CN101942406B

CN101942406B - 海洋拟诺卡氏菌株HY-G及其产生的β-葡萄糖苷酶

Info

Publication number: CN101942406B
Application number: CN2010102512595A
Authority: CN
Inventors: 吴少杰; 马桂珍; 王淑军; 陈丽; 焦豫良; 王淑芳; 暴增海
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2030-08-12
Also published as: CN101942406A

Abstract

本发明是一种海洋拟诺卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)CCTCCNO：M 2010126。本发明还公开了海洋拟诺卡氏菌株HY-G CCTCC NO：M2010126产β-葡萄糖苷酶的方法及产品；所产的β-葡萄糖苷酶属于胞内酶，其分子量为43～45kDa；该酶在以p-NPG为底物时，测得在pH 6.0-9.0有酶活力，其中在pH 7.0-8.0时酶活力强；该酶在40-60℃下具有有酶活性；Fe²⁺、Mg²⁺、pb²⁺、Na⁺、Fe³⁺对该酶活性有促进作用，其中Fe²⁺、Fe³⁺促进作用强，Ca²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、K⁺对该酶活性有抑制作用，其中Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺抑制作用强。

Description

海洋拟诺卡氏菌株HY-G及其产生的β-葡萄糖苷酶

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是一种海洋拟诺卡氏菌菌株HY-G，本发明还涉及该菌株的产酶方法及其所产生的β-葡萄糖苷酶。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，是一类能够水解结合于末端非还原性的β-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基的水解酶类。

β-葡萄糖苷酶广泛地存在于自然界许多动植物和微生物体内。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250KDa之间。目前绝大多数生物所产生的β-葡萄糖苷酶最适pH都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5-5.5之间，仅有少数β-葡萄糖苷酶最适pH在中性或碱性范围内。β-葡萄糖苷酶的最适温度在40～110℃之间都有分布。

β-葡萄糖苷酶具有多方面的用途。在生物医药领域，由于天然药物中含有种类众多的苷类成分，其中有很大一部分都属于β-葡萄糖苷类。研究发现，天然药物活性成分去除β-葡萄糖基后，往往能提高药效，因此，采用β-葡萄糖苷酶进行天然药物活性成分的生物转化受到重视，该方法具有反应条件温和、特异性高、污染少等优点。在食品工业，β-葡萄糖苷酶作为一种风味酶，可用于果汁风味成分的改善、果酒和茶叶等饮料的增香等；此外，β-葡萄糖苷酶还在纤维素的水解、医学诊断、植物病害防治等方面有着重要的价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产β-葡萄糖苷酶的海洋拟诺卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述海洋拟诺卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)产β-葡萄糖苷酶的方法及产品。

本发明所涉及的菌株是海洋拟诺卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)，该海洋拟诺卡氏菌HY-G已于2010年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2010126；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，电话：027-68754052。

以下对本发明进行详细的阐述。

一、本发明所涉及的培养基。

1、固体培养基(固体海水高氏一号培养基)，其组成如下：20g可溶性淀粉；1g KNO₃；0.5g K₂HPO₄；0.5g MgSO₄·7H₂O；0.01g FeSO₄·7H₂O；1000mL海水。其制法是：将上述成分用海水溶解后，再用NaOH调节初始pH至7.6-7.8，然后加入15g琼脂，121℃灭菌15-20min，即得固体培养基。用于初次平板涂布分离时，还需在调节pH值之前加入0.03％的重铬酸钾以抑制样品中真菌和细菌的生长。

2、液体发酵培养基(液体海水高氏一号培养基)，其组成如下：20g可溶性淀粉；1g KNO₃；0.5g K₂HPO₄；0.5g MgSO₄·7H₂O；0.01g FeSO₄·7H₂O；1000mL海水。其制法是：将上述成分用海水溶解后得混合物，然后按大豆异黄酮苷∶混合物＝150～200mg/L的比例向混合物中加入大豆异黄酮苷作为产酶诱导物(以诱导其产β-葡萄糖苷酶)，再用NaOH调节初始pH至7.6-7.8， 121℃灭菌15-20min，即得液体发酵培养基。本发明所述的产酶诱导物大豆异黄酮苷为由染料木苷、大豆苷和黄豆黄苷组成的混合物，该混合物中，含大豆苷46.80％(重量百分比)、染料木苷12.98％、黄豆黄苷23.73％，其中的黄豆黄苷对本发明的菌株HY-G的产酶无诱导作用。也可以采用市售的其它比例的大豆异黄酮苷，优选其中含大豆苷40-50％，染料木苷10-15％，其余为黄豆黄苷。

二、本发明海洋拟诺卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)(以下简称菌株HY-G)的分离。

1、样品的采集与处理。

海洋潮间带沉积物样品采自河北省乐亭县滦河入海口，用冰盒冷却带回实验室后，立即进行微生物分离。分离时，称取1g泥样加入到装有99mL无菌海水的锥形瓶中，震荡30min，使泥样与无菌海水充分混合，即成10^-2倍稀释度泥样稀释液，再对其做10^-3、10^-4、10^-5倍的梯度稀释。

2、菌株的分离。

用无菌移液器吸取0.2mL各个稀释度的稀释液，加至含有固体培养基的平板上，然后用无菌玻璃涂棒将稀释均匀涂布在整个平板上。将各稀释度平板于28℃的培养箱中培养10天左右。

待平板上长出放线菌菌落后，挑取单菌落的菌体、气生菌丝或孢子，进行平板划线法分离，然后将平板倒置于28℃恒温箱中培养。通过反复的划线分离，通过培养形态和光学显微镜镜检观察，各菌落形态一致，即纯化得到单一菌株。

采用上述方法，分离得到包括菌株HY-G在内的数十种海洋放线菌菌株。

三、菌株HY-G的16S rRNA基因分子生物学鉴定

用上海赛百盛

细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，-20℃保存备用。PCR引物为通用引物，序列为：

F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；

R1492(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)；

PCR反应体系(50μl)：Tag酶0.25μl；Buffer(Mg²⁺free)5μl；Mg²⁺溶液3μl；dNTP 4μl；模板DNA 1μl；引物F27和引物R1492各1μl。PCR反应条件：94℃预变性2min，然后94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸45s(循环33次)，最后72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，然后用江苏碧云天

凝胶回收试剂盒回收。将纯化后的PCR产物送到上海生工生物工程有限公司测序。

测序结果通过与GenBank上的序列进行比对分析，发现与拟诺卡氏菌Nocardiopsis tangguensis等菌株相似度较高，选择相似度＞98％的8株拟诺卡氏菌，并以Macrococcus bovicus、Sporosarcina ureae等菌株为外群，构建系统进化树，如图1所示。由图1中可以看出，菌株HY-G与拟诺卡氏菌聚集在一起，表明属于拟诺卡氏菌属；其中与Nocardiopsis tangguensis、Nocardiopsis aegyptia聚成一簇，说明与这些菌株亲缘关系较近。

四、菌株HY-G所产生的β-葡萄糖苷酶。

1、酶的产生方法与酶活力测定

1.1发酵：采用摇瓶发酵法，在250mL三角瓶中加入100mL液体发酵培养基，按照接种量为1％的比例接种海洋拟诺卡氏菌株HY-G的孢子悬液，孢子悬液的浓度为10⁶/mL；然后在23～38℃的培养温度下、在60～120转 /分钟的摇床转速下培养72h，得发酵液；

1.2粗酶液的制备：取上述发酵液在8000转/分钟下离心10分钟，收获菌体；菌体用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗涤2次并离心后，加入适量的上述Tris-HCl缓冲溶液重新悬浮菌体，在0℃冰浴的条件下，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，得菌体破碎液；取菌体破碎液在12000转/分钟下离心20分钟除去菌体碎片，所得上清液即为粗酶液。

1.3酶活力测定(以糖苷型大豆异黄酮为底物)：用0.01mol/L、pH 6.8Tris-HCl缓冲溶液将大豆异黄酮苷配成浓度为10mg/mL的底物溶液(由于大豆异黄酮苷的溶解性较小，可加适量乙醇助溶)。取粗酶液和底物溶液按照1∶1的比例混合，40℃下反应2h后，加2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，取萃取物20μL作薄层层析(TLC)。展开剂为氯仿∶甲醇(10∶7)，展开约6cm，挥干溶剂，用双波长薄层扫描仪扫描，根据斑点面积的积分值计算酶活力。薄层扫描测定方法：采用反射单波长锯齿扫描法，测定波长为260nm，光斑大小为0.07×0.07mm。所得到的测定数据通过仪器自带的CS-9301PC软件进行底线校正、峰面积计算等处理，得出大豆异黄酮苷元的峰面积值。

本发明所述的粗酶液可以采用以下方法进行分离纯化：

(1)取粗酶液，加入硫酸铵至40％饱和度，离心去除沉淀得上清液；用1.7mol/L硫酸铵溶于0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液中制成平衡缓冲溶液，然后用平衡缓冲溶液平衡Phenyl-Sepharose柱，再用平衡过的Phenyl-Sepharose柱吸附上清液中的蛋白，用含0.34mol/L硫酸铵的0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱去除杂蛋白，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱得到初步纯化的β-葡萄糖苷酶液；

(2)用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sephrose柱，然后取初步纯化的β-葡萄糖苷酶液用DEAE-Sephrose柱吸附，通过梯度洗脱得到纯化的β-葡萄糖苷酶。

以上所得到的纯化的β-葡萄糖苷酶还可以采用以下方法进一步纯化：先用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex 200凝胶色谱柱；然后对纯化的β-葡萄糖苷酶进行透析处理后用Superdex 200HR凝胶色谱柱吸附，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，收集A₂₈₀最大吸收峰并检测活性，活性组分即为进一步纯化的β-葡萄糖苷酶。

2产酶条件

2.1培养基对产酶的影响

2.1.1培养基中碳源对产酶的影响

以不含可溶性淀粉的海水高氏一号液体发酵培养基为基础，分别加入1％的10°麦芽汁、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦麸作为碳源，氮源为0.1％的硝酸钾，按照1.2的发酵方法进行培养48h后测定其酶活力。结果如下表所示。

不同碳源对大豆异黄酮苷水解酶产酶的影响

2.1.2培养基中氮源对产酶的影响

以不含硝酸钾的液体发酵培养基为基础，以可溶性淀粉为碳源，分别添加0.1％的NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、蛋白胨、酵母膏和牛肉膏为氮源，按照1.1的发酵方法进行培养48h后测定其酶活力。结果表明：无机氮源中以硫酸铵的酶活力高；有机氮源中以蛋白胨产酶活力高。

不同氮源对大豆异黄酮苷水解酶产酶的影响

2.1.3培养基中最佳碳源和最佳氮源的作用浓度

为了解最佳碳源和氮源最适添加量，根据上述结果确定的最佳碳源和氮源，在不含氮源和碳源的液体培养基中分别添加不同浓度的蔗糖(0.1～10％)和硫酸铵(0.01～1％)，然后按照1.2的发酵方法培养48h后，测定其酶活力。结果如图2-3所示。由图2-3中可以看出，碳源的添加量以1％左右较为合适，低于1％，则由于菌体生长所需的营养不足而导致产酶能力迅速下降，高于1％则产酶有下降的趋势，可能是由于培养基中糖类营养成分充足，菌株通过分泌水解酶获取额外的葡萄糖的压力不大。对于最佳氮源的添加量，在实验所选的氮源浓度范围内，总体酶活力维持在较高的水平，其中以0.03％最好，低于0.03％时，由于氮源的不足，对产酶有较大影响；高于0.03％也会使产酶下降，但仍保持一定的产酶量。

2.2培养条件对产酶的影响

2.2.1培养条件中诱导物浓度对产酶的影响

在液体发酵培养基中，分别添加10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、350mg/L和500mg/L的大豆异黄酮苷作为产酶诱导物，考察诱导物对产酶的影响。结果如图4所示。可以看出，当大豆异黄酮苷的添加量＜150mg/L时，产酶受到较大影响，表明该菌株产生的大豆异黄酮苷水解酶属于诱导酶，需要有外界底物存在才能够诱导合成。另外，由于大豆异黄酮苷难溶于水，因此其添加量以150～200mg/L为宜，过多添加对诱导产酶作用不大。

2.2.2培养条件中温度对产酶的影响

按照上述筛选出的最佳产酶条件，将培养基分别置于18℃、23℃、28℃、33℃、38℃、45℃和50℃下160r/min摇床中培养72h，然后测其酶活力。结果表明，温度在23～38℃范围内酶的产生量比较稳定，产酶量也达到最大；低于23℃或超过45℃则微生物生长受到抑制而影响产酶。虽然在该菌株在23～38℃范围内培养72h后产酶量变化不大，但是实验发现，在此温度范围内，温度越高，微生物生长越快，例如在38℃下培养48h即可达到最大酶活力，而在28℃下培养，则需要72h。见图5。

2.2.3培养条件中摇瓶转数对产酶的影响

在上述最佳条件的基础上，将液体发酵培养基分别置于0、60、120、180和200r/min的摇床中培养，考察摇瓶转数对产酶的影响，实验结果见图6。结果显示在60～120r/min下，菌体产酶量较高；转数高于120r/min，由于剪切力的影响，不利于产酶。

2.2.4培养条件中培养时间对产酶的影响

于28℃、120r/min摇床中分别培养36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h，然后测其酶活力，实验结果见图7。当发酵培养至72h后，产酶达到高峰，继续培养，可能由于菌丝体自溶释放出蛋白酶，使得酶活力降低。

2.2.5培养条件中起始pH对产酶的影响

在上述最佳培养条件下，考察液体发酵培养基起始pH对产酶的影响，结果见图8。结果表明，起始pH为6～7时，其酶活力最大。PH低于6.0则生长和产酶能力急剧下降；PH高于8.0时，其生长和产酶呈下降趋势，但比较缓慢。

3菌株HY-G产生的β-葡萄糖苷酶的纯化

3.1酶活力的测定

3.1.1以大豆异黄酮苷为底物，见本节1.3。

3.1.2以对硝基酚基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)为底物：粗酶液和5mmol/L的p-NPG溶液各50μl，混合，置40℃水浴保温10min后，加入1mol/LNaOH100μl终止反应，立即用Bio-rad酶标仪测定A₄₀₀。

3.2粗酶液的制备

见本节1.2。

3.3硫酸铵梯度沉淀

0℃下，加入硫酸铵粉末，分别至饱和度40％、60％、80％和100％，静置1h后12000r/min离心20min，分别收集沉淀，用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液溶解沉淀，4℃下透析24h后，按3.1.2的方法测定不同饱和度下的酶活力。结果如下：

硫酸铵饱和度对酶盐析沉淀的影响

由表中可见，在40％的硫酸铵饱和度下，酶蛋白保留在溶液中，没有被沉淀下来，而到了60％的饱和度，则开始沉淀出来。因此，为了下一步采用疏水柱进行纯化，将硫酸铵盐析的饱和度选为40％(大约相当于1.7mol/L的硫酸铵浓度)。

3.4Phenyl-Sepharose疏水层析

先用Bio-rad快速蛋白纯化系统确定蛋白质纯化条件：用1.7mol/L的硫酸铵溶液平衡Phenyl-Sepharose疏水层析柱后，上样。采用梯度洗脱，其中A泵为1.7mol/L的硫酸铵溶液，B泵为0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)，流动相流速1mL/s。洗脱方式为：1.7mol/L的硫酸铵溶液40mL、梯度(A泵0％～100％)洗脱70mL、0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH6.8)75mL，最后用1.7mol/L的硫酸铵溶液重新平衡层析柱。收集A₂₈₀下的各峰并检测酶活性。

通过分析洗脱曲线，得知菌株HY-G产生的β-葡萄糖苷酶能够较强烈地吸附在Phenyl-Sepharose疏水层析上，只有用很低的盐离子强度(0.01mol/LTris-HCl缓冲溶液)才能将其洗脱下来。故今后大规模纯化时，这一步可简化为：硫酸铵沉淀至40％饱和度后的上清液直接通过预先用1.7mol/L硫酸铵平衡过的Phenyl-Sepharose柱吸附，用含0.34mol/L硫酸铵的0.01mol/L、pH 6.8Tris-HCl缓冲溶液洗去杂蛋白，然后用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱得到β-葡萄糖苷酶。上述简化步骤经过实验证实，结果理想。

由于该酶在Phenyl-Sepharose柱上的洗脱体系盐离子强度很低，可以不经任何透析处理，直接用作DEAE-Sepharose阴离子交换层析分离。

3.5DEAE-Sepharose阴离子交换层析

先用Bio-rad快速蛋白纯化系统确定蛋白质纯化条件：用0.01mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)平衡柱子后，将Phenyl-Sepharose疏水层析柱上收集的活性组分上样。采用梯度洗脱，其中A泵为0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH6.8)，B泵为1mol/L NaCl溶液，流动相流速1ml/s。洗脱方法为：50ml 0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH6.8)、梯度(A泵0％～100％)130ml、1M NaCl溶液20ml，最后用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)重新平衡层析柱。收集A₂₈₀下的各峰并检测酶活性。

通过分析洗脱曲线，确定了酶在DEAE-Sepharose柱上的洗脱条件。为了今后大规模纯化的方便，该步骤可简化如下：样品加入预先用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)平衡过的DEAE-Sepharose柱，用含0.3mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(0.01mol/L，pH 6.8)洗去杂质，然后用含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(0.01mol/L，pH 6.8)洗脱得到β-葡萄糖苷酶。上述简化步骤经过试验，也取得了较好的结果。

3.6Superdex 200(HR 10/300mm)凝胶色谱

用0.01mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)平衡柱子，将DEAE-Sepharose阴离子交换层析的活性组分经透析后，上样，用0.01mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 6.8)洗脱，收集A₂₈₀最大吸收峰并检测活性。用已知分子量的蛋白(含Thyroglobulin，MW 669.0kD、Ferritin，MW 440.0kD、BSA，MW 67.0kD、β-Lactoglobulin，MW 35.0kD、Ribonuclease A，MW 13.7kD、Cytochrome C，MW 13.6kD、Aprotinin，MW 6.5kD)作为标准蛋白，估计β-葡萄糖苷酶的分子量。

菌株HY-G产生的β-葡萄糖苷酶在Superdex 200HR 10/300mm凝胶色谱柱上的洗脱体积为15.1mL，由此得到估计分子量为45.0kDa。

4菌株HY-G产生的β-葡萄糖苷酶的性质

在本节中，所用的β-葡萄糖苷酶均是指经过进一步纯化的β-葡萄糖苷酶。

4.1酶活力测定方法

4.1.1以大豆异黄酮苷为底物，见本节1.3

4.1.2以p-NPG为底物，见本节3.1.2。

4.2分子量测定

4.2.1凝胶色谱法，见本节3.6。

4.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：分离胶(水1.6mL，1.5mol/L、pH 8.8的Tris-HCl缓冲溶液1.3mL，10％的SDS溶液0.05mL，30％的丙烯酰胺溶液2mL，TEMED 0.002mL，10％的APS溶液0.05mL)、浓缩胶(水3.4mL，pH 6.8、0.5mol/L的Tris-HCl缓冲溶液0.63mL，10％的SDS溶液0.05mL，30％的丙烯酰胺溶液0.83mL，TEMED 0.005mL，10％的APS溶液0.05mL)。在Tris-甘氨酸电泳缓冲溶液中，80-100V电泳一定时间。电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染色1h，用醋酸-甲醇脱色液脱色过夜。

各纯化步骤对酶的纯化效果及酶的分子量测定电泳图见图9-10所示。由电泳图可见，经过硫酸铵盐析和柱层析分离，获得了电泳单一条带的β-葡萄糖苷酶。其估计分子量为43.3kDa。这一分子量与Superdex 200HR 10/300凝胶柱分析结果(45.0kDa)相似，因此提示该蛋白质可能是以单体的形式存在，不含亚基。

4.3最适反应pH

将β-葡萄糖苷酶冻干后，称取一定量冻干的酶，用不同pH 4.0～11.0的缓冲溶液溶解，分别测定酶活力，结果如图11所示。可见，不论是以大豆异黄酮苷(大豆苷、染料木苷)还是以p-NPG为底物，其最适pH都为7.0～8.0。

本发明从海洋拟诺卡氏菌株HY-G中分离到的β-葡萄糖苷酶，最适作用pH偏碱性，因此可能是一种新型的β-葡萄糖苷酶。

4.4最适反应温度

取pH 7.0的酶液，分别在20～70℃下测定残余酶活力，结果如图12所示。可见，其最适温度为40℃左右。

4.5pH稳定性和温度稳定性

将不同pH值(pH 4.0～11.0)的β-葡萄糖苷酶酶液在4℃冰箱中保存24h后，分别测定残余酶活力。取pH 7.0的酶液，分别在30～80℃下保温30min后，测定残余酶活力。结果如图13所示。可见，该酶在pH 6.0～7.0时最稳定；该酶在70℃下30min仍保存较高的酶活力，说明该酶具有较好的耐热性。

4.6金属离子对酶活力的影响

采用含有浓度为1mmol/L不同金属离子的缓冲溶液(pH 7.0)，然后按照3.1.2的方法测定酶活力。以不加金属离子的酶反应体系为空白对照(相对酶活力为100％)，确定各金属离子对酶活性的抑制或激活作用，结果见下表。

金属离子对酶活力的影响

由表中可见，Fe²⁺、Mg²⁺、pb²⁺、Na⁺、Fe³⁺对该酶活性有促进作用，其中Fe²⁺、Fe³⁺促进作用较大；Ca²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、K⁺对该酶活性有抑制作用，其中Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺抑制作用较大。

三、β-葡萄糖苷酶的应用

1用于转化大豆异黄酮苷

大豆异黄酮(Soybeans Isoflavones，SI)是大豆的主要功能性活性成分之一，能够用于治疗和缓解由于人类雌性激素分泌异常而导致的多种疾病。通常，95-99％的大豆异黄酮都是以苷的形式存在，苷元的含量很少。大豆异黄酮存在的形式对其生物活性和生物利用度有着显著的影响。研究表明，苷元形式的大豆异黄酮比大豆异黄酮苷具有更好的吸收速度，将大豆异黄酮苷转化成苷元能显著提高其吸收效率和生物利用度；体外试验也表明，大豆异黄酮苷元比大豆异黄酮苷具有更好的雌激素样生物活性。因此，通过生物法转化大豆异黄酮苷为大豆异黄酮苷元(如大豆苷元、染料木素，等)具有重要的应用价值。

采用海洋拟诺卡氏菌菌株HY-G及其所产生的β-葡萄糖苷酶能够有效地将大豆异黄酮苷转化为苷元，转化方式可采用发酵法或酶水解法。当采用发酵法时，首先配制含有大豆异黄酮苷的培养基，然后接种海洋拟诺卡氏菌菌株HY-G进行发酵，发酵温度在25-45℃，培养基起始pH值为pH 6.0-8.0，发酵48-96h。当采用酶水解法时，首先将菌株HY-G在最适条件下诱导产生β- 葡萄糖苷酶，然后利用粗酶液或进一步纯化获得纯的β-葡萄糖苷酶进行酶水解反应，水解pH值控制在pH 6.0-9.0，优选为pH 7.0；水解温度范围为30-60℃，优选为40℃。通过薄层层析(Thin Layer Chromatography，TLC)可检测水解产物(如图14所示。可见，经过酶的转化，大豆异黄酮苷被转化为二种苷元)。水解产物可用乙醚萃取，或经聚酰胺树脂吸附后用30％的乙醇溶液洗脱。

2其它应用

海洋拟诺卡氏菌菌株HY-G及其所产生的β-葡萄糖苷酶还可广泛用于其它天然或人工合成的苷类化合物的生物转化。进行这些生物转化的意义在于：1)在食品工业领域，由于许多呈香、呈味前体物质都是苷类，因此通过β-葡萄糖苷酶的作用，能将这些前体物质转化为呈香、呈味物质而增加食物的感官品质，因此β-葡萄糖苷酶是一种“风味酶”。2)在医药领域，大多数天然药物中都含有苷类成分，这些苷类往往需要经过酶的作用部分或完全去除糖基后，才能发挥生理作用。采用β-葡萄糖苷酶等酶进行苷类成分的生物转化，条件温和、副反应少，有着重要实用价值。3)β-葡萄糖苷酶是纤维素降解酶系中的一个限速酶，添加外源的β-葡萄糖苷酶，能够大大提高纤维素降解的效率。将β-葡萄糖苷酶用于饲料加工中，也能够提高饲料中纤维素的利用率。4)某些疾病(如“戈谢病”)与β-葡萄糖苷酶活力缺失有关，而通过基因工程重组技术生产的β-葡萄糖苷酶，已经用于治疗这些疾病。

附图说明

图1为本发明海洋放线菌株HY-G的系统进化分析图。

图2为碳源添加量对大豆异黄酮水解酶产酶的影响图。

图3为氮源添加量对大豆异黄酮水解酶产酶的影响图。

图4为诱导物浓度对产酶的影响图。

图5为温度对产酶的影响图。

图6为转速对产酶的影响图。

图7为培养时间对产酶的影响图。

图8为起始pH对产酶的影响图。

其中：图2-图8中，■表示大豆苷元，

表示染料木素。

图9为各纯化步骤对酶的纯化效果电泳图。图中：5经硫酸铵盐析；4经Phenyl-Sepharose纯化；3经DEAE-Sepharose纯化2标准分子量蛋白(Marker)；1经Supder 200纯化。

图10为酶的分子量测定电泳图。

图11为酶对不同底物的最适作用pH图；图中，□以p-NPG为底物■以大豆异黄酮(大豆苷)为底物●以大豆异黄酮(染料木苷)为底物。

图12为酶对不同底物的最适作用pH图；□以p-NPG为底物■以大豆异黄酮(大豆苷)为底物●以大豆异黄酮(染料木苷)为底物。

图13为酶的pH稳定性(■)和温度稳定性

图。

图14为菌株HY-G对大豆异黄酮苷生物转化前后成分的差别图；其中：左：转化前，仅含有大豆异黄酮苷；右：转化后，得到了2种大豆异黄酮苷元(染料木素和大豆苷元)；图中：A为染料木素，B为大豆苷元，C为大豆异黄酮苷。

本发明所涉及的海洋拟诺卡氏菌HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)，已于2010年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2010126。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1。一种海洋拟诺卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)CCTCCNO：M 2010126。所述的海洋拟诺卡氏菌株HY-G CCTCC NO：M 2010126产β-葡萄糖苷酶的方法步骤如下：

(1)发酵：采用摇瓶发酵法，在250mL三角瓶中加入100mL液体发酵培养基，按照接种量为1％的比例接种海洋拟诺卡氏菌株HY-G的孢子悬液，孢子悬液的浓度为10⁶/mL；然后在23～38℃的培养温度下、在60～120转/分钟的摇床转速下培养72h，得发酵液；

(2)粗酶液的制备：取上述发酵液在8000转/分钟下离心10分钟，收获菌体；菌体用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗涤2次并离心后，加入适量的上述Tris-HCl缓冲溶液重新悬浮菌体，在0℃冰浴的条件下，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，得菌体破碎液；取菌体破碎液在12000转/分钟下离心20分钟除去菌体碎片，所得上清液即为粗酶液。

实施例2。实施例1所述的方法中，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：

(1)取粗酶液，加入硫酸铵至40％饱和度，离心去除沉淀得上清液；用1.7mol/L硫酸铵溶于0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液中制成平衡缓冲溶液，然后用平衡缓冲溶液平衡Phenyl-Sepharose柱，再用平衡过的Phenyl-Sepharose柱吸附上清液中的蛋白，用含0.34mol/L硫酸铵的 0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱去除杂蛋白，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱得到初步纯化的β-葡萄糖苷酶液；

实施例3。实施例2所述的方法中，所得到的纯化的β-葡萄糖苷酶采用以下方法进一步纯化：先用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex200凝胶色谱柱；然后对纯化的β-葡萄糖苷酶进行透析处理后用Superdex 200HR凝胶色谱柱吸附，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，收集A₂₈₀最大吸收峰并检测活性，活性组分即为进一步纯化的β-葡萄糖苷酶。

实施例4。实施例3所述的方法中所述的β-葡萄糖苷酶的酶学性质为：所述拟诺卡氏菌HY-G产生的β-葡萄糖苷酶属于胞内酶，其分子量为43～45kDa；该酶在以p-NPG为底物时，测得在pH 6.0-9.0有酶活力，其中在pH 7.0-8.0时酶活力强；该酶在40-60℃下具有有酶活性；Fe²⁺、Mg²⁺、pb²⁺、Na⁺、Fe³⁺对该酶活性有促进作用，其中Fe²⁺、Fe³⁺促进作用强，Ca²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、K⁺对该酶活性有抑制作用，其中Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺抑制作用强。

Claims

1.一种海洋拟诺卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)CCTCC NO：M2010126。

2.一种如权利要求1所述的海洋拟诺卡氏菌株HY-G CCTCC NO：M2010126产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：其步骤如下：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：

(1)取粗酶液，加入硫酸铵至40％饱和度，离心去除沉淀得上清液；将硫酸铵溶于0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液中制成硫酸铵浓度为1.7mol/L的平衡缓冲溶液，然后用平衡缓冲溶液平衡Phenyl-Sepharose柱，再用平衡过的Phenyl-Sepharose柱吸附上清液中的蛋白，用含0.34mol/L硫酸铵的0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱去除杂蛋白，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱得到初步纯化的β-葡萄糖苷酶液；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所得到的纯化的β-葡萄糖苷酶采用以下方法进一步纯化：先用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex 200HR凝胶色谱柱；然后对纯化的β-葡萄糖苷酶进行透析处理后用Superdex 200HR凝胶色谱柱吸附，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，收集A₂₈₀最大吸收峰并检测活性，活性组分即为进一步纯化的β-葡萄糖苷酶。