CN103571779A - 一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基、菌株及生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基、菌株及生产方法，该培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖5～15%，蛋白胨0.5～1%，磷酸二氢钾1～6%，磷酸氢二钾1～6%，硫酸镁0.3～0.6%，尿素1～6%，嘌呤碱0.3～0.6%；该菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)A.sp01，保藏号：CCTCC NO：M 2013431，保藏日期：2013年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明具有操作简单，原料成本低廉，安全环保，可工业化生产的优点。实验证明，本发明的生产方法得到的环磷腺苷含量至少在7.8g/L以上，最高可达9.16g/L，为微生物发酵生产环磷腺苷开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，同时还涉及利用该培养基生产环磷腺苷的菌株及生产方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
环磷腺苷即腺嘌呤核苷-3′,5′-环磷酸酯，简称cAMP，它是一种人体内广泛存在的、具有重要生理活性的物质，在人体中环磷腺苷可由三环磷腺苷经腺苷活化酶催化生成。作为参与调节细胞功能的第二信使物质，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢的作用，对糖、脂肪代谢、核酸蛋白质的合成、调节等起着重要作用。
环磷腺苷为蛋白酶致活剂，系核苷酸的衍生物，也是重要的医药中间体，是一种效果明显、毒副作用较小的非强心苷类药物。环磷腺苷能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌的收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病的症状及改善心电图，因此在临床上，主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死。此外，环磷腺苷在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病、糖尿病、牛皮癣及干扰诱导等方面具有独特的疗效，可用于药物制剂（注射用环磷腺苷、环磷腺苷注射液、环磷腺苷输液）、药物中间体（制备二丁酰环磷腺苷）、保健食品、化妆品和生化试剂，市场前景非常广阔。
上世纪五、六十年代起，陆续有关于环磷腺苷合成工艺方法的文献报道，随后逐渐发展成主要包括碱性水解法、活性酯类法、DCC脱水法和三氯氧磷法等四种生产环磷腺苷的工艺方法。目前使用的合成工艺方法均为化学合成方法，存在工艺复杂，原料昂贵且不易获得，副产物多，收率低，成本高，产量小，会导致污染环境，以及不利于工业化生产等缺点。目前，还未有采用生物转化的方法生产环磷腺苷的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，该培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖5～15%，蛋白胨0.5～1%，磷酸二氢钾1～6%，磷酸氢二钾1～6%，硫酸镁0.3～0.6%，尿素1～6%，嘌呤碱0.3～0.6%；pH自然。
本发明的目的还在于提供一种发酵生产环磷腺苷的菌株。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种发酵生产环磷腺苷的菌株，该菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)A.sp01，保藏号：CCTCC NO：M2013431，保藏日期：2013年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明的目的还在于提供一种发酵生产环磷腺苷的方法。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种发酵生产环磷腺苷的方法，包括以下步骤：
1）将菌株接种于制备好的斜面培养基，30-36℃恒温培养36-48h，直至有大量菌落长出；
2）挑取菌落，接种于种子培养基，在28-37℃、160rpm条件下振荡培养1-3天；
3）将步骤2）的种子液按5-15%的接种量，接种到发酵培养基中发酵培养，在28-36℃，溶氧60-65%的条件下，发酵培养60-70h即得。
所述斜面培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖1～5%，牛肉膏1～5%，蛋白胨1～5%，氯化钠0.3～0.5%，琼脂2～4%；pH7.2～7.5。
所述种子培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖1～5%，牛肉膏1～5%，蛋白胨1～5%，氯化钠0.3～0.5%；pH7.2～7.5。
本发明克服了传统化学合成环磷腺苷工艺复杂，原料昂贵且不易获得，副产物多，收率低成本高，产量小，污染环境，不利于工业化生产的缺陷，具有操作简单，原料成本低廉，安全环保，可工业化生产的优点。实验证明，采用本发明的生产方法得到的环磷腺苷含量至少在7.8g/L以上，最高可达9.16g/L，为微生物发酵生产环磷腺苷开辟了新的途径。
具体实施方式
本发明所用的培养基具体如下：
斜面培养基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，琼脂2%，pH7.2。
种子培养基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，pH7.2。
富集培养基：次黄嘌呤10g，酵母膏2.2g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.01g，三氯化钴0.005g，水1000mL；pH7.0。
实施例1
本实施例为发酵生产环磷腺苷的菌株的筛选方法，包括以下步骤：
将从有机质含量丰富的某处土壤处采集的土壤样品接种于以次黄嘌呤为底物的富集培养基中进行富集、分离培养。以菌落外观形态为主，配合镜检观察菌体形态，获得节杆菌株若干，多次纯化后分别接入斜面，置于冰箱4℃保存备用。选取纯化后的5个菌株分别命名为A.sp01、A.sp02、A.sp03、A.sp04、A.sp5。
将A.sp01、A.sp02、A.sp03、A.sp04、A.sp5菌株分别接种于100mL微生物富集培养基中于42℃进行振荡培养，每天测定次黄嘌呤转化情况，待次黄嘌呤完全转化后，记录转化时间，其中A.sp01转化时间最快，活性最高。取A.sp01菌株培养液上清10mL，接种于小型恒化培养器中，温度控制为42℃。用蠕动泵连续加入新鲜富集培养基进行恒化培养。开始时每天加样量为50mL，并测定恒化器中次黄嘌呤浓度，当次黄嘌呤浓度趋近于0时，逐步加大流量至每天200mL左右。在此条件下继续培养3d取样进行划线培养。观察菌株A.sp01的菌落形态、细胞形态，以及生理生化培养特性，结果如表1所示。
表1形态观察及生理生化特性测试结果
16S rDNA片段扩增及测序：
提取菌株A.sp01基因组，采用通用引物27F/1492R进行16S rDNA片段扩增及测序，其中
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3'（SEQ ID NO:1）
1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'（SEQ ID NO:2）
16S rDNA扩增片段测序结果：
acatgcagtc gaacgatgaa gcccagcttg ctgggtggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgagt aacctgcccc
cgactctggg ataagcccgg gaaactgggt ctaataccgg atatgacctc gcaccgcatg gtgcggggtg gaaagattta
tcggtggggg atggactcgc ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg
agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg
gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaggg aagaagcgaa
agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttatccg
gatttattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg tctgccgtga aagtccgagg ctcaacctcg gatctgcggt
gggtacgggc agactagagt gatgtagggg agactggaat ttctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac
accgatggcg aaggcaggtc tctgggcatt tactgacgct gaggagcgaa agcatgggga gcgaacagga ttagataccc
tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg gacatttcca cgttttccgc gccgtagcta acgcattaag
tgccccgccc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgc
ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatgtgcc agaccgcctc agagatgggg tttcccttcg
gggctggttc acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc
ctcgttccat gttgccagca cgtagtggtg gggactcatg ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac
gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaat gggttgcgat actgtgaggt
ggagctaatc cctaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc
gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcaagt cacgaaagtt ggtaacaccc
gaagccgatg gcctaaccac cttgtgtggg gggagtcgtc gaag
测序结果在GenBank数据库中进行同源性序列比对分析，结果显示A.sp01菌株与节杆菌（Arthrobacter sp.）相关基因片段在序列上具有100%相似值。结合形态观察、生理生化特性以及分子鉴定，鉴定A.sp01为节杆菌（Arthrobacter sp.）
实施例2
本实施例发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，包括以下质量分数的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1%，磷酸氢二钾1%，硫酸镁0.3%，尿素1%，嘌呤碱0.3%；pH自然。
本实施例的发酵生产环磷腺苷的方法，包括以下步骤：
1）将A.sp01菌株接种于制备好的斜面培养基，30℃恒温培养48h，直至有大量菌落长出；
2）挑取菌落，接种于种子培养基28℃、160rpm条件下振荡培养3天；
3）将步骤2）的种子液按5%的接种量，接种到发酵培养基中发酵培养，在28℃，溶氧60%的条件下，发酵培养60h即得。
实施例3
本实施例发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，包括以下质量分数的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1%，磷酸氢二钾1%，硫酸镁0.3%，尿素1%，嘌呤碱0.3%；pH自然。
本实施例的发酵生产环磷腺苷的方法，包括以下步骤：
1）将A.sp01菌株接种于制备好的斜面培养基，33℃恒温培养42h，直至有大量菌落长出；
2）挑取菌落，接种于种子培养基37℃、160rpm条件下振荡培养1天；
3）将步骤2）的种子液按5%的接种量，接种到发酵培养基中发酵培养，在32℃，溶氧62%的条件下，发酵培养65h即得。
实施例4
本实施例发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，包括以下质量分数的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1%，磷酸氢二钾1%，硫酸镁0.3%，尿素1%，嘌呤碱0.3%；pH自然。
本实施例的发酵生产环磷腺苷的方法，包括以下步骤：
1）将A.sp01菌株接种于制备好的斜面培养基，36℃恒温培养36h，直至有大量菌落长出；
2）挑取菌落，接种于种子培养基32℃、160rpm条件下振荡培养2天；
3）将步骤2）的种子液按5%的接种量，接种到发酵培养基中发酵培养，在36℃，溶氧65%的条件下，发酵培养70h即得。
实施例5-10
实施例5-10发酵生产环磷腺苷的发酵培养基配方如表2：
表2实施例5-10的发酵生产环磷腺苷的发酵培养基配方（单位：%）
| 葡萄糖 | 5 | 6 | 8 | 10 | 12 | 15 |
| 蛋白胨 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 |
| 磷酸二氢钾 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 磷酸氢二钾 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 硫酸镁 | 0.3 | 0.35 | 0.4 | 0.45 | 0.5 | 0.6 |
| 尿素 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 嘌呤碱 | 0.3 | 0.35 | 0.4 | 0.45 | 0.5 | 0.6 |
| pH | 自然 | 自然 | 自然 | 自然 | 自然 | 自然 |
实施例5-10发酵生产环磷腺苷的方法同实施例2-4，不同之处在于步骤3）中的发酵条件，具体如表3。
表3实施例5-10发酵生产环磷腺苷方法的发酵条件
| 接种量（%） | 发酵温度（℃） | 溶氧（%） | 发酵时间（h） | |
| 实施例5 | 10 | 28 | 65 | 65 |
| 实施例6 | 10 | 32 | 60 | 70 |
| 实施例7 | 10 | 36 | 62 | 60 |
| 实施例8 | 15 | 28 | 62 | 70 |
| 实施例9 | 15 | 32 | 65 | 60 |
| 实施例10 | 15 | 36 | 60 | 65 |
实验例
本发明发酵生产的环磷腺苷含量测定：按照《中华人民共和国药典》2010版二部中环磷腺苷检测方法进行含量检测，结果如表4。
表4实施例2-10的环磷腺苷含量测定结果
Claims (5)
1.一种发酵生产环磷腺苷的发酵培养基，其特征在于，该培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖5～15%，蛋白胨0.5～1%，磷酸二氢钾1～6%，磷酸氢二钾1～6%，硫酸镁0.3～0.6%，尿素1～6%，嘌呤碱0.3～0.6%。
2.一种利用权利要求1所述的发酵培养基发酵生产环磷腺苷的菌株，其特征在于，该菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)A.sp01，保藏号：CCTCC NO：M2013431，保藏日期：2013年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
3.一种利用权利要求1所述的发酵培养基发酵生产环磷腺苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将菌株接种于制备好的斜面培养基，30-36℃恒温培养36-48h，直至有大量菌落长出；
2）挑取菌落，接种于种子培养基，在28-37℃、160rpm条件下振荡培养1-3天；
3）将步骤2）的种子液按5-15%的接种量，接种到发酵培养基中发酵培养，在28-36℃，溶氧60-65%的条件下，发酵培养60-70h即得。
4.根据权利要求3所述的发酵生产环磷腺苷的方法，其特征在于，所述斜面培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖1～5%，牛肉膏1～5%，蛋白胨1～5%，氯化钠0.3～0.5%，琼脂2～4%；pH7.2～7.5。
5.根据权利要求3所述的发酵生产环磷腺苷的方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下质量分数的组分：葡萄糖1～5%，牛肉膏1～5%，蛋白胨1～5%，氯化钠0.3～0.5%；pH7.2～7.5。
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