CN105969694A - 一株合成耐乙醇氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌 - Google Patents

一株合成耐乙醇氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株合成耐乙醇氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌，属于生物工程技术领域。本发明分离得到的菌株经鉴定为普罗威登斯菌，其合成的氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶在高浓度乙醇(20％v/v)及酸性条件下(pH4.5)仍具有高效的酶活力，因此在黄酒等发酵食品中氨基甲酸乙酯及尿素的去除具有巨大的应用潜力，从而实现从源头到终端对氨基甲酸乙酯的控制，具有巨大的经济及社会效益。

Description

一株合成耐乙醇氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌
技术领域
本发明涉及一株合成耐乙醇氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，简称EC)，具有遗传毒性及致癌性，广泛存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等)中。国际癌症研究机构在2007年将氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。
消除发酵食品中的EC主要有两种方法：一是降低或消除发酵液中EC的前体物质(主要是尿素)的含量，这是目前国际上通用的做法。脲酶可以将尿素分解为氨和CO2，可有效减少EC生成，在生产过程中利用酸性脲酶控制成品酒中EC含量是最为常用方法。目前美国、日本等生产的酒用酸性脲酶已实现了商业化。由于尿素并不是唯一的形成EC的前体物质，因此该方法难以彻底根除EC的形成。另一种便是直接降解氨基甲酸乙酯。EC水解酶(Urethanase，简称UH)能够将EC降解为乙醇、氨和二氧化碳，从而能够有效的降解EC。由于EC形成机制多而且比较复杂，同时抑制多种形成EC的机制比较困难，难以彻底根除EC前体物质，从而难以彻底消除EC的形成，并且EC形成后由于其结构非常稳定，难以根除，因此应用生物酶法去除成品中已经形成的EC，是一种较为理想的去除方法。
已有报道公开了一株产酸性脲酶和EC水解酶的普罗威登斯菌，该菌在16％的乙醇中能保持70％的酶活力，其所产EC水解酶及酸性脲酶的乙醇耐受性并不是很出色，因此有必要寻找一株所产EC水解酶或酸性脲酶乙醇耐受性更强的菌株，以便于后序工业化应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株合成耐乙醇酸性氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，其所合成的氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶能够在高浓度乙醇(20％v/v)及酸性条件下(pH 4.5)中仍具有高效EC水解酶活性及脲酶活性，使得其在黄酒中氨基甲酸乙酯及尿素的无害化降解具有巨大的应用价值。
本发明的普罗威登斯菌Providencia sp.LBBE，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015541。
本发明的菌株Providencia sp.LBBE，其合成的氨基甲酸乙酯水解酶能够在高浓度乙醇及酸性条件下高效降解氨基甲酸乙酯。所产的氨基甲酸乙酯水解酶在高浓度乙醇(20％v/v)及酸性条件下(pH 4.5)，37℃保温1h后仍可保持其90％及以上的EC水解酶。
本发明的菌株Providencia sp.LBBE，其合成的脲酶的能够在高浓度乙醇及酸性条件下高效降解尿素；所产的脲酶，在高浓度乙醇(20％v/v)及酸性条件下(pH4.5)，37℃保温1h后仍可保持其100％的脲酶活力。
所述普罗威登斯菌分离于化工厂周边的土壤，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30℃，200rpm培养16h，取500μl培养液移入含有500μl30％的甘油的保藏管中，置于-80℃保藏。
所述的普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，通过PCR扩增获取了16s rDNA序列，序列如SEQ ID NO.1所示，通过16s rDNA序列法进行系统发育树分析并鉴定其种属。
本发明的第二个目的是提供所述普罗威登斯菌的粗酶液的提取方法。
在本发明的一种实施方式中，所述提取方法，是将普罗威登斯菌CCTCC NO:M 2015541在28～35℃下振荡培养18-40h，然后离心取菌体，重悬菌体后进行破碎，离心取上清即得到粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述破碎是在冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min。
在本发明的一种实施方式中，所述提取方法，具体是取普罗威登斯菌CCTCC NO:M2015541单菌落接种于新鲜的营养肉汤培养基中在30℃转速为200r·min-1的摇床上继续培养20h；将菌液4℃ 10000rpm离心5min，弃上清，冲洗菌体并重悬于50mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml；将菌体置于冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min，至菌体溶液变清澈为止；将破碎液于4℃ 12000rpm离心10min，转移上清液于干净的离心管中低温保存。
本发明的第三个目的是提供所述普罗威登斯菌CCTCC NO:M 2015541的应用，是用于降低或去除发酵食品中的氨基甲酸乙酯和/或尿素。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括酒精类饮料、酱油。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为黄酒、白酒、葡萄酒等。
生物材料保藏
一株普罗威登斯菌，分类学命名为Providencia sp.LBBE，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015541。
本发明的有益效果：
本发明分离得到的菌株经鉴定为普罗威登斯菌，其合成的氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶在高浓度乙醇(20％v/v)及酸性条件下(pH 4.5)仍具有高效的酶活力，粗酶液中脲酶酶活力为1.62U/mL、氨基甲酸乙酯水解酶活力为0.3U/ml。因此在黄酒等发酵食品中氨基甲酸乙酯及尿素的去除具有巨大的应用潜力，从而实现从源头到终端对氨基甲酸乙酯的控制。
附图说明
图1：普罗威登斯菌粗酶液在酸性条件下EC水解酶和脲酶酶活测定结果；
图2：普罗威登斯菌合成的氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶乙醇耐受性图谱。
具体实施方式
氯化铵标准曲线的绘制：
用超线水配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+标准溶液。用移液管准确移取1mL NH4+标准梯度液分别置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温30min，立即用吸1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在625nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4+梯度为横坐标作图，得到标准曲线。
氨基甲酸乙酯水解酶或脲酶酶活测定方法：
取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液。然后在两管中分别加入1mL 3％EC(或尿素)底物溶液(用20mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液配制)，在37℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混匀后加入1mL的显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL)和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL)，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。
氨基甲酸乙酯水解酶酶活单位定义：
在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解EC生成1μmol NH4 +所需要的酶量为一个酶活力单位。
脲酶酶活单位定义：
在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解尿素生成2μmol NH4 +所需要的酶量为一个酶活力单位。
实施例1：普罗威登斯菌筛选方法
取5g化工厂周边取样的土壤，溶解于10ml 0.9％的生理盐水中，用玻璃珠打散。取上清液1ml接种于25ml富集培养基中(牛肉浸膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠15g/L，氨基甲酸乙酯10g/L)置于温度30℃，转速200r·min-1的摇床上培养24h。以1％的接种量将上述培养液转接到新鲜的富集培养基中继续培养24h。将富集培养的菌液于逐级稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)涂布于筛选平板(牛肉浸膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠15g/L，氨基甲酸乙酯30g/L，琼脂20g/L)上，30℃培养至长出明显的菌落。挑取菌落形态较大的菌落转移到新鲜的营养肉汤培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L)培养20h后进行保藏。
挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤固体培养基上划线，于30℃培养20h后，取单菌落接种于新鲜的营养肉汤培养基中在30℃转速为200r·min-1的摇床上继续培养20h。将菌液4℃10000rpm离心5min，弃上清，冲洗菌体并重悬于pH4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml。通过超声破碎进行粗酶液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定，获得一株具有氨基甲酸乙酯水解酶活力的菌株。经过16s rDNA序列法进行系统发育树分析并鉴定其为普罗威登斯菌，已于2015年9月15日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015541。
实施例2：粗酶液的制备
挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤固体培养基上划线，于30℃培养20h后，取单菌落接种于新鲜的营养肉汤培养基中在30℃转速为200r·min-1的摇床上继续培养20h。将菌液4℃10000rpm离心5min，弃上清，冲洗菌体并重悬于50mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml。将菌体置于冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min，至菌体溶液变清澈为止。将破碎液于4℃ 12000rpm离心10min,转移上清液于干净的离心管中低温保存。
实施例3：粗酶液氨基甲酸乙酯水解酶和脲酶酶活的测定
实施例2中所获得的粗酶液，按照材料与方法中所述的酶液测定方法，分别检测氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶酶活力。结果如图1所示，脲酶酶活力为1.62U/mL，氨基甲酸乙酯水解酶活力为0.3U/ml。
实施例4：氨基甲酸乙酯水解酶乙醇耐受性及耐酸性研究
将实施例2得到的粗酶液在20mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液(含有乙醇终浓度为20％)中于37℃保温若干小时后分别测定其氨基甲酸乙酯水解酶活力，绘制酶活曲线图如图2所示，以确定该酶在酸性条件下的乙醇耐受性。
结果显示本发明菌株所产的氨基甲酸乙酯水解酶在20％v/v乙醇、pH 4.5、37℃的条件下保温1h后仍可保持90％以上的EC水解酶酶活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株合成耐乙醇酸性氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶的普罗威登斯菌，其特征在于，所述普罗威登斯菌于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015541。
2.根据权利要求1所述的普罗威登斯菌，其特征在于，所述普罗威登斯菌能够耐受20％v/v乙醇和pH 4.5；所述普罗威登斯菌所产的氨基甲酸乙酯水解酶和脲酶在20％v/v乙醇、pH 4.5、37℃的条件下保温1h后能够保持90％以上的酶活。
3.权利要求1所述的普罗威登斯菌在发酵食品方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是用于降低或去除氨基甲酸乙酯和/或尿素。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵食品包括酒精类饮料、酱油。
6.一种生产氨基甲酸乙酯水解酶和/或脲酶的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的普罗威登斯菌作为生产菌株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述方法是将普罗威登斯菌CCTCC NO:M2015541在28～35℃下振荡培养18-40h，然后离心取菌体，重悬菌体后进行破碎，离心取上清即得到粗酶液，粗酶液中含有氨基甲酸乙酯水解酶和/或脲酶。
8.权利要求6-7任一所述方法得到的氨基甲酸乙酯水解酶和/或脲酶。
9.权利要求8所述的氨基甲酸乙酯水解酶和/或脲酶在发酵食品方面的应用。
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