CN102994433A - 一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)SC07，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012415。该产酸克雷伯氏菌SC07能够在酸性环境下快速降解氨基甲酸乙酯和尿素，对发酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了积极的作用，具有很好的应用前景。

Description

一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产酸克雷伯氏菌及其应用，特别是一种能合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)，在医学上有重要用途，曾一度被用作治疗多发性骨髓瘤及慢性骨髓性白血病，以及作为麻醉剂使用。近年研究发现，氨基甲酸乙酯是一种人类潜在致癌物质，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸乙酯列为2A类致癌物。氨基甲酸乙酯是一种伴随发酵食品（如酒精饮料、豆酱、酱油等）的生产过程中产生的副产物，对食品安全和生物体健康都有着严重的影响和危害。面对氨基甲酸乙酯所造成的食品安全问题，以微生物及酶降解实现食品中氨基甲酸乙酯的无危害化，是较理想的解决方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)SC07，已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012415。菌落为白色圆形，表面湿润光滑，边缘规则，半透明或不透明，菌落大小1.5-2.5mm。好氧或兼性厌氧。菌体革兰氏阴性，有荚膜，1000×显微镜下观察细胞呈长杆状或串珠状。见附图1。

所述产酸克雷伯氏菌分离自成年雌性小鼠肠道，其保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入营养肉汤培养基中，在30℃，200rpm，培养16h，取500μL培养液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。

上述的营养肉汤培养基为二型营养肉汤培养基，配方为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，如需固体培养基，再添加2%琼脂。

本发明的另一个目的是提供上述产酸克雷伯氏菌粗酶液的提取方法。

本发明的另一个目的是提供上述产酸克雷伯氏菌的应用，其合成的酸性氨基甲酸乙酯水解酶可以在pH小于5的条件下快速分解发酵食品中的副产物氨基甲酸乙酯并产生乙醇和氨气。其在最适pH7.0时酶活为12.3U/g，在pH5.0时的酶活为2.6U/g。

本发明的另一个目的是提供上述产酸克雷伯氏菌在酸性环境下分解尿素的应用，其合成的酸性脲酶可以在pH小于5的条件下快速分解发酵食品中的副产物尿素并产生二氧化碳和氨气其脲酶酶活为25.4U/g，并提供脲酶活性的检测方法。

本发明提供的产酸克雷伯氏菌能合成氨基甲酸乙酯水解酶以及脲酶，在pH为7.0时具有最高酶活，能在酸性条件下快速分解氨基甲酸乙酯以及尿素。在pH为5.0的条件下，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为2.6U/g，脲酶酶活为25.4U/g。在pH为7.0时，其氨基甲酸乙酯水解酶酶活为12.3U/g。

附图说明

图1产酸克雷伯氏菌显微照片

图2pH对产酸克雷伯氏菌氨基甲酸乙酯水解酶酶活的影响

具体实施方式

实施例1：产酸克雷伯氏菌筛选方法

将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液（200mg/kg bodyweight/day）后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠胃肠道组织，取组织悬浮液1mL于1000×g下离心10min，取上清液接种于富集培养基中（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通气培养20h。培养液于2000×g离心5分钟，取上清涂布于筛选培养基（牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯30g，琼脂20g，水1000mL，pH5.0）中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。

挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，离心5min（12000rpm,4℃）后收集菌体，再用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮菌体至0.1g/mL。通过超声破碎进行酶粗提液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定检测到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为一株产酸克雷伯氏菌,已于2012年10月19日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012415,保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例2：产酸克雷伯氏菌中氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的提取方法

挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，收集菌液50mL于冷冻高速离心机中低温离心10min（10000rpm,4℃）后收集菌体，菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS或50mM Tris-HCl（缓冲液pH应根据所筛选的蛋白稳定范围选取）重悬洗涤三次。再用pH7.0的PBS缓冲液悬浮菌体至0.1g/mL。将菌液在-80℃冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。将反复冻融的菌液，置于冰水浴中进行超声破碎，超声条件：25W，工作2S，间隔2S，重复工作10min，直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间20min。将菌体超声破碎后于低温离心机中离心10min（10000rpm,4℃），将上清液转移到干净的Eppendorf管中，低温保存。

实施例3：氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液的酶活检测方法

氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液酶活检测方法的原理是利用在一定条件下，氨基甲酸乙酯降解酶科将氨基甲酸乙酯分解生成乙醇，氨气和二氧化碳。氨与苯酚-次氯酸钠反应形成靛酚蓝显蓝色，用分光光度计在630nm处测其吸光值，分析氨的生成量，从而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。

酶活测定试剂的配制：

显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL

显色剂II：称取13.125g氢氧化钠和7.5mL次氯酸钠用超纯水定容至250mL

终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL

NH₄ ⁺标准溶液制备：1mL氨水溶于超纯水中并定容至145mL，配成0.1mol/L的NH₄ ⁺溶液，并以此为母液，用超纯水将之稀释并配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH₄ ⁺标准溶液。

氨离子标准曲线的绘制：分别精确移取1mL NH₄ ⁺标准梯度液置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温15min，立即吸取1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在630nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH₄ ⁺梯度为横坐标作图，得到标准曲线。

酶活的测定

取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和超纯水。然后在两管中分别加入1mL超纯水，在37℃恒温水浴箱中反应15min后，在两管各加入1mL三氯乙酸终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂Ⅱ，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，630nm处比色，并记录OD值。

酶活计算公式：酶活力＝ΔOD₆₃₀×n×k×10/15

式中：ΔOD₆₃₀：酶反应后样品测定与空白试验光密度值之差

n：酶活测定液稀释倍数

k：标准曲线斜率的倒数

10：1mL样品液稀释至10mL的倍数

15：酶反应的时间(min)（酶反应的时间为15min）

5.酶活定义

酶活力定义：在常压、37℃条件下每分钟分解底物产生1μmol氨为一个酶活力单位。

实施例4：氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液最适pH的确定

按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。

准备二组各7支10mL比色管，第一组7支比色管中，在每支都加入8mL上表中相应的缓冲液，然后加入3%氨基甲酸乙酯溶液1mL,加入一定量的氨基甲酸乙酯水解酶粗提液（酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到线性范围内的的光吸收值A₆₃₀。另一组7支试管也是每支都加入8mL上表中相应的缓冲液，但不再加氨基甲酸乙酯溶液而加入等量的去离子水，分别作为测定时的对照管。所有的试管都用水补足到10mL。按上述实施例三中酶活测定方法进行反应检测酶活。

以酶活(U/g)为纵坐标，以pH为横坐标，绘制下氨基甲酸乙酯水解酶活性与pH的关系曲线。分析曲线并确定氨基甲酸乙酯水解酶的最适pH或pH范围。绘制得到的图谱见附图2。

实施例5：产酸克雷伯氏菌酶粗提液降解尿素能力的确定

溶液配制：

DAM（二乙酰一肟）溶液：准确称取0.625g DAM，加超纯水微热搅拌，定容至25mL，置于冰箱待用

TSC（硫代氨基脲）溶液，准确称取0.0625g TSC，加超纯水微热搅拌，定容至25mL，置于冰箱待用

酸试剂：将300mL85%的浓磷酸和10mL98%的浓硫酸混合，定容至500mL

显色剂：按DAM液：TSC液：酸试剂2.5:1:50混合

尿素标准溶液制备：精确称取600mg尿素溶于100mL水中，配成0.1mol/L的尿素溶液，并以此为母液，用超纯水将之稀释并配制成0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L的尿素标准溶液。

酶活测定：

取两支试管，分别加入适量的尿素溶液，其中一支添加粗酶提取液，同时在37℃下反应15min。将15mL显色剂加入25mL比色管中，超纯水定容至25mL，充分搅拌均匀，与沸水浴中加热27min，取出于自来水中冷却13min，在527nm下比色。

酶活计算公式：酶活力＝ΔOD₅₂₇×n×10×k/15

式中：ΔOD₅₂₇：空白试验与酶反应后样品测定光密度值之差

n：酶活测定液稀释倍数

k：标准曲线斜率的倒数

10：1mL样品液稀释至10mL的倍数

15：酶反应的时间(min)（酶反应的时间为15min）

酶活力定义：在常压、37℃条件下每分钟分解1μmol尿素为一个酶活力单位。

测得在pH为5.0的条件下，其脲酶的酶活为25.4U/g。

Claims (5)

1.一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的产酸克雷伯氏菌SC07(KlebsiellaoxytocaSC07)，于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012415。

2.权利要求1所述产酸克雷伯氏菌，其特征是能耐受3%(w/v)氨基甲酸乙酯。

3.权利要求1所述产酸克雷伯氏菌，其能够合成氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶。

4.权利要求1-3任一所述的产酸克雷伯氏菌应用于氨基甲酸乙酯水解酶的生产。

5.权利要求1-3任一所述的产酸克雷伯氏菌应用于氨基甲酸乙酯的降解。

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