CN110904092A - 一种高产gaba的短乳杆菌复合诱变育种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸（GABA）短乳杆菌的复合诱变育种的方法，属于生物技术领域。所使用的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）由山东国力生物科技有限公司提供，菌株经活化、富集、绘制生长曲线、制备菌悬液、复合诱变处理、初筛、复筛，最终得到具有高产GABA性状的短乳杆菌菌株。本复合诱变方法成本低廉，简单易操作，诱变效果好，短乳杆菌的高产GABA性状稳定，是一种筛选高产GABA短乳杆菌菌种的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）的短乳杆菌复合诱变育种的方法。
背景技术
GABA作为一种天然的非蛋白质氨基酸，在动植物、微生物中分布广泛，功效众多。而乳酸菌作为一种食品安全级(GRAS)微生物，在食品工业中应用历史悠久，被誉为重要的、必不可少的益生菌。
利用乳酸菌属的短乳杆菌生产GABA，具有专一性高、设备简单、环保、成本低等优点，适用于大规模产业化生产，所以引起的关注众多。
根据我国新资源食品范围，允许使用的GABA生产菌种有限，所以筛选出的可以用于食品级GABA生产的菌种更有限，这其中短乳杆菌作为最常用的菌种，长期用于乳制品、泡菜等食品行业，是理想的食品级GABA生产菌种。但目前短乳杆菌的GABA产量多在20 g/L以下（冯宇,高年发,张颖,等.短乳杆菌生产γ-氨基丁酸培养基的优化[J].现代食品科技,2010,26(01):34-37.）。虽然相比于酵母、红曲霉等食品新资源菌种，短乳杆菌的GABA产量要高的多，但它还是难以满足我们对食品级高产GABA菌种的需求（1. 王维.高产γ-氨基丁酸酿酒酵母的筛选及在梨酒酿造中的应用[D].河北科技大学,2015. 2. 黄敏欣,赵文红,白卫东,等.提高红曲霉中γ-氨基丁酸产量的研究进展[J].中国调味品,2015,40(05):136-140.），所以利用短乳杆菌来诱变生产高产GABA的菌种就很有应用价值。然而目前与短乳杆菌相关的诱变育种方法较少，多数都是单一的诱变育种方式（刘婷婷.高产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株选育及其转化条件优化[D].江南大学,2010.），所以本文就以实验室现有的短乳杆菌菌种进行了复合诱变育种相关方法的探究。
发明内容
本发明的目的是发明一种高产GABA短乳杆菌的复合诱变育种的方法。从而克服短乳杆菌诱变方式较单一的缺陷，进而提供一套既快捷又高效的短乳杆菌复合诱变育种方法，该诱变方法在诱变时，使用的是硫酸二乙酯和紫外线复合诱变育种，既可以保证诱变育种的效果，又提高了诱变育种的效率。
本发明在对短乳杆菌进行诱变育种的时候，致死率在80%-90%之间，即可靠又高效。
本发明是一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，步骤如下：
①复合诱变育种
短乳杆菌菌种用MRS培养基培养活化后，离心收集菌体，用生理盐水稀释制成菌体浓度为108-109 个/mL的菌悬液。取菌悬液10 mL加入硫酸二乙酯诱变溶液5 mL，混匀，37℃、200r/min诱变15 min，再加入硫代硫酸钠溶液5 mL终止反应，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次后再稀释制成菌悬液，在距离15 W紫外灯15 cm处照射90 s，即得诱变菌液。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min离心10 min；
所述硫酸二乙酯诱变溶液中硫酸二乙酯的含量是2%；
所述硫代硫酸钠溶液中硫代硫酸钠的含量是25%；
②筛选高产GABA的短乳杆菌菌株
初筛：将诱变菌液用生理盐水稀释，接种到固体MRS培养基中，30℃培养72 h，计算致死率。复筛：挑取生长较快的菌落，接种到液体MRS培养基中，30℃培养48 h，离心收集菌体，用等体积缓冲溶液稀释，30℃培养24 h。离心取上清液，检测GABA的含量，选取高产菌株。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述致死率的计算公式是相同稀释浓度条件下， (诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100%；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min，离心10 min；
所述缓冲溶液是含有20 g/L谷氨酸，1 g/L吐温80，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
所述检测GABA含量的检测方法是Berthelot比色法。
采用本方法来进行诱变，短乳杆菌诱变致死率在80%-90%之间，使用的诱变剂价格低廉、易获取，同时诱变效率较高，复合诱变之后筛选出的短乳杆菌菌株GABA产量可以提升50%以上，增产效果明显。
与现有技术相比较，本发明诱变得到的高产GABA短乳杆菌菌种，具有以下显著特点：
（1）本发明所使用的材料易获取，成本低，方法也简单易行。
（2）利用该方法进行复合诱变育种，筛选出的短乳杆菌菌株GABA的产量可以提升50%以上，并且GABA的高产性状稳定。
（3）本发明的筛选条件温和，以谷氨酸作为唯一的转化底物，缓冲溶液成分简单，GABA提纯结晶方便，GABA的提纯纯度也有保证。
（4）本发明通过Berthelot比色法分析转化液中GABA转化率的高低，筛选效率较高。
实施例1：
①复合诱变育种
短乳杆菌菌种用MRS培养基培养活化后，离心收集菌体，用生理盐水稀释制成菌体浓度为108-109 个/mL的菌悬液。取菌悬液10 mL加入硫酸二乙酯诱变溶液5 mL，混匀，37℃、200r/min诱变15 min，再加入硫代硫酸钠溶液5 mL终止反应，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次后再稀释制成菌悬液，在距离15 W紫外灯15 cm处照射90 s，即得诱变菌液。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min离心10 min；
所述硫酸二乙酯诱变溶液中硫酸二乙酯的含量是2%；
所述硫代硫酸钠溶液中硫代硫酸钠的含量是25%；
②筛选高产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的短乳杆菌菌株
初筛：将诱变菌液用生理盐水稀释，接种到固体MRS培养基中，30℃培养72 h，计算致死率。复筛：挑取生长较快的菌落，接种到液体MRS培养基中，30℃培养48 h，离心收集菌体，用等体积缓冲溶液稀释，30℃培养24 h。离心取上清液，检测GABA的含量，选取高产菌株。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述致死率的计算公式是相同稀释浓度条件下， (诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100%；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min，离心10 min；
所述缓冲溶液是含有20 g/L谷氨酸，1 g/L吐温80，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
所述检测GABA含量的检测方法是Berthelot比色法。
利用当前发明进行的诱变育种短乳杆菌致死率为87%，筛选出的短乳杆菌的GABA产量为23.85 g/L，GABA产量提高了55.46%。
实施例2：
①复合诱变育种
短乳杆菌菌种用MRS培养基培养活化后，离心收集菌体，用生理盐水稀释制成菌体浓度为108-109 个/mL的菌悬液。取菌悬液10 mL加入硫酸二乙酯诱变溶液5 mL，混匀，37℃、200r/min诱变15 min，再加入硫代硫酸钠溶液5 mL终止反应，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次后再稀释制成菌悬液，在距离15 W紫外灯15 cm处照射90 s，即得诱变菌液。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min离心10 min；
所述硫酸二乙酯诱变溶液中硫酸二乙酯的含量是2%；
所述硫代硫酸钠溶液中硫代硫酸钠的含量是25%；
②筛选高产GABA的短乳杆菌菌株
初筛：将诱变菌液用生理盐水稀释，接种到固体MRS培养基中，30℃培养72 h，计算致死率。复筛：挑取生长较快的菌落，接种到液体MRS培养基中，30℃培养48 h，离心收集菌体，用等体积缓冲溶液稀释，30℃培养24 h。离心取上清液，检测GABA的含量，选取高产菌株。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述致死率的计算公式是相同稀释浓度条件下， (诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100%；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min，离心10 min；
所述缓冲溶液是含有20 g/L谷氨酸，1 g/L吐温80，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
所述检测GABA含量的检测方法是Berthelot比色法。
利用当前发明进行的诱变育种短乳杆菌致死率为84%，筛选出的短乳杆菌GABA产量为25.36 g/L，GABA产量提高了65.36%。
实施例3：
①复合诱变育种
短乳杆菌菌种用MRS培养基培养活化后，离心收集菌体，用生理盐水稀释制成菌体浓度为108-109 个/mL的菌悬液。取菌悬液10 mL加入硫酸二乙酯诱变溶液5 mL，混匀，37℃、200r/min诱变15 min，再加入硫代硫酸钠溶液5 mL终止反应，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次后再稀释制成菌悬液，在距离15 W紫外灯15 cm处照射90 s，即得诱变菌液。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min离心10 min；
所述硫酸二乙酯诱变溶液中硫酸二乙酯的含量是2%；
所述硫代硫酸钠溶液中硫代硫酸钠的含量是25%；
②筛选高产GABA的短乳杆菌菌株
初筛：将诱变菌液用生理盐水稀释，接种到固体MRS培养基中，30℃培养72 h，计算致死率。复筛：挑取生长较快的菌落，接种到液体MRS培养基中，30℃培养48 h，离心收集菌体，用等体积缓冲溶液稀释，30℃培养24 h。离心取上清液，检测GABA的含量，选取高产菌株。
所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂；
所述致死率的计算公式是相同稀释浓度条件下， (诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100%；
所述离心的条件是4℃，5000 r/min，离心10 min；
所述缓冲溶液是含有20 g/L谷氨酸，1 g/L吐温80，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
所述检测GABA含量的检测方法是Berthelot比色法。
利用当前发明进行的诱变育种短乳杆菌致死率为89%，筛选出的短乳杆菌GABA产量为26.12 g/L，GABA产量提高了170.31%。
Claims (8)
1.一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，步骤如下：
①复合诱变育种
短乳杆菌菌种用MRS培养基培养活化后，离心收集菌体，用生理盐水稀释制成菌体浓度为108-109 个/mL的菌悬液；取菌悬液10 mL加入硫酸二乙酯诱变溶液5 mL，混匀，37℃、200r/min诱变15 min，再加入硫代硫酸钠溶液5 mL终止反应，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次后再稀释制成菌悬液，在距离15 W紫外灯15 cm处照射90 s，即得诱变菌液；
②筛选高产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的短乳杆菌菌株
初筛：将诱变菌液用生理盐水稀释，接种到固体MRS培养基中，30℃培养72 h，计算致死率；复筛：挑取生长较快的菌落，接种到液体MRS培养基中，30℃培养48 h，离心收集菌体，用等体积缓冲溶液稀释，30℃培养24 h；离心取上清液检测GABA的含量，选取高产菌株。
2.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述MRS培养基，配方是蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，吐温80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，七水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1.0 L，固体MRS培养基还需加入20 g琼脂。
3.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述离心的条件是4℃，5000 r/min，离心10 min。
4.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，硫酸二乙酯诱变溶液中硫酸二乙酯的含量是2%。
5.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述硫代硫酸钠溶液中硫代硫酸钠的含量是25%。
6.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述致死率的计算公式是相同稀释浓度条件下， (诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100%。
7.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述缓冲溶液是含有20 g/L谷氨酸，1 g/L吐温80，pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
8.如权利要求1所述的一种高产GABA的短乳杆菌复合诱变育种的方法，所述检测GABA含量的检测方法是Berthelot比色法。
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| CN111471724A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-07-31 | 济南大学 | 一种食品级γ-氨基丁酸全细胞转化生产的方法 |
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