CN104762250B - 一种利用木质纤维素水解液生产益生菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木质纤维素水解液在提高凝结芽孢杆菌的芽孢形成率和/或芽孢浓度方面的应用，以及一种利用木质纤维素水解液生产凝结芽孢杆菌的方法。具体是采用农林生物质原料，利用1～4% H₂SO₄，在105～130℃下高温水解，获得的木质素水解液通过Ca(OH)₂脱毒处理后，作为碳源按照一定的比例添加到凝结芽孢杆菌的发酵培养基中，能显著提高芽孢形成率和芽孢的浓度，芽孢的浓度最高可达到2.5×10¹¹cfu/mL，是目前国内外生产水平的5～10倍。本发明利用农林木质纤维素原料能显著提高益生菌凝结芽孢杆菌的芽孢产量，原料易获取且成本低廉，生产工艺简单，具有较好的推广应用价值。

Description

一种利用木质纤维素水解液生产益生菌的方法

技术领域

本发明属于益生菌生产技术领域。更具体地，涉及一种利用木质纤维素水解液生产益生菌的方法。

背景技术

抗生素在动物饲料中滥用，引起耐药菌出现及抗生素的残留，这些都极大的威胁到人类的健康。自1929 年英国的 Fleming 发现了抗生素以来，给人类的生产、健康做出了巨大的贡献。在饲料中添加抗生素对预防动物疾病、促进动物生长、提高饲料转化率、提高畜禽产品产量等方面发挥了积极的作用。但是饲用抗生素的过量使用也引起了种种弊端，如导致肠道菌群的动态平衡被破坏，无论是治疗剂量还是残留剂量的抗生素，都会破坏肠道菌群固有的定植力，即包括致病菌也包括有益菌，抗生素杀灭肠内原有条件性致病菌的同时，也造成了肠源性感染的条件；同时，抗生素（尤其是人类常用抗生素）的长期使用，还会导致病源菌产生耐药性及动物体内的药物残留，使机体免疫力下降，增多了机体受感染的机会如导致动物胃肠道正常菌群失调，产生耐药性和药物残留等副作用，给动物和作为动物产品消费者的人类的健康都带来了严重危害。2006年，欧盟已经全面禁止了饲料中抗生素的使用，美国和日本等国家也对其做出了严格的限制。韩国全国禁止在动物饲料中添加抗生素，我国政府也在制定相关法规禁止在动物饲料中添加抗生素。

益生菌作为替代饲用抗生素，越来越受到人们的关注。益生菌以其对动物无致畸和不良反应，并在疾病防治和促生长上表现出的优良特性成为可替代抗生素的绿色添加剂之一。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂，益生菌的作用效果主要表现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。乳酸菌是其中应用最广的菌种之一。乳酸菌能够调节肠道微生物区系的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长和发育，被广泛地应用于食品、医疗、保健、畜牧业和水产等行业。但是一般乳酸菌对环境的抗逆性差，耐高温、抗加工能力较差，特别是抗胃酸能力弱、能活着进入肠道的乳酸菌的种类和数量为数不多，因此，乳酸菌活菌制品普遍存在着保存性差、失活等缺点。

近年来，凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）作为一种益生菌在食品、医疗、保健、畜牧业和水产等行业具有广泛的应用价值，已经成为研究的热点。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）是一类能形成芽孢的产乳酸细菌，呈杆状，两端钝圆，革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。最适生长温度为45～50℃，最适pH值为6.6～7.0。其能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。它除了具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡，刺激免疫，提高机体健康水平，提高人和动物消化功能等作用外，同时还具有普通乳酸菌所不具备的环境抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性，被美国食品与药物管理局（FDA）和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全微生物菌种名单。凝结芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保藏，复活率高，芽孢是制备芽孢杆菌制剂的理想存在形式。而且凝结芽孢杆菌作为一种微生态制剂得到广泛的应用，决定活菌数高低和有效期长短的主要因素是产品中活菌产生的芽孢数量多少。芽孢形成率高，活菌就多且保存时间长，有效期也随之延长。制备凝结芽孢杆菌制剂关键要有两点：一是高密度的菌体细胞；二是较高的芽孢生成率。芽孢的形成一般认为是在生长后期，由于外源营养物质缺乏引起的，营养丰富的培养基往往很难长出芽孢。如何使芽孢杆菌既能在营养物质丰富的培养基生长，以获得较高的活菌数目，同时又能有较高的芽孢生成率，这是研究工作的一个难点所在。将发酵成本降低，简化生产工艺，是实现工业化生产主要考虑的因素之一。

目前，国内外不少研究者进行这方面的研究。Subhasish Das获得的凝结芽孢杆菌芽孢浓度为1.5×10⁷cfu/mL。崔东良等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵培养基，芽孢浓度达到9.3×10⁹cfu/mL，Ramkrishna Sen等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵条件，芽孢浓度达3.9×10⁹cfu/mL，葛风清等对凝结芽孢杆菌AHU1366的发酵培养基和培养条件进行了研究，摇瓶培养56h，芽孢形成率为80%；刘馨磊、戚薇等分别用补料分批法和中空纤维膜过滤法高密度培养凝结芽孢杆菌，芽孢率为26.7%和75%，最终芽孢浓度为1.2×10⁹cfu/mL和1.2×10¹⁰cfu/mL；陈秋红等对凝结芽孢杆菌JSSW-LA产芽孢的发酵条件进行优化，获得芽孢数为5.8×10¹⁰ cfu/mL。上述这些方法使凝结芽孢杆菌芽孢浓度得以有效提高，芽孢浓度数量级一般都在10⁹～10¹⁰ cfu/mL，但是很难再有所提高，而且发酵周期比较长，芽孢的形成率低，发酵培养基的主要原料是葡萄糖、酵母膏或蛋白胨等精细原料，发酵生产成本较高，有些发酵工艺较复杂。总而言之，目前凝结芽孢杆菌的发酵生产中，芽孢转化率不高、芽孢浓度低、生产工艺复杂及使用高成本的发酵培养基，这些都限制了凝结芽孢杆菌制剂的大规模的生产和应用，需要突破这个瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有凝结芽孢杆菌制剂大规模生产技术的缺陷和不足，提供一种能够提高凝结芽孢杆菌发酵过程中芽孢形成率/或芽孢浓度的方法。

本发明的目的是提供木质纤维素水解液在提高凝结芽孢杆菌的芽孢形成率/或芽孢浓度方面的应用。

本发明另一目的是一种利用木质纤维素水解液生产益生菌（凝结芽孢杆菌）的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了木质纤维素水解液在提高凝结芽孢杆菌的芽孢形成率和/或芽孢浓度方面的应用。所述应用的方法是凝结芽孢杆菌以木质纤维素水解液为碳源进行发酵。

其中，所述木质纤维素水解液是由农林生物质原料经过1～4% 的硫酸105～130℃水解处理1～2h后，真空抽滤，滤液再经Ca(OH)₂脱毒处理获得。

所述农林生物质原料是水稻秸秆、玉米秸秆、木屑、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳或麸皮中一种或几种。

优选地，所述农林生物质原料是水稻秸秆。

本发明还提供了一种利用木质纤维素水解液生产凝结芽孢杆菌的方法，步骤如下：

S1.利用农林生物质原料制备木质纤维素水解液；

S2.将木质纤维素水解液加入到凝结芽孢杆菌发酵培养液中，接种凝结芽孢杆菌进行发酵；木质纤维素水解液的用量占加入木质纤维素水解液后发酵培养液总量的10～50v/v%，优选为20 v/v%；

步骤S2所述发酵培养液不含其它碳源，仅以木质纤维素水解液作为碳源。

其中，步骤S1所述农林生物质原料是水稻秸秆、玉米秸秆、木屑、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳或麸皮中一种或几种。优选地，所述农林生物质原料是水稻秸秆。

其中，步骤S1所述木质纤维素水解液是由农林生物质原料经过1～4% 的硫酸105～130℃水解处理1～2h后，真空抽滤，滤液再经Ca(OH)₂脱毒处理获得。具体制备方法如下：

S11.将农林生物质原料粉碎至粉状（粒径＜0.05mm），按固液比10g：100mL的比例（即固液比10%（g/mL）），将粉碎后的农林生物质原料与1～4%的硫酸混合，在105～130℃下反应1～2h后真空抽滤，得滤液；

S12.向S11得到的滤液中加入Ca(OH)₂，调节溶液pH至9.0～10.0，沉降1h后抽滤抽取滤液（Ca(OH)₂的加入量不固定，使得滤液的pH变为9～10即可）；

S13.用2M H₂SO₄将S12得到滤液的pH调至6.0，静置1h后抽滤抽取滤液。

另外，步骤S2所述发酵培养液的配方为：磷酸氢二钾2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁2 g/L，三氯化铁0.28 g/L，硫酸铵0.6 g/L，酵母膏0.8 g/L，pH7.0～7.4；（使用时，再加入木质纤维素水解液）；

步骤S2所述接种凝结芽孢杆菌进行发酵的具体步骤为：

S21.种子液培养：将斜面菌种挑入到灭菌的种子培养基（装液量100mL/250mL三角瓶）中，30℃、150rpm振荡培养24h，发酵液即为种子液；所述种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；

S22.发酵培养：将种子液按2v/v%的比例接种到添加有木质纤维素水解液的发酵培养液中，30℃、180rpm振荡培养24h。

现有技术中不仅凝结芽孢杆菌制剂大规模生产技术存在上述的缺陷和不足，同时，木质纤维素原料是地球上最丰富，也是相当廉价的可再生资源。全世界每年通过光合作用产生的木质纤维素生物质高达1000亿吨，其中 89%未被人类利用。我国是农业生产大国，拥有丰富的秸秆纤维素原料，农作物秸秆每年就产生 7 亿多吨，其中玉米秸秆，小麦秸秆和稻秆是我国的三大秸秆，再加上数量巨大的林业纤维废料和工业纤维废渣，每年可利用的木质纤维素原料总量可达20亿吨以上。长期以来，仅仅通过简单的燃烧来利用蕴藏于木质纤维素中的能量，因而造成了资源的极大浪费。

本研究通过利用农林木质纤维素原料（水稻秸秆、玉米秸秆、木屑、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳、麸皮），通过1～4%的稀硫酸在105～130℃下水解1～2h，Ca(OH)₂处理，获得的水解液按照10～50%（v/v）添加到发酵培养基中，培养24小时，获得芽孢浓度达到了1.3x10¹⁰～2.5 x10¹¹cfu/mL。其中综合各因素条件，最优条件为：以水稻秸秆为农林生物质原料，2%的稀硫酸，121℃下，水解1.5h得到的水解液，按20%(v/v)添加到发酵培养基，30℃，180rpm振荡培养24h，获得芽孢浓度最高，达2.5x10¹¹cfu/mL，芽孢形成率95%以上。

本发明通过反复大量的实验和研究，获得了上述不需要添加糖，只添加木质纤维素原料酸水解液作为碳源，就能促使益生菌凝结芽孢杆菌大量产生芽孢的方法，使芽孢的密度达到了10¹¹cfu/mL数量级以上水平，是目前国内外生产水平的5～10倍，为国内外先进水平。而且秸秆等生物质属于农林生物质原料，价格便宜且容易获得，处理工艺简单，同时也为废物的综合利用打下基础。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了木质纤维素水解液在提高凝结芽孢杆菌的芽孢形成率和/或芽孢浓度方面的应用，以及一种利用木质纤维素水解液生产凝结芽孢杆菌的方法。具体是采用农林生物质原料，利用1～4% H₂SO₄，在105～130℃下高温水解，获得的木质素水解液通过Ca(OH)₂脱毒处理后，作为碳源按照一定的比列添加到凝结芽孢杆菌的发酵培养基中，能显著提高芽孢形成率和芽孢的浓度，芽孢的浓度达到了10¹¹cfu/mL数量级以上水平（最高可达到2.5×10¹¹cfu/mL），是目前国内外生产水平的5～10倍，为国内外先进水平。为凝结芽孢杆菌的扩大应用，尤其是作为添加剂替代饲用抗生素大规模的应用提供了技术保障和坚实的理论基础。

同时，本发明的方法不需要添加糖，只添加木质纤维素原料酸水解液作为碳源，就能显著提高益生菌凝结芽孢杆菌的芽孢产量，各种秸秆等农林生物质原料易获取且成本低廉，能降低培养基成本，处理生产工艺简单，同时也为废物的综合利用打下基础，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为不同木质素原料的酸水解液的还原糖和酚类化合物浓度。

图2为不同的木质素原料对产芽孢的影响。

图3为添加水稻秸秆水解液的凝结芽孢杆菌产芽孢曲线图。

图4为添加不同的水解液量对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。

图5 不同浓度的硫酸获得的水解液对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。

图6为不同水解温度下获得的水解液对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。

图7为不同水解时间下获得的水解液对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

本发明实施例所用凝结芽孢杆菌为本实验室（华南师范大学生命科学学院微生物与生物工程实验室 ）保存。

所用主要试剂：蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为广州环凯微生物科技有限公司试剂；葡萄糖，浓硫酸，氢氧化钙，氯化钠，硫酸铵，磷酸氢二钾，硫酸镁，琼脂均等为市购国产试剂；水稻秸秆、玉米秸秆、花生壳、木屑、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳购于广州。

斜面培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基。

种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

发酵培养液：磷酸氢二钾2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁2 g/L，三氯化铁0.28g/L，硫酸铵0.6 g/L，酵母膏0.8 g/L，pH7.0～7.4。（发酵时加入10～50 v/v %木质纤维素水解液）。

所用主要仪器：生化培养箱；高压蒸汽灭菌器；恒温培养摇床；循环水真空泵；恒温水浴锅；电子分析天平；冰箱；超净工作台。

实施例1利用木质纤维素水解液生产凝结芽孢杆菌

1、木质纤维素水解液的制备

（1）将农林生物质原料（木质纤维素原料：水稻秸秆、玉米秸秆、花生壳、木屑、甘蔗渣、核桃壳、米糠或麸皮）用粉碎机粉碎至粉状（粒径＜0.05mm），按固液比10%（g/mL），将粉碎后的农林生物质原料与1～4%的硫酸混合，在105～130℃下反应1～2h后真空抽滤，得滤液；

（2）使用Ca(OH)₂对滤液进行脱毒处理：向（1）得到的滤液中加入Ca(OH)₂，调节溶液pH至9.0～10.0，沉降1h后抽滤抽取滤液；

（3）用2M H₂SO₄将（2）得到滤液的pH调至6.0，静置1h后抽滤抽取滤液。滤液冷藏放置待用。

2、种子液培养

将斜面菌种挑入到灭菌的种子培养基中，30℃，150rpm，装液量100ml/250ml三角瓶中，恒温摇床振荡培养24小时，发酵液作为种子液。

3、发酵培养

将种子液按2%（v/v）接入到添加有木质纤维素水解液的发酵培养液中，30℃，180rpm，振荡培养24小时，测定活菌总数和芽孢总数。

4、活菌总数测定

发酵液稀释后，以倾注法（黄文芳等《微生物学实验指导》）进行活菌计数。

5、芽孢浓度的测定

菌液于80℃水浴加热10min，杀死营养体细胞，稀释后采用倾注法进行活菌计数。芽孢形成率计算公式：芽孢形成率=芽孢数/活菌数×100%.

6、实验结果显示，木质纤维素原料通常需要经过水解才能被微生物所利用。一般地，木质纤维素中的纤维素与半纤维素成分首先会被降解为多聚糖，而随后这些多聚糖又被降解为相应的六碳糖或者五碳糖。稀酸水解可以迅速地降解木质纤维素中的半纤维素成分而得到大量的木糖与少量的六碳糖，如葡萄糖、甘露糖、与半乳糖等，这些单糖都可以作为碳源用于微生物发酵。

经过上述方法制备的木质纤维素水解液作为碳源，用于凝结芽孢杆菌的发酵生产时，不仅能够很好的用于凝结芽孢杆菌的发酵，而且还能够显著地提高芽孢形成率和芽孢的浓度。

而且，木质纤维素水解液的制备条件，包括农林生物质原料的种类、硫酸的浓度及用量、水解温度及时间等等，以及木质纤维素水解液的用量等都会对发酵结果产生影响，具体的结果和分析见下述各实施例。

实施例2不同农林生物质原料对凝结芽孢杆菌产芽孢的影响

1、不同种类农林生物质原料（木质纤维素原料）的化学组成不同，酸水解后产生的五碳糖、六碳糖和其他的化学组分的种类和含量也不相同。本研究选用一些常见且数量大的纤维木质素原料（水稻秸秆、玉米秸秆、花生壳、木屑、甘蔗渣、核桃壳、米糠、麸皮），在121℃，2%的稀硫酸水解1.5h后，经过Ca(OH)₂脱毒等处理（同实施例1），得到的水解液。

2、测定水解液的还原糖和酚类物质含量。还原糖按照斐林法测定（吴国峰等《工业发酵分析》），酚类物质按照福林-酚比色法测定（李巨秀等《福林-酚比色法测定桑椹中总多酚》）。

结果如附图1所示，从图1中可以看出，水稻秸秆水解液的还原糖的浓度最高，为78.2g/L，其酚类化合物的浓度为14.3g/L。麸皮水解液还原糖浓度最低，只有27.6g/L。酚类化合物浓度玉米秸秆最高，达到17.3g/L。

3、按照占液体总量20%（v/v）的体积比，将水解液加入到发酵培养液中灭菌，接种凝结芽孢杆菌，30℃、180rpm振荡培养24h，测定芽孢浓度。

芽孢是某些细菌在其生长后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，芽孢具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等一些特殊的性质。培养基成分是影响芽孢形成的重要因素。芽孢的形成是一个极其复杂的过程，一般来说，营养缺乏或C、N、P元素不足时，细菌生长减速，启动芽孢形成基因，引起营养体形成芽孢，生长环境中的一些化学物质也会刺激菌体生成芽孢。纤维木质素酸水解液中含有五碳糖和六碳糖以及各种酸、醛、酚等化学物质，糖是微生物所必须的碳源，对菌体细胞的生长以及转化为芽孢都有着重要的影响。各种酸、醛、酚等抑制物会抑制菌体细胞的生成，但同时也会促进芽孢的生成。

本实施例实验的测定结果如附图2所示，添加了纤维木质素原料酸水解液后，培养的芽孢浓度都较高，都达到了3.7×10¹⁰cfu/mL以上，其中芽孢浓度最高的是添加水稻秸秆水解液的实验组，芽孢浓度达到了2.5×10¹¹cfu/mL，因此选择水稻秸秆为最优选的农林生物质原料。

以下实施例实验均以水稻秸秆为对象进行实验。

实施例3 凝结芽孢杆菌产芽孢曲线

如实施例2所述，添加水稻秸秆酸水解液能有效提高芽孢的产量，水稻秸秆酸水解液按照20%（v/v）添加比例，按照实施例2的方法进行培养48h，不同时间进行取样，测定芽孢数和芽孢形成率。

结果如附图3所示，12小时芽孢形成率达到51%，24小时就到了产芽孢的高峰期。芽孢形成率为95%，芽孢数为2×10¹¹cfu/mL。不添加木质素水解液的培养基产芽孢的高峰一般要48h左右。添加木质素水解液能显著地缩短凝结芽孢杆菌产芽孢的时间，提高芽孢的形成率。

实施例4 添加不同量的水解液对产芽孢的影响

发酵液中含不同体积的木质纤维素水解液，糖的含量及水解后产生的各种化学物质的量也不同，这些都会对营养体及芽孢的生成造成影响。按照10～50mL水稻秸秆水解液/100mL发酵培养基总量的量添加水解液，发酵培养后测定芽孢浓度。

结果如附图4所示，随着水稻秸秆水解液用量体积的增加，芽孢数和芽孢生成率也在增加，添加20%（v/v）水解液，芽孢浓度达到最高。进一步提高水解液的浓度，芽孢浓度反而持续降低。

实施例5 不同浓度硫酸获得的木质纤维素水解液对产芽孢的影响

不同浓度的稀硫酸对纤维木质素原料进行水解，获得的水解液的糖类、各种化合物的种类和浓度会有所差别，对菌体产芽孢会有所影响。浓度为1～4%的稀硫酸在温度为121℃水解水稻秸秆1.5h，获得的水解液，按20v/v%的量添加到发酵培养基中，进行发酵培养，测定芽孢数量。

结果如附图5所示，不同的硫酸浓度对木质素的水解会产生不同的影响，水解的程度会发生变化，产生的五碳糖和六碳糖的量不同，醛、酚等化学物质的浓度也不一样。稀硫酸的最佳浓度为2%。2%稀硫酸在121℃下高温酸水解1.5h，添加30%的水解液到培养基中，30℃，180rpm，培养24小时，发酵液中芽孢浓度为2.1×10¹¹cfu/mL。

实施例6 不同水解温度获得的水解液对产芽孢的影响

水解温度的变化也会造成水解程度的不同，从而影响到糖和其他水解生成物的种类和浓度。改变水解温度（105～130℃），其他的同上，进行发酵培养，测定芽孢浓度。

结果如附图6所示，随着水解温度的升高，芽孢的浓度也增加，在120℃左右达到最高。水解温度继续增加，芽孢的浓度有所下降。

实施例7 不同水解时间获得的水解液对产芽孢的影响

水解时间的变化对水解液成分和浓度也有一定影响，本实施例考察不同水解时间获得的水解液对凝结芽孢杆菌产芽孢，水解时间为0.5～3h，温度121℃，其他的条件同上，发酵培养，测定芽孢浓度。

结果如附图7所示，随着水解液的水解时间增加，芽孢的浓度也增加，在1.5～2h达到最高峰。

Claims (6)

1.木质纤维素水解液在提高凝结芽孢杆菌的芽孢浓度方面的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液是由农林生物质原料经过1～4%的硫酸105～130℃水解处理1～2 h后，真空抽滤，滤液再经Ca(OH)₂脱毒处理获得，所述农林生物质原料是水稻秸秆、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳或麸皮中一种或几种。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用的方法是凝结芽孢杆菌以木质纤维素水解液为碳源进行发酵。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述农林生物质原料是水稻秸秆。

4.使用权利要求1所述木质纤维素水解液提高凝结芽孢杆菌芽孢浓度的方法，其特征在于，步骤如下：

S1.利用农林生物质原料制备木质纤维素水解液；

S11.将农林生物质原料粉碎至粉状，按固液比10g：100mL的比例，将粉碎后的农林生物质原料与2%的硫酸混合，在121℃下反应1.5 h后真空抽滤，得滤液；其中，所述农林生物质原料是水稻秸秆、米糠、甘蔗渣、花生壳、核桃壳或麸皮中一种或几种；

S12.向S11得到的滤液中加入Ca(OH)₂，调节溶液pH至9.0～10.0，沉降1h后抽滤抽取滤液；

S13.用2M H₂SO₄将S12得到滤液的pH调至6.0，静置1h后抽滤抽取滤液；

S2.将木质纤维素水解液加入到凝结芽孢杆菌发酵培养液中，接种凝结芽孢杆菌进行发酵；木质纤维素水解液的用量占加入木质纤维素水解液后发酵培养液总量的10～50v/v%；

步骤S2所述发酵培养液不含其它碳源，仅以木质纤维素水解液作为碳源。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1所述农林生物质原料是水稻秸秆。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2所述发酵培养液的配方为：磷酸氢二钾2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁2 g/L，三氯化铁0.28 g/L，硫酸铵0.6 g/L，酵母膏0.8 g/L，pH7.0～7.4；

步骤S2所述接种凝结芽孢杆菌进行发酵的具体步骤为：

S21.种子液培养：将斜面菌种挑入到灭菌的种子培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，发酵液即为种子液；所述种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；

S22.发酵培养：将种子液按2v/v%的比例接种到添加有木质纤维素水解液的发酵培养液中，30℃、180rpm振荡培养24h。