CN113583913A - 一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，采用副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillushilgardii)复配结合特定的应用方法，通过采用本发明提供的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，具有较优的稳定性，通过传代12次，仍能够得到发酵性能稳定的混菌，并且对于糖蜜产酸的利用率较高，能够有效利用了糖蜜中的有机质，而且低成本地形成饲用抗生素的替代产品，实现甜菜糖蜜的有效利用，对于甜菜糖蜜的有效利用以及饲料添加剂的发展具有巨大的潜在开发价值。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂技术领域，涉及一种饲料添加剂的制备方法，具体涉及一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂及其应用的技术领域。
背景技术
酸化剂是一种可降低饲料在消化道中的pH值的一种饲料添加剂。目前使用的酸化剂主要有无机酸化剂、有机酸化剂和复合酸化剂三种。无机酸化剂一般包括有H3PO4、HCl及H2SO4；常见的有机酸化剂包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、山梨酸、延胡索酸、柠檬酸等；复合酸化剂是指将无机酸和有机酸或有机酸和有机酸进行复合，增强酸化剂的使用效果。酸化剂与日粮配合饲喂动物，提高日粮的酸度，调节动物胃肠道内pH值，从而减少病原菌感染，增强机体免疫性能及动物抗应激能力，提高动物生产性能。目前投入生产生活中的单一酸化剂和复合酸化剂大部分都是由纯化的化工原料单一或者按一定的比例混合制成的，其生产成本较高。
甜菜糖蜜是甜菜在制糖过程中的残留料液，料液中酚类、色素、无机盐等非糖物质不断富集导致部分料液始终无法结晶，其为制糖工业主要的副产物，是一种质地黏稠、深棕色、半流动的液态物质。糖蜜可为微生物生长繁殖提供丰富的碳源、氮源、无机盐，而且糖蜜中的活性物质可能对发酵有一定的促进的作用，因此利用甜菜糖蜜作为碳源用于菌群发酵，可大大降低发酵成本。
现有技术中关于饲料酸化剂的研究多存在底物利用不完全，成本高昂，以及菌剂稳定性差等缺陷，如何提供一种底物转化效率高、传代稳定、成本低廉的特定的菌剂进行酸化剂制备，对于甜菜糖蜜的有效利用以及饲料添加剂的发展具有巨大的潜在开发价值。
发明内容
针对现有技术中存在的饲料酸化剂的研究多存在底物利用不完全，成本高昂，以及菌剂稳定性差等缺陷等不足问题，本发明的目的在于提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂及其应用，对于利用特定复合菌剂发酵甜菜糖蜜制成液态酸化剂，不但有效利用了糖蜜中的有机质，而且低成本地形成饲用抗生素的替代产品，实现甜菜糖蜜的有效利用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，所述的复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)组成。
优选的，复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)按照1:9的活菌数比例复配，复合发酵菌剂活菌数维持在108-109cfu/ml。
进一步，本发明具体提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，按2％的体积比将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillushilgardii)混合菌群接种至装有100g/L-500g/L糖蜜浓度的CSLP培养基锥形瓶中培养，培养时间为12-72h，培养过程中加入中和剂，通过发酵制备获得酸化剂应用饲料。
优选的，糖蜜浓度采用100g/L。
优选的，培养时间为48h。
优选的，培养条件选择静止不灭菌。
优选的，中和剂采用Na2CO3。
优选的，培养过程中的氮源选择10种有机和无机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、乙酸铵、尿素。
更优选的，培养过程中的氮源选择4种有机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉。
本发明中，采用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)两株菌均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)德等公众渠道获得。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
通过采用本发明提供的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，具有较优的稳定性，通过传代12次，仍能够得到发酵性能稳定的混菌，并且对于糖蜜产酸的利用率较高，能够有效利用了糖蜜中的有机质，而且低成本地形成饲用抗生素的替代产品，实现甜菜糖蜜的有效利用，对于甜菜糖蜜的有效利用以及饲料添加剂的发展具有巨大的潜在开发价值。
附图说明
图1所示为传代过程中乳酸产量变化图。
图2所示为部分菌群高通量测序结果图。
图3所示为培养时间对菌群产酸的影响结果图。
图4所示所示为糖蜜浓度对菌群产酸的影响结果图。
图5所示为培养48h后菌液中的蔗糖剩余量结果图。
图6所示为不同培养条件对菌群产酸的影响结果图。
图7所示为不同中和剂对菌群产酸的影响结果图。
图8所示为不同氮源对菌群产酸的影响结果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中材料有：新疆农家发酵酸奶中富集得到的菌群、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、乙酸铵、尿素、NaOH、KOH、Ca(OH)2、FeCl3·6H2O、DL-乳酸，所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，酵母浸粉5，K2HPO4·3H2O 2，(NH4)2HC6H5O72，CH3COONa·3H2O 5，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·H2O 0.25，121℃高压蒸汽灭菌20min。
CSLP培养基(g/L)：甜菜糖蜜100-500，玉米浆干粉18.5。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂
本发明提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，所述的复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)组成。
优选的，复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)按照1:9的活菌数比例复配，复合发酵菌剂活菌数维持在108-109cfu/ml。
进一步，本发明具体提供一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，按2％的体积比将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillushilgardii)混合菌群接种至装有100g/L-500g/L糖蜜浓度的CSLP培养基锥形瓶中培养，培养时间为12-72h，培养过程中加入中和剂。
优选的，糖蜜浓度采用100g/L。
优选的，培养时间为48h。
优选的，培养条件选择静止不灭菌。
优选的，中和剂采用Na2CO3。
优选的，培养过程中的氮源选择10种有机和无机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、乙酸铵、尿素。
更优选的，培养过程中的氮源选择4种有机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉。
实施例二：用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的菌群筛选
(1)高产乳酸菌群的富集筛选
取1mL新疆农家发酵酸奶样品加入无菌水至100mL，将混合物接种于种子培养基培养，培养液每隔12h以2％(V/V)的接种量接种于100mL含有50mL MRS培养基的西林瓶中传代1次，连续传代12次，得到发酵性能稳定的混菌。最后将发酵性能稳定的混菌接种于MRS培养基进行厌氧发酵。并对菌群进行保藏，各取0.6mL菌液，加入0.3mL 60％甘油于-20℃冰箱内保存。
(2)光度法测定乳酸产量
校准曲线的构建：将已知浓度(89％，ρ＝1.2g/mL)的乳酸(1.2g)置于10mL容量瓶中，用水稀释。得到x浓度为89g/L乳酸的储备液。用两倍稀释液从储备液中制备一系列乳酸溶液。制备氯化铁(III)(0.2％)溶液，将氯化铁(III)(0.3g)置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，并搅拌至盐完全溶解。溶液的室温必须为25±5℃。
用离心法从菌液中分离培养液，上清液用去离子水稀释10倍，将稀释过的上清液(25μL)添加到1mL 0.2％氯化铁(III)溶液中，搅拌并在390nm处相对于对照溶液(1mL0.2％FeCl3溶液)测量吸光度。采用酶标仪测定样品中的乳酸，使用校准曲线计算乳酸浓度，考虑到试验样品的10倍稀释度。
(3)菌群丰度分析
以高产乳酸的菌群为样本，送样至测序公司进行高通量测序。
(4)测定结果
对12个酸奶样品富集得到的菌群传代培养，并对其传代过程中的乳酸产量进行测定。测定结果显示，在MRS培养基中传代过程中B2产乳酸量明显高于其他十个菌群。具体参见附图1。
通过对富集得到的部分菌群进行测序，B2菌群与其他乳酸产量不高的菌群在菌种组成上有很大差异，并测定B2菌群中主要为Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)和Lactobacillus hilgardii(希尔加德乳杆菌)，活菌数比例为1:9。具体参见附图2。证实了采用的B2菌群作为用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，其菌种组成实际上就是以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)作为绝对优势菌组成。采用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)两株菌均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)德等公众渠道获得，本发明涉及的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)两株菌通过自行筛选获得，经鉴定属于常规菌株。
实施例三：培养时间对用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂菌群产酸性能的影响
基于上述实施例一至实施例二，按2％的体积比将B2菌群接种至装有100g/L糖蜜浓度的CSLP培养基锥形瓶中培养，分别测定12、24、36、48、60、72h培养液中乳酸及总酸产量。
以2％的接种量将B2菌群接种至100g/L的CSLP培养基中，37℃静置培养，培养时间对菌群产酸的影响参见附图3所示。在培养过程中，随着时间的增加培养液中产酸量逐渐增加，在48h时菌群产乳酸量和总酸量达到了最高值；培养超过48h后，培养液中酸产量逐渐减少。因此得出两个菌群的最适产酸时间为48h。
实施例四：不同糖蜜浓度对用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂菌群发酵产酸的影响
基于上述实施例一至实施例二，微生物菌群经种子培养基培养后，按2％的体积比接种至装有CSLP培养基锥形瓶中培养，糖蜜浓度分别为100g/L-500g/L，5个浓度梯度，发酵培养基不灭菌。并对微生物菌群发酵各浓度糖蜜时的菌群丰度变化，产酸，蔗糖消耗量进行分析。
以2％的接种量将B2菌群接种至100-500g/L的CSLP培养基中，培养基不调pH，37℃静置培养48h，测定培养48h菌液中乳酸产量，总酸产量及蔗糖剩余量，糖蜜浓度对菌群产酸的影响参见附图4所示。随着培养基中糖蜜浓度的增加，菌群的总酸及乳酸产量在不断升高，B2菌群的乳酸和总酸产量在400g/L时达到最高值，超过400g/L后，总酸和乳酸产量均下降，说明400g/L是B2菌群耐受的最大糖蜜浓度，高于400g/L后，其生长及产酸能力均受到抑制。培养48h后菌液中的蔗糖剩余量参见附图5所示，其中培养基糖蜜浓度为100g/L时，B2的蔗糖剩余量还很多，不能完全利用；100g/L以上的糖蜜浓度时，B2菌群均不能完全利用培养基中的糖蜜，因此100g/L时B2菌群利用糖蜜产酸的利用率要高于其他组，所以后续试验中采用100g/L糖蜜浓度进行发酵产酸。
实施例五：不同培养条件对用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂菌群发酵产酸的影响
基于上述实施例一至实施例二，微生物菌群经CSLP培养基活化后，按5％的接种量接种至装有50mL CSLP培养基的锥形瓶中，初始糖蜜中浓度为上面试验中得到的最适浓度。发酵操作条件分3种，灭菌，静置；灭菌，摇瓶；不灭菌发酵；不灭菌，摇瓶。
采用不同培养条件，以100g/L的糖蜜浓度对菌群进行培养，分别对培养基及培养方式进行试验，筛选最适培养条件，各个培养条件的产酸量参见附图6所示。四种发酵操作条件下，B2菌群在灭菌情况下总酸和乳酸的产量明显高于不灭菌培养基。因此后续实验中菌群的发酵培养均采用静置培养且培养基不灭菌。
实施例六：不同中和剂对用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂菌群发酵产酸的影响
基于上述实施例一至实施例二，在乳酸的批式发酵过程中，伴随着菌体的生长，产物乳酸不断积累，会导致发酵液pH的降低，进而影响菌体生长代谢。为了解除这种抑制作用，发酵过程中通常会采用中和剂对pH进行调控，一般利用NaOH溶液、Na2CO3溶液和Ca(OH)2等调节发酵液的pH。
通过前期试验，对中和剂添加的量进行预测，将菌液pH4调至pH7时所需的中和剂的量如表1所示。在100g/L的CSLP培养基中以2％的接种量接种B2菌群，培养基不灭菌，静置37℃，在培养12h时，向其中加入中和剂，以不加任何中和剂的培养液为对照组，测定培养72h后各菌群产酸差异，结果参见附图7所示。与对照组相比，B2菌群加入3mL Na2CO3菌液产乳酸及总酸量明显高于对照组，其乳酸和总酸产量明显升高。
表1：50mL菌液所需各种中和剂量
| 中和剂 | 中和剂浓度 | 加入量(50ml菌液) |
| NaOH | 2mol/L | 3ml |
| Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> | 2mol/L | 3ml |
| Ca(OH)<sub>2</sub> | 提纯 | 0.3g |
实施例七：不同氮源对用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂菌群发酵产酸的影响
基于上述实施例一至实施例二，为测定高产乳酸的菌群利用10种含氮化合物作为氮源的能力，选择了10种有机和无机氮源，分别是酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、乙酸铵、尿素。每种氮源均以5g/L的终浓度与糖蜜培养基混合，菌种按照2％接种量接种于各种氮源培养基中，初始培养基为空白对照，37℃厌氧培养24h后观察，菌落生长者记为阳性，不生长的记为阴性，发酵结束后对代谢物进行初步分析。
将B2菌群活化后接种到不同的氮源培养基中，培养后测定其发酵产酸特性。菌群对不同氮源的利用见表2，菌群可较好利用营养丰富的有机氮源，同时也可利用无机氮源。利用各种氮源发酵产酸情况参见附图8，可见B2菌群对有机及无机氮源均能有效利用，无机氮源与有机氮源对菌群产乳酸的作用效果类似，但对总酸生产效率的影响上，无机氮源与有机氮源相比，生产总酸效果较差。
表2：菌群对氮源利用情况
| 氮源 | 利用情况 | 氮源 | 利用情况 |
| 酵母粉 | + | 氯化铵 | + |
| 牛肉膏 | + | 硝酸钾 | + |
| 蛋白胨 | + | 硫酸铵 | + |
| 玉米浆干粉 | + | 乙酸铵 | + |
| 硝酸铵 | + | 尿素 | + |
基于上述实施例一至实施例六中的记载，本研究筛选得到的菌群B2，即为用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)组成，活菌数比例为1:9，菌群活菌数维持在108-109cfu/ml。采用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)两株菌均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)德等公众渠道获得。两种菌均能高效利用糖蜜作为碳源、玉米浆干粉等作为氮源的培养基产酸。其中，B2菌群，即按2％的体积比将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillushilgardii)混合菌群培养基不调pH、不灭菌，静置37℃培养的条件下利用100g/L糖蜜培养基发酵，最终总酸浓度为83.42g/L，乳酸浓度为34.52g/L；添加中和剂后，B2菌群在中和剂Na2CO3的作用下总酸和乳酸产量均能得到明显提高，其他酸化剂作用效果不明显
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，其特征在于，所述的复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)组成。
2.如权利要求1所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂，其特征在于，所述的复合发酵菌剂由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillushilgardii)按照1:9的活菌数比例复配，复合发酵菌剂活菌数维持在108-109cfu/ml。
3.如权利要求1所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，按2％的体积比将副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和希尔加德乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)混合菌群接种至装有100g/L-500g/L糖蜜浓度的CSLP培养基锥形瓶中培养，培养时间为12-72h，培养过程中加入中和剂，进行发酵制备获得酸化剂应用饲料。
4.如权利要求3所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的糖蜜浓度采用100g/L。
5.如权利要求3所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的培养时间为48h。
6.如权利要求3所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的培养条件选择静止不灭菌。
7.如权利要求3所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的中和剂采用Na2CO3。
8.如权利要求3所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的培养过程中的氮源选择10种有机和无机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硫酸铵、乙酸铵、尿素。
9.如权利要求8所述的用于饲料酸化剂制备的复合发酵菌剂的应用，其特征在于，所述的培养过程中的氮源选择4种有机氮源，分别为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉。
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|---|---|---|---|---|
| CN115466704A (zh) * | 2022-11-02 | 2022-12-13 | 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 | 一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌群方法 |
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| CN101613667A (zh) * | 2009-07-23 | 2009-12-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一种制备l-乳酸的方法及其专用菌剂 |
| CN103547670A (zh) * | 2011-05-16 | 2014-01-29 | 有机平衡医疗股份公司 | 新的乳酸菌和含有其的抗细菌性感冒的组合物 |
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