丁酸工业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产γ-氨基丁酸的米根霉，并对其进行了分类学鉴定，该菌命名为Rhizopus oryzae Q1。对发酵产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物合成γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。
为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产生γ-氨基丁酸的新菌株。经过18S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为米根霉(Rhizopus oryzae)，命名为米根霉Q1(Rhizopus oryzae Q1)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏号为CCTCC M 2016565。
菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；
γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液。发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析。
菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增末班，使用真菌18S rDNA的通用引物进行序列扩增，PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次。PCR体系组成：DNA模板0.2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTPs溶液5μL，DNA聚合酶0.2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，去离子水19.1μL。取PCR产物1μL，加5μL Loading buffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，DNA Green染色后，在紫外灯下观察电泳条带。用凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18SrDNA的测序，将测序结果与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析。
米根霉Q1为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养2-3天，至孢子成熟；采用无菌水洗下孢子，将孢子数稀释到107个/mL；以1-5％的体积比将孢子悬浮液转接至发酵培养基，在30℃条件下培养5天。
产孢子培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。发酵培养基成分为：糯米30g，谷氨酸0-0.6g，水5-30g，自然pH，121℃下灭菌20分钟。
本发明方法的优点：
(1)米根霉生长周期较短，仅需要3-5天即可产生高浓度的γ-氨基丁酸，比目前已知的微生物菌种产量都高，这一过程决定了生产工艺将较短，并且不容易被其他微生物污染。
(2)本发明中采用的米根霉，所需的发酵培养基组成比较简单，仅需要大米即可，不需要额外添加特殊的物质，因此在工业上应用比较便利。
(3)米根霉生长能力较强，仅需要2天即可将菌丝体长满培养基，然后分泌出淀粉酶等分解培养基中的营养物质，能够快速并充分地利用培养基中的营养物质，只需要一般的发酵车间即可生产，易于推广。生物材料样品的保藏信息：
保藏的生物材料样品：米根霉Q1(Rhizopus oryzae Q1)；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心(邮编：430072)；
保藏日期：2016年10月17日；
保藏登记号：CCTCC M 2016565。
附图说明
图1是米根霉Q1孢子囊和假根的显微形态图。
图2是γ-氨基丁酸与其他20种氨基酸标准物的氨基酸图谱，图中共有21个峰信号，由左向右依次为：牛磺酸(Tau)，天冬氨酸(Asp)，苏氨酸(Thr)，丝氨酸(Ser)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，缬氨酸(Val)，甲硫氨酸(Met)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，酪氨酸(Tyr)，苯丙氨酸(Phe)，γ-氨基丁酸(GABA)，鸟氨酸(Orn)，赖氨酸(Lys)，氨(NH3)，组氨酸(His)，色氨酸(Trp)，精氨酸(Arg)；21个信号峰的出峰时间依次为2.19分钟，4.95分钟，5.64分钟，6.21分钟，7.09分钟，10.17分钟，11.29分钟，12.60分钟，13.19分钟，14.45分钟，16.79分钟，17.99分钟，19.37分钟，20.57分钟，21.56分钟，22.39分钟，23.00分钟，23.85分钟，25.08分钟，28.17分钟，29.27分钟。
图3是米根霉Q1发酵产物中γ-氨基丁酸的氨基酸图谱，图中出峰时间为21.56分钟的信号峰代表γ-氨基丁酸。
具体实施方式
实施例1：高产γ-氨基丁酸菌种的筛选
本实施例在湖北地区的酒厂等处采集酒曲，进行米根霉Q1(Rhizopus oryzae Q1)的筛选。方法如下：
米根霉的筛选：将采集的酒曲样品用无菌水稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，在30℃条件下培养2-3天后，根据菌落形态挑取生长出来的米根霉单菌落。在筛选培养基上反复多次划线培养，获得纯菌株(图1)。筛选培养基成分为(g/L)：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。121℃灭菌20min。
高产γ-氨基丁酸的米根霉筛选：将所有米根霉株以5％的接种量接种于装有30g发酵培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下培养5天。然后发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析。将γ-氨基丁酸产量最高的米根霉命名为Q1。
实施例2：γ-氨基丁酸的检测
将实施例1中米根霉Q1菌株的发酵物，在50℃条件下烘干后，用研磨器将固体物研磨成粉状，然后用分析天平称量2.000g，用盐酸溶液(0.02mol/L)溶解并定容到100mL。用滤纸过滤除去不溶物后，用移液管吸取10mL溶液在全自动氨基酸分析仪上进行分析。根据γ-氨基丁酸标准物的出峰时间一致性，来确定样品中的γ-氨基丁酸。通过γ-氨基丁酸的标准曲线来计算γ-氨基丁酸的浓度。
实施例3：米根霉Q1所产γ-氨基丁酸的检测
将实施例1中筛选得到的米根霉Q1菌株，在产孢子培养基培养2-3天，用无菌水将孢子洗下来，并稀释到107个/mL。以5％的接种量将孢子液接种到发酵培养基中，在30℃条件下静置培养5天。将发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g并研磨成粉，用0.02mol/L盐酸定容到100mL，取10mL过滤除去固体后的溶液，进行γ-氨基丁酸含量分析。根据出峰的保留时间与峰面积计算，米根霉Q1的发酵产物中γ-氨基丁酸含量为0.31mg/g(图3)。所用产孢子培养基成分为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。所用发酵培养基成分为：浸泡过夜滤干的糯米30g，pH自然，于121℃下灭菌20min。
实施例4：不同谷氨酸添加量条件下米根霉Q1产γ-氨基丁酸的研究
将实施例1中筛选所得的米根霉Q1接种到产孢子培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH)上，在30℃条件下培养2-3天后，用无菌水冲洗菌落表面获得孢子悬液，然后将孢子浓度稀释到107个/mL。以5％的体积比将孢子悬浮液分别接种到不含谷氨酸的发酵培养基与含有0.5％谷氨酸含量的发酵培养基中，在30℃条件下静置培养5天。通过日立L-8800全自动氨基酸分析仪分析γ-氨基丁酸的含量。米根霉Q1在无谷氨酸的发酵培养基中培养5天后，γ-氨基丁酸的含量为0.31mg/g；在含有0.5％谷氨酸的发酵培养基中培养5天后，γ-氨基丁酸的含量为1.08mg/g。

Claims (5)

1.一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌株，其特征在于：其分类命名为米根霉(Rhizopusoryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M2016565。
2.根据权利要求1所述米根霉株Q1的筛选方法，其特征是：
(1)菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；
(2)γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液；发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析；
(3)菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增模板，使用真菌18S rDNA的通用引物进行序列扩增，
正向引物为P1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；
反向引物为P2：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG；
PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次；
PCR体系组成：DNA模板0.2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTPs溶液1μL，DNA聚合酶0.2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，去离子水19.1μL；取PCR产物1μL，加5μL Loading buffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，DNA Green染色后，在紫外灯下观察电泳条带；
用凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18S rDNA的测序，将测序结果与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析。
3.权利要求1所述米根霉应用于γ-氨基丁酸的生产，其特征在于采用所述米根霉Q1为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养2-3天，至孢子成熟；采用无菌水洗下孢子，将孢子数稀释到107个/mL；以1-5％的体积比将孢子悬浮液转接至发酵培养基，在30℃条件下培养5天。
4.根据权利要求2与3所述的应用，其特征是筛选培养基与产孢子培养基成分一样：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。
5.根据权利要求3所述的应用，其发酵培养基成分为：糯米30g，谷氨酸0-0.6g，水5-30g，自然pH，121℃下灭菌20分钟。
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