CN116286513B - 一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株希氏乳杆菌FR‑1012及其工业化生产γ‑氨基丁酸的方法，希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)FR‑1012，已于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26138。该菌株具有稳定的γ‑氨基丁酸产量，10T发酵罐转化实验的最终γ‑氨基丁酸产量为37.6g/L，底物摩尔转化率为99.76％，比出发菌株产量提高了69.83％。该菌株生产的γ‑氨基丁酸达到食品安全级别，可应用于功能性食品、保健品、化妆肤品、生物饲料、农业等不同领域，具有广泛应用前景。

Description

一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种化合物，化学式是C₄H₉NO₂，别名4-氨基丁酸、氨酪酸，是广泛分布于动植物体内的一种非蛋白质氨基酸。GABA是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，其拥有良好的水溶性与热稳定性。现已证实，作为小分子量非蛋白质氨基酸的GABA具备食用安全性，并可用于饮料等食品的生产。欧洲食品安全局(EFSA)和美国食品药品管理局(FDA)承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂，2009年我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新食品原料。

生产GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法，由于化学合成法存在生产成本高、反应不容易控制、副产物成分复杂且有害等缺点，最后产物存在有机试剂残留的问题而不能添加在食品中；生物合成法则具有反应条件温和、环境污染小、安全性高等优点，具有较大的生产食品级GABA的潜力。多种微生物都可以合成GABA，包括细菌、真菌和酵母，而乳酸菌作为安全的食品微生物，已广泛用于发酵食品的生产中，其GABA产生能力研究也最为广泛。目前，国家卫健委批准使用制备食品用γ-氨基丁酸的乳酸菌仅短乳杆菌(Lactobacillus brevis)与希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)两种。中国专利CN102796779B公开了一种生物法制备γ-氨基丁酸的方法，在生产γ-氨基丁酸环节中，分批加入底物谷氨酸钠，总反应底物浓度为25g/L，最终得到的转化液中γ-氨基丁酸含量为12g/L，浓度较低，对后续提取纯化工艺增加了难度，不利于实现工业化生产。

发明内容

为了提高希氏乳杆菌生产γ-氨基丁酸的转化效率和产量，本发明提供一株希氏乳杆菌FR-1012及其工业化生产γ-氨基丁酸的方法。

第一方面，本发明提供一株希氏乳杆菌FR-1012，希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)FR-1012，已于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26138。

第二方面，本发明提供上述希氏乳杆菌FR-1012在生产γ-氨基丁酸中的应用。

第三方面，本发明提供一种工业化生产γ-氨基丁酸的方法，使用上述希氏乳杆菌FR-1012催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸。

进一步的，包括以下步骤：

(1)种子液培养：将希氏乳杆菌FR-1012接种于种子培养基中摇床培养，培养温度为30～34℃，培养时间为8～12h；

(2)发酵液培养：将上述种子液以体积比5％～20％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃下培养24～30h，得到菌体；

(3)转化：将上述收集的菌体，按一定比例悬浮在含0.1‰～1‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸30～60g/L，30℃静置转化30～60h，得到含γ-氨基丁酸的转化液。

进一步的，种子培养基的组分及含量：蛋白胨10～15g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖1～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，硫酸镁0.01～1g/L，pH 7.0～8.0。

进一步的，种子培养基组分及含量为：蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L，pH 7.2。

进一步的，发酵培养基的组分及含量为：牛肉粉1～10g/L，酵母粉5～15g/L，玉米浆干粉5～20g/L，葡萄糖10～40g/L，磷酸氢二钾1～10g/L，乙酸钠1～10g/L，柠檬酸钠1～10g/L，硫酸镁0.01～1g/L，吐温80 1～5mL/L，pH 7.0～7.5。

进一步的，发酵培养基的组分及含量为：牛肉粉7g/L，酵母粉10g/L，玉米浆干粉15g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾5g/L，乙酸钠6g/L，柠檬酸钠2g/L，硫酸镁0.02g/L，吐温801mL/L，pH 7.2。

进一步的，步骤(3)中，5-磷酸吡哆醛的含量为0.5‰，L-谷氨酸浓度为55g/L，转化时间为40h。

本发明的有益效果在于：

本发明通过诱变育种、高通量筛选得到的希氏乳杆菌FR-1012，具有稳定的γ-氨基丁酸产量，10T发酵罐转化实验的最终γ-氨基丁酸产量为37.6g/L，底物摩尔转化率为99.76％，比出发菌株产量提高了69.83％，使用希氏乳杆菌FR-1012生产制备的γ-氨基丁酸不存在安全隐患，达到食品安全级别，可应用于功能性食品、保健品、化妆肤品、生物饲料、农业等不同领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1获得的突变株希氏乳杆菌FR-1012的生长曲线图。

图2为希氏乳杆菌FR-1012菌落特征图。

图3为显微镜下希氏乳杆菌FR-1012菌落的观察结果图。

图4为10T发酵罐中随时间变化的γ-氨基丁酸产量图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1菌株的获得

1、菌株来源

奶牛场土壤，采集时间为2021年05月，采集地点为山东省临沂市临沭县。

2、菌株育种筛选

(1)出发菌株筛选

将采集于临沭奶牛场土壤中样品于无菌水中进行稀释，稀释液涂布于溴甲酚紫-MRS培养基平板上，于30℃恒温培养48h，待菌落长出后挑选单菌落，继续分离纯化，直至获得纯菌，初筛出生长速度快、γ-氨基丁酸产量高的菌株，复筛利用HPLC法测定γ-氨基丁酸产量，通过实验室筛选得到γ-氨基丁酸产量为2.8g/L的菌株。

(2)诱变育种及筛选

将筛选得到的出发菌株通过紫外照射、ARTP、硫酸二乙酯化等物理和化学方式进行诱变育种，并在实验室进行生物感应器介导的高通量筛选，获得高产γ-氨基丁酸的突变菌株FR-1012。突变菌株FR-1012具有稳定的遗传特性，其生长曲线如图1所示。使用突变菌株FR-1012摇瓶发酵转化γ-氨基丁酸，产量为14g/L，相比出发菌株产量提高5倍。

实施例2菌株鉴定

1、突变株的菌落特征如图2所示，在显微镜下观察菌落结果如图3所示。

2、收集新鲜菌体，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA模板，利用通用引物进行16S rDNA基因扩增，PCR产物经检测纯化后，直接进行序列测定，测定由上海生工生物工程技术有限公司进行。

测得全序列结果如下：

TAAGATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTCTTGGTCAATGAAGTTGAGTGCTTGCATTTAACTGATTTGACATTAAGACGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAACTTGCCCCGAAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAACAAAAACCACATGGTTTTTGTTTAAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTTGGGATGGACACGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAACCCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGCGTGTCAGAGTAACTGTTGACATCGTGACGGTATCCAGACAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGACCAAGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGCCAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCTAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACGGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTCAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAGGCCCAGGAAGGTGGGGATGACGTCCAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCGAAAGCCGGTGAGGTAACCTTCGGGGGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTACACAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

将所得到的全序列上传到NCBI网站上进行序列比对，经过菌落特征和16S rDNA比对，最终确定变菌株FR-1012属名为希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)，命名为希氏乳杆菌FR-1012，该菌株已经于2022年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26138。

实施例3使用希氏乳杆菌FR-1012生产γ-氨基丁酸的方法

(1)将希氏乳杆菌FR-1012接种于种子培养基中，在30℃条件下培养10h，获得种子液；

其中，种子培养基组分为：蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L，pH 7.2。

(2)将上述种子液以10％的接种量接种于摇瓶中，28℃下转速100rpm培养30h，获得发酵液；

其中，发酵培养基组分为：牛肉粉5g/L，酵母粉10g/L，玉米浆干粉10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸钠2g/L，硫酸镁0.05g/L，吐温80 1mL/L，pH7.2。

(3)将上述发酵液离心收集菌体，再将菌体等体积悬浮在含0.7‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸30g/L，在30℃静置转化48h，转化液中γ-氨基丁酸产量为20g/L。

实施例4 100L发酵罐生产γ-氨基丁酸的方法

将实施例3中培养的种子液以10％的接种量接种于装有70L发酵培养基的100L发酵罐中，罐压不超过0.05MPa，转速80rpm，通气量为0.05(vvm)，28℃培养30h后，收集菌体等体积悬浮在含0.5‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸30g/L，在30℃静置转化40H，转化液中γ-氨基丁酸产量为20g/L。

实施例5 1T发酵罐希氏乳杆菌FR-1012生产γ-氨基丁酸的方法

将实施例3中培养的种子液以10％的接种量接种于装有700L发酵培养基的1T发酵罐中，罐压为0.05～0.06MPa，转速40rpm，通气量为0.03(vvm)，28℃培养30h后，收集菌体等体积悬浮在含0.5‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸45g/L，在30℃静置转化48h，转化液中γ-氨基丁酸产量为31.5g/L。

实施例6 10T发酵罐希氏乳杆菌FR-1012生产γ-氨基丁酸的方法

将实施例3中培养的种子液以15％的接种量接种于装有7T发酵培养基的10T发酵罐中，罐压为0.05～0.06MPa，转速10rpm，通气量为0.01(vvm)，28℃培养30h后，收集菌体等体积悬浮在含0.5‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸55g/L，在30℃静置转化40h，转化液中γ-氨基丁酸产量为37.6g/L。

10T发酵罐中，从0h起，在8h、16h、24h、32h、40h对γ-氨基丁酸的浓度进行测定，γ-氨基丁酸的产量随时间的变化如图4所示，γ-氨基丁酸最终产量为37.6g/L，底物摩尔转化率为99.76％，比出发菌株产量提高了69.83％。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1. 一种工业化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，使用希氏乳杆菌FR-1012催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠生产γ-氨基丁酸；希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）FR-1012已于2022年11月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26138；

包括以下步骤：

（1）种子液培养：将希氏乳杆菌FR-1012接种于种子培养基中摇床培养，培养温度为30~34℃，培养时间为8~12h；

（2）发酵液培养：将上述种子液以体积比5%~20%的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26~30℃下培养24~30h，得到菌体；

（3）转化：将上述收集的菌体，按一定比例悬浮在含0.1‰~1‰的5-磷酸吡哆醛的纯化水中，投加L-谷氨酸30~60g/L，30℃静置转化30~60h，得到含γ-氨基丁酸的转化液。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养基的组分及含量：蛋白胨10~15g/L，酵母粉2~5g/L，葡萄糖1~10g/L，磷酸氢二钾1~5g/L，硫酸镁0.01~1g/L，pH 7.0~8.0。

3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基组分及含量为：蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.05g/L，pH 7.2。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基的组分及含量为：牛肉粉1~10g/L，酵母粉5~15g/L，玉米浆干粉5~20g/L，葡萄糖10~40g/L，磷酸氢二钾1~10g/L，乙酸钠1~10g/L，柠檬酸钠1~10g/L，硫酸镁0.01~1g/L，吐温80 1~5mL/L，pH 7.0~7.5。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵培养基的组分及含量为：牛肉粉7g/L，酵母粉10g/L，玉米浆干粉15g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾5g/L，乙酸钠6g/L，柠檬酸钠2g/L，硫酸镁0.02g/L，吐温80 1mL/L，pH 7.2。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，5-磷酸吡哆醛的含量为0.5‰，L-谷氨酸浓度为55g/L，转化时间为40h。