CN109971681A - 老窖梭状芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

老窖梭状芽孢杆菌及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明要解决的技术问题是目前没有既能生产短链脂肪酸，也能生产4‑甲基苯酚的梭状芽孢杆菌。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种老窖梭状芽孢杆菌Clostridium fermenticellae，该老窖梭状芽孢杆菌可代谢产生短链脂肪酸和4‑甲基苯酚。该老窖梭状芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC 17037，其在厌氧条件下发酵培养，培养基成分不同，该菌株的主要代谢产物不同，当培养基中添加乙酸钠和乙醇时，以短链脂肪酸为主；添加L‑酪氨酸时，以产4‑甲基苯酚为主。该菌株在发酵产生短链脂肪酸等白酒风味物质，以及生产4‑甲基苯酚等方面具有好的应用价值。

Description

老窖梭状芽孢杆菌及其用途
技术领域
本发明属于发酵微生物领域，具体涉及一株老窖梭状芽孢杆菌以及使用该菌株发酵生产短链脂肪酸和4-甲基苯酚的用途。
背景技术
短链脂肪酸是白酒风味物质的重要组成成分，也是白酒中酯类风味物质形成的前体。浓香型白酒窖泥微生物中的一些梭菌(Clostridia)种类是产生短链脂肪酸的重要微生物。
另外，有些梭菌会代谢产生4-甲基苯酚，如梭状芽孢杆菌属(Clostridium)中某些种Clostridium difficile、Clostridium tyrobutyricum和Clostridium ultunense等。4-甲基苯酚是白酒中窖泥味的主要来源，也是一种重要的抗氧化剂，在医药，农药，塑料工业中等有着重要的应用，但目前传统的化工合成法其生产过程往往伴随着大量的环境污染。目前还未见有既代谢产生短链脂肪酸，也能代谢产生4-甲基苯酚的梭状芽孢杆菌的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是目前没有既能生产短链脂肪酸，也能生产4-甲基苯酚的梭状芽孢杆菌。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种老窖梭状芽孢杆菌Clostridium fermenticellae，该老窖梭状芽孢杆菌可代谢产生短链脂肪酸和4-甲基苯酚。
其中，上述所述短链脂肪酸为乙酸、丁酸、戊酸或己酸中的至少一种。
其中，上述的老窖梭状芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC 17037。
其中，上述老窖梭状芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：l所示。
本发明提供了上述的老窖梭状芽孢杆菌在制备短链脂肪酸和/或4-甲基苯酚中的用途。
本发明还提供了上述的老窖梭状芽孢杆菌制备短链脂肪酸或4-甲基苯酚的方法。
该方法的步骤为将产4-甲基苯酚培养基或产短链脂肪酸培养基灭菌后，接种上述的老窖梭状芽孢杆菌，在厌氧条件下发酵培养即得4-甲基苯酚或短链脂肪酸。
其中，上述方法中所述的厌氧条件为N2﹕CO2﹕H2＝8～10﹕0～1﹕0～1。优选的，所述的厌氧条件为N2﹕CO2﹕H2＝8﹕1﹕1。
其中，上述方法中20～40℃静置培养。优选的，所述的培养条件为37℃。
其中，上述方法中所述的接种的菌株量为按体积比为2％～5％。优选的，所述的接种的菌株量为按体积比为5％。
进一步的，上述方法中所述的产4-甲基苯酚培养基的配方为葡萄糖2～5g/L，胰蛋白胨 5～10g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉膏5～10g/L，氯化钠1～5g/L，无水乙酸钠1～5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1～3g/L，FeCl2·4H2O 0～3g/L，CuCl2·2H2O 2.0mg/L， D(+)-生物素0～40mg/L，pH 4.5～8。
优选的，所述的产4-甲基苯酚培养基的配方为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉 3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L，FeCl2·4H2O 1.50g/L，CuCl2·2H2O 2.00mg/L，D(+)-生物素20.00mg/L，pH 5.0。
进一步的，上述的产4-甲基苯酚培养基中还添加有L-酪氨酸。优选的，上述的产4-甲基苯酚培养基中L-酪氨酸的添加量为10～400。优选的，产4-甲基苯酚培养基中L-酪氨酸的添加量为50～400mg/L。
其中，上述方法生产4-甲基苯酚时，所述发酵培养采用恒化发酵。
进一步的，上述方法中所述的产短链脂肪酸培养基的配方为：
乙酸钠3～5g/L,酵母膏1～5g/L,磷酸氢二钾0.1～1g/L，硫酸铵0.2～1g/L，硫酸镁 0.1～0.5g/L,硫酸钙0～0.5g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐0.5g/L，pH 4.5～8。
优选的，上述方法中所述的产短链脂肪酸培养基的配方为乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,硫酸钙0.1g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐0.5g/L，pH 5.0。
其中，上述方法生产短链脂肪酸采用静置发酵。静置发酵的温度优选为37℃。
本发明的有益效果在于：本发明从窖泥中分离出一株老窖梭状芽孢杆菌，该菌株在不同的培养条件下其主要代谢产物不同。在培养基中添加乙酸钠和乙醇时，该菌株主要代谢产物为乙酸、丁酸、戊酸、己酸等短链脂肪酸。改变培养条件，该菌株主要代谢产物为4-甲基苯酚，且在培养基中添加L-酪氨酸可以进一步提高其4-甲基苯酚产量，可达81.11mg/L以上。本发明株梭菌一方面能代谢产生短链脂肪酸为白酒提供风味物质，另一方面其为微生物发酵法清洁生产4-甲基苯酚提供了一种可能。
生物保藏说明：本发明涉及的老窖梭状芽孢杆菌Clostridium fermenticellae于2018年12 月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 17037,保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为老窖梭菌Clostridium fermenticellae。
具体实施方式
本发明主要涉及一株老窖梭状芽孢杆菌(Clostridium fermenticellae)，该菌株筛选自泸州老窖股份有限公司白酒酿造窖泥中，于2018年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 17037。
获取所述菌株16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株的16S rDNA全长序列为1381bp，16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。
该菌株可利用的主要碳源包括D-果糖、L-海藻糖、帕拉金糖和L-鼠李糖，在厌氧条件下培养可代谢产生短链脂肪酸和4-甲基苯酚。该菌株能发酵生产的短链脂肪酸包括乙酸、丁酸、戊酸和己酸。
所述的厌氧条件为N2﹕CO2﹕H2＝8～10：0～1﹕0～1。优选的，所述的厌氧条件为N2﹕CO2﹕H2＝8﹕1﹕1。厌氧发酵时进行静置培养为佳，较佳的培养温度是20～40℃。优选的培养温度为37℃。
使用本发明窖梭状芽孢杆菌能制备短链脂肪酸或4-甲基苯酚。
所述的接种的菌株量为按体积比为2％～5％，为接种量和培养基的体积比。优选的，所述的接种的菌株量为按体积比为5％。
为了获得更好的短链脂肪酸或4-甲基苯酚的产量，可以将产4-甲基苯酚培养基或产短链脂肪酸培养基灭菌后，接种上述的老窖梭状芽孢杆菌，在厌氧条件下发酵培养即得4-甲基苯酚或短链脂肪酸。
为了更好地实现本发明，本发明对上述方法进行了优化，当主要需要生产短链脂肪酸时，可使用以下配方的产短链脂肪酸培养基：
乙酸钠3～5g/L,酵母膏1～5g/L,磷酸氢二钾0.1～1g/L，硫酸铵0.2～1g/L，硫酸镁 0.1～0.5g/L,硫酸钙0～0.5g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐0.5g/L，pH 4.5～8。
优选的，上述方法中所述的产短链脂肪酸培养基的配方为乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,硫酸钙0.1g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐0.5g/L，pH 5.0。生产短链脂肪酸时，使用静置发酵即可。
当主要需要生产4-甲基苯酚时，可使用以下配方的产4-甲基苯酚培养基：葡萄糖2～5 g/L，胰蛋白胨5～10g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉膏5～10g/L，氯化钠1～5g/L，无水乙酸钠1～5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1～3g/L，FeCl2·4H2O 0～3g/L，CuCl2·2 H2O 2.0mg/L，D(+)-生物素0～40mg/L，pH 4.5～8。
优选的，上述的产4-甲基苯酚培养基的配方为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉 3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L，FeCl2·4H2O 1.50g/L，CuCl2·2H2O 2.00mg/L，D(+)-生物素20.00mg/L，pH 5.0。
实验表明，采用上述方法，发酵产物中4-甲基苯酚含量可达12.91mg/L。如还需要增加4-甲基苯酚的产量，可向上述的产4-甲基苯酚培养基中添加L-酪氨酸。上述的产4-甲基苯酚培养基中L-酪氨酸的添加量为0～400mg/L。优选的，产4-甲基苯酚培养基中L-酪氨酸的添加量为10～400mg/L。实验证明，在培养基中添加L-酪氨酸后该菌株发酵产生的4-甲基苯酚浓度可提高541.6％，产量达69.92mg/L。
更优的，使用可以使用恒化发酵方法进行发酵产物的生产。使用上述的产4-甲基苯酚培养基进行恒化发酵发酵后，该菌株发酵产生4-甲基苯酚浓度可达81.11mg/L。
以下通过实施例的介绍对本发明进行更详细的说明。
实施例1产短链脂肪酸和4-甲基苯酚细菌的筛选
从泸州老窖窖泥中取5g样品装入混有玻璃珠和50mL无菌水的250mL三角瓶中，37℃摇床上以115r/min振荡30min，取菌悬液1mL用无菌生理盐水10倍梯度稀释，以10-3和 10-4梯度稀释样涂布于分离培养基，厌氧条件下，37℃培养4～7天；然后挑取菌落丰厚，且生长旺盛的单菌落经分离纯化后接入液体分离培养基，37℃厌氧培养3天后运用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用仪技术(HS-SPME/GC-MS)测定4-甲基苯酚含量，采用高效液相色谱法(HPLC)测定短链脂肪酸含量，从而筛选菌株。
分离培养基配方：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L，琼脂20g/L，pH 6.5,121℃下灭菌20min。
HPLC测定具体方法如下：
①样品的预处理方法
准确量取2mL发酵上清液，将培养液离心(12000rpm，5min)获得上清液，分别加入800μL硫酸锌(300g/L)和800μL亚铁氰化钾(106g/L)，振荡混匀，离心。取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤后为待测样品。与此同时，以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸标准品为外标绘制不同脂肪酸的标准曲线。
②HPLC测定条件如表1所示
表1 HPLC测定条件
色谱柱 Sepax Carbomix H-NP 5:8(5μm，7.8×300mm)
流动相 2.5mM H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
流速 0.6mL/min
柱温 55℃
进样量 10μL
检测波长 210nm
HS-SPME/GC-MS具体方法如下：
①将菌株发酵液于3000r/min条件下离心10min，吸取上清液8mL加入萃取瓶，加入3g氯化钠和2-辛醇(10μg/L)。
②HS-SPME萃取条件
将萃取头插入样品瓶顶空部分，于50℃吸附30min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸3min。
③GC分析条件
色谱柱：TG-WAXMS毛细管色谱柱，柱长60m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm；载气：He；流速：1.0ml/min，分流比：20：1；柱温：进样口温度保持在260℃，起始气相色谱柱温维持在50℃2min，以3℃/min升温至145℃，再以15℃/min升温至230℃，保持3min。
④MS分析条件
离子源温度260℃；接口温度200℃；电离方式：EI+；电子能量：70ev；扫描质量范围： 33～350amu。
根据HPLC和HS-SPME/GC-MS分析结果，筛选获得1株同时具有产短链脂肪酸和4-甲基苯酚能力的细菌。
实施例2产短链脂肪酸和4-甲基苯酚细菌的分子鉴定
纯化实施例1中筛选得到的细菌，取指数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0/P6扩增其16S rDNA全长序列，具体如下：
P0:5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’(SEQ ID NO：2),
P6:5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’(SEQ ID NO：3)。
鉴定方法：
①反应体系(50μl)
②反应程序
PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11V/cm，电泳时间20min。
PCR产物的纯化按上海生工生物技术公司的小量胶回收PCR产物纯化试剂盒说明进行，测序由上海生工生物技术公司完成。
获得的细菌16S rDNA序列，在GenBank中进行BLAST比对确定其种属，该菌株16SrDNA序列全长为1381bp,与其同源性最高的菌株是Clostridium sp.JN500901(GenBank登录号MG753792.1)，相似性为99％；16S rDNA序列见SEQ ID NO：1。
实施例3菌株CGMCC 17037的生理生化特性
将CGMCC 17037接种于分离培养基，37℃厌氧培养3天后，通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)和扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscope， SEM)观察该菌株的细胞形态。将CGMCC 17037接种于液态发酵培养基，通过测定培养液 OD600，检测该菌株适宜生长的温度和pH范围，以及其对酒精和氯化钠的耐受范围，并通过 Biolog(AN微孔板)试验分析该菌株可利用的碳源。菌株CGMCC 17037的上述特征如表2 所示。
表2菌株CGMCC 17037的生理生化特性
实施例4菌株CGMCC 17037产短链脂肪酸实验
将菌株CGMCC 17037以5％接种量接种于含有20mL的种子培养基中，厌氧条件(N2﹕CO2﹕H2＝8﹕1﹕1)下于37℃静置培养2天后以5％接种量转接于发酵培养基中，厌氧条件下于37℃静置培养7天后，通过HPLC测定其发酵液中的短链脂肪酸的组成。
种子培养基：乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,硫酸钙0.1g/L，乙醇2％，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 5.0，121℃下灭菌20min。
发酵培养基：乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,硫酸钙0.1g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 5.0，121℃下灭菌20min。
按照上述实施例1中所述的HPLC检测方法，分析该菌株发酵液短链脂肪酸的产量，结果如表3所示。
表3短链脂肪酸的产量
菌株 乙酸(g/L) 丁酸(g/L) 戊酸(g/L) 己酸(g/L)
CGMCC 17037 0.87±0.11 0.88±0.05 1.95±0.13 0.63±0.03
实施例5生产4-甲基苯酚实验
将菌株CGMCC 17037接种于添加L-酪氨酸的发酵培养基中，研究L-酪氨酸浓度对该菌株产4-甲基苯酚的影响。
将菌株CGMCC 17037以5％接种量接种于含有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中。生产4-甲基苯酚的发酵培养基的配方为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L，FeCl2·4H2O 1.50g/L，CuCl2·2H2O 2.00mg/L，D(+)-生物素20.00mg/L，pH 5.0。并添加不同浓度L-酪氨酸(0、10、50、100、200和400mg/L)于发酵培养基中，于37℃按上述小试厌氧条件静置培养7天。
以4-甲基苯酚为外标绘制标准曲线，按照上述HS-SPME/GC-MS方法，检测发酵液中的 4-甲基苯酚含量，结果如表4所示。
表4 L-酪氨酸添加量对菌株CGMCC 17037发酵液中4-甲基苯酚产量影响
实施例6流加发酵生产4-甲基苯酚实验
将菌株CGMCC 17037以5％接种量接种于含有400mL的产4-甲基苯酚的发酵培养基的 1L厌氧发酵罐中，并在发酵培养基中加入400mg/L的L-酪氨酸。
生产4-甲基苯酚的发酵培养基的配方为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L， FeCl2·4H2O 1.50g/L，CuCl2·2H2O 2.00mg/L，D(+)-生物素20.00mg/L，pH 5.0。发酵方式为恒化发酵，流加速度为0.1mL/min，转速设置为200r/min，温度37℃，并以99.99％的高纯氮气为保护气体，厌氧发酵10天。
以4-甲基苯酚为外标绘制标准曲线，按照上述HS-SPME/GC-MS方法，检测发酵液中的4-甲基苯酚含量可达81.11mg/L。
序列表
<110> 泸州品创科技有限公司
江南大学
<120> 老窖梭状芽孢杆菌及其用途
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<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaagtcga gcgagagaaa tcttcgggga tggatctagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggcaacc tgcctcaaag agggggatag cctcccgaaa gggagattaa taccgcataa 120
tgttgtttta ctgcatagta aagcaaccta aggagtaatc cactttgaga tgggcccgcg 180
ccgcattagt tagttggtgg ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga 240
gagggtgatc ggccacattg gaactgagag acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
ggggaatatt gcacaatggg cggaagcctg atgcagcaac gccgcgtggg tgatgaaggt 360
tttcggattg taaagccctg tcttttggga cgataatgac ggtaccaaag gaggaagcca 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcgagcgttg tccggattta 480
ctgggcgtaa agggtgcgta ggcggatatt taagtgggat gtgaaaaccc cgggcttaac 540
ccggggactg catttcaaac tggatatctg gagtgcagga gaggaaagcg gaattcctag 600
tgtagcggtg aaatgcgtag agattaggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctttctgga 660
ctgtaactga cgctgaggca cgaaagcgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag 720
tccacgccgt aaacgatgag tactaggtgt aggaggtatc gaccccttct gtgccgcagt 780
aaacgcaata agtactccgc ctgggaagta cgatcgcaag attaaaactc aaaggaattg 840
acgggggccc gcacaagcag cggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 900
acctagactt gacatcccct gaattacctg taattaggga agccctccgg ggcagggaga 960
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttaggttaag tcctgcaacg 1020
agcgcaaccc ctatcattag ttgctaccat taagttgagc actctagtga gactgcccgg 1080
gtcaaccggg aggaagtctg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gtctagggct 1140
acagcgctgc tacaatggtg aatacagaga gatgcaaacc cgcaagggtg agccaaactt 1200
taaaattcac ctcagttcgg attgcaggct gaaacccgcc tgcatgaagc tggagttgct 1260
agtaatcgcg aatcagaatg tcgcggtgaa tgcgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1320
tcacaccatg agagttggca acacccgaag tccgtggggt aaccgtaagg aaccagcggc 1380
c 1381
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacggctac cttgttacga 20

Claims (9)

1.老窖梭状芽孢杆菌Clostridium fermenticellae，可代谢产生短链脂肪酸和4-甲基苯酚。
2.如权利要求1所述老窖梭状芽孢杆菌，其特征在于，所述短链脂肪酸为乙酸、丁酸、戊酸或己酸中的至少一种。
3.如权利要求2所述老窖梭状芽孢杆菌，其特征在于保藏编号为：CGMCC17037。
4.如权利要求3所述老窖梭状芽孢杆菌，其特征在于其16S rDNA序列如SEQ ID NO.l所示。
5.权利要求1～4任一项所述的老窖梭状芽孢杆菌在制备短链脂肪酸和/或4-甲基苯酚中的用途。
6.使用权利要求1～4任一项所述的老窖梭状芽孢杆菌制备短链脂肪酸或4-甲基苯酚的方法，其特征在于，将产4-甲基苯酚培养基或产短链脂肪酸培养基灭菌后，接种所述的老窖梭状芽孢杆菌，在厌氧条件下发酵培养即得4-甲基苯酚或短链脂肪酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于符合以下至少一项：
所述方法中厌氧条件为N2﹕CO2﹕H2＝8～10﹕0～1﹕0～1；
或所述方法中的培养条件为20～40℃静置培养；
或接种的菌株量为按体积比2％～5％。
8.如权利要求6或7任一项的方法，其特征在于：
所述的产4-甲基苯酚培养基的配方为葡萄糖2～5g/L，胰蛋白胨5～10g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉膏5～10g/L，氯化钠1～5g/L，无水乙酸钠1～5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5(0.5)g/L，可溶性淀粉1～3g/L，FeCl2·4H2O 0～3g/L，CuCl2·2H2O 2.0mg/L，D(+)-生物素 0～40mg/L，pH 4.5～8；
优选的，所述的产4-甲基苯酚培养基的配方为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠3g/L，无水乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，可溶性淀粉1g/L，FeCl2·4H2O 1.50g/L，CuCl2·2H2O 2.00mg/L，D(+)-生物素 20.00mg/L，pH 5.0；
优选的，所述的产4-甲基苯酚培养基中还添加有L-酪氨酸；
优选的，所述的产4-甲基苯酚培养基中L-酪氨酸的添加量为10～400mg/L。
9.如权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于：所述的产短链脂肪酸培养基的配方为：
乙酸钠3～5g/L,酵母膏1～5g/L,磷酸氢二钾0.1～1g/L，硫酸铵0.2～1g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L,硫酸钙0～0.5g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐0.5g/L，pH 4.5～8；
优选的，所述的产短链脂肪酸培养基的配方为乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁0.2g/L,硫酸钙0.1g/L，乙醇0～10％，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 5.0。
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