CN110592047B - 一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的新方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体涉及一株梨囊鞭菌及其发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的方法和应用。本发明公开了一种公开了梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的方法，所述的梨囊鞭菌Piromyces CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.18141。本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1可以通过保藏在体外传代存活，发酵秸秆可产生高活性的阿魏酸酯酶，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。

Description

一种梨囊鞭菌发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的新方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种厌氧发酵羊草生产阿魏酸酯酶的方法。

背景技术

羊草是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一，分布在从北纬36°到北纬62°，东经120°到132°的广泛范围内，中国境内约占一半以上。羊草在寒冷、干燥地区生长良好，春季返青早，秋季枯黄晚，能在较长时间内提供较多的青饲料，每年伴随产生的数量也是非常巨大的。羊草为能源物质没有得到合理开发利用。现有的厌氧消化技术存在技术效率低，推广难度大的问题。

木质纤维素是羊草的主要成分，木质纤维素的水解是整个厌氧消化中的限速步骤，也是技术难点。木质纤维素素生物质主要由纤维素、半纤维和木质素组成，木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，这些强的化学键抑制水解酶的作用。因此，需要对木质纤维素进行预处理。常见的预处理木质纤维素方法有机械法、热处理法、化学处理，这些都能有效促进厌氧消化，但这些预处理方法成本高，不环保。普通微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构件的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致预处理时间长，转化效率低，目前尚未有完备的方案进行羊草的厌氧发酵来生产阿魏酸酯酶。

犏牛是牦牛与黄牛杂交的一代种。分为犏牛(公)和犏乳牛(母)具有明显杂交优势，肉、乳生产能力、役用能力接近于牦牛。用野血牦牛冻精对农区西门塔尔牛进行杂交，其杂交后代就是犏牛，由于犏牛中含有50％野牦牛血液，具有较高的青藏高原环境适应能力。犏牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同代谢高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质，长期的自然选择和进化使犏牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，具有独特优势和高效的木质纤维素降解能力。

采用厌氧真菌处理羊草，是一个较新也较为有效的手段。发明人博士期间研究了牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌的共培养物以及厌氧真菌纯培养物以玉米秸秆、水稻秸秆和小麦秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及厌氧真菌纯培养物的降解秸秆的功效，其中高效降解三大秸秆的厌氧真菌纯培养物N.frontalisYak16、Piromyces Yak18 和O.joyonii Yak7分别降解三种秸秆所产生的阿魏酸酯酶活性都低于5mU，厌氧真菌纯培养物N.frontalis Yak16降解小麦秸秆所产生的阿魏酸酯酶达到最高活性是4.9mU。本发明从犏牛瘤胃中分离出来的厌氧真菌Piromyces CY1，以羊草为底物厌氧发酵生产阿魏酸酯酶，活性达到了30.1mU，取得了意想不到的效果。

发明内容

本发明中厌氧发酵使用的菌种，是从青藏高原的甘肃天祝乌鞘岭牧场全放牧犏牛瘤胃内容物中分离的梨囊鞭菌纯培养物Piromyces CY1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.18141，保藏日期为2019.7.9，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类名为：梨囊鞭菌Piromyces CY1。

本发明提供了梨囊鞭菌纯培养物Piromyces CY1厌氧发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的方法，具体包括如下步骤：

(1)Piromyces CY1纯培养物菌剂的制备

将Piromyces CY1纯培养物菌液以10％v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1％ w/v干燥粉碎的秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，置39℃厌氧培养72h即得到高活力菌剂。

(2)发酵生产阿魏酸酯酶

吸取步骤(1)制备的菌剂，按10％v/v接种量接入以1％w/v秸秆为底物的与步骤(1) 相同的液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，39℃厌氧培养7天。

优选的，所述的液体基本培养基配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃ 7.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，盐溶液II包括4g K₂HPO₄，蒸馏水定容至1000mL。

优选的，所述的步骤(1)中加入的秸秆为小麦秸秆。

优选的，所述的步骤(2)中加入的秸秆为羊草、水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆的任一种。

优选的，所述步骤(2)中加入底物后除氧，高温高压灭菌。

优选的，所述的符合抗生素为青霉素、硫酸链霉素和氯霉素，在发酵过程中添加复合抗生素，可防止共培养物体系不受细菌和甲烷菌污染，提高厌氧发酵效率。

优选的，所述的复合抗生素中青霉素和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为1600 IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基终浓度为50μg/mL。

本发明的有益效果是：①.本发明所公开的梨囊鞭菌Piromyces CY1发酵秸秆产阿魏酸酯酶的活性显著提高，尤其是以羊草为底物进行厌氧发酵，所产生的阿魏酸酯酶的活性为30.1 mU。②.本发明中采用的梨囊鞭菌可以通过保藏在体外存活传代，发酵羊草可产生高活性阿魏酸酯酶，且发酵工艺简单，对设备要求低，便于推广，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。③.通过天祝放牧犏牛瘤胃梨囊鞭菌厌氧发酵羊草可产生高活性阿魏酸酯酶，可进一步提高羊草的使用率，显著提高经济效益。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明所请求保护的技术方案进行说明，但本发明所请求保护的范围并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的厌氧培养基如下：

液体基本培养基的配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO₃ 7.0g，1.0g/L刃天青1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。

盐溶液I包括NaCl 6g，(NH₄)₂SO4 3g，KH₂PO₄ 3g，CaCl₂·2H₂O 0.4g，MgSO₄·2H₂O0.6g，蒸馏水定容至1000mL。

盐溶液II包括4g K₂HPO₄，蒸馏水定容至1000mL。

分离纯化培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆，然后除氧和灭菌。

琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L琼脂粉，然后除氧和灭菌。

秸秆培养基：在液体基本培养基中分别添加1％w/v的粉碎风干的羊草、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆，不加葡萄糖，然后除氧和灭菌。

传代培养基：在液体基本培养基中添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆，然后除氧和灭菌。

除氧方法：将液体基本培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO₂的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO₂。每管抽气充气3次，其中第1次约15min，其余 2次每次5min，最后1次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，然后于121℃高温高压湿热灭菌20min后备用。

实施例一、梨囊鞭菌Piromyces CY1菌剂的制备：

吸取1mL梨囊鞭菌Piromyces CY1培养物接种到20mL体积的亨氏厌氧管中以风干粉碎的0.1g小麦秸秆为底物的9mL液体基本培养基中，同时加入复合抗生素，使青霉素和硫酸链霉素在液体基本培养基的终浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL。39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。

实施例二、梨囊鞭菌Piromyces CY1厌氧发酵羊草生产阿魏酸酯酶

1.厌氧发酵羊草生产阿魏酸酯酶的方法

在100mL体积厌氧发酵瓶中盛90mL液体基本培养基，分别以1.0g粉碎风干的羊草、水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆为底物。除氧。灭菌。把传代培养72h的梨囊鞭菌PiromycesCY1用无菌注射器吸取10mL分别接种到上述加有羊草、水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆为底物的厌氧培养基中，同时加入复合抗生素，使其在厌氧培养基溶液的终浓度为青霉素1600IU/mL和硫酸链霉素2000IU/mL，氯霉素在培养基中的终浓度为50μg/mL，39℃厌氧培养7天。共设3个平行实验，隔24h测定发酵液的阿魏酸酯酶活性。

2.阿魏酸酯酶活性的测定方法

稀释粗酶液并置39℃预热15min，含100μM阿魏酸甲酯(Sigma Chemicals)的100mM3- (N-吗啉)丙磺酸(MOPS)溶液(pH 6.8)作为底物置39℃预热15min。在100μL粗酶液中加入200μL底物，39℃反应30min，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在340nm下检测反应0min和30min时的吸光值，根据阿魏酸及阿魏酸甲酯标准曲线计算阿魏酸酯酶活性。

1个酶活力单位U是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物阿魏酸甲酯中释放1μmol阿魏酸所需的酶量。

100mM MOPS缓冲液(pH 6.8)：称取5.2323g MOPS，溶于150mL去离子水中，用NaOH调pH至6.8，用去离子水定容至250mL。

实验结果显示，梨囊鞭菌Piromyces CY1降解羊草的同时产生高活性阿魏酸酯酶，显著高于以前文献报道的梨囊鞭菌降解各种秸秆等粗饲料所产阿魏酸酯酶的活性的10倍以上，也高于它降解小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆所产的阿魏酸酯酶的活性。具体结果如下表：

表7天培养期梨囊鞭菌Piromyces CY1降解羊草、小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆所产阿魏酸酯酶的活性

梨囊鞭菌Piromyces CY1培养物在7天内降解羊草产生的阿魏酸酯酶的活性达到最高值为30.1mU。

通过以上实施例我们可以看到，犏牛瘤胃梨囊鞭菌Piromyces CY1降解羊草的同时产生高活性的阿魏酸酯酶，在工业领域具有重要工业应用价值和开发前景。

Claims (7)

1.一种梨囊鞭菌（Piromycessp.）CY1 厌氧发酵秸秆生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述的方法具体包括如下步骤：

（1）梨囊鞭菌（Piromycessp.）CY1纯培养物菌剂的制备

将梨囊鞭菌（Piromycessp.）CY1纯培养物菌液以10 % v/v接种量接种到液体基本培养基中，加入1% w/v干燥粉碎的小麦秸秆作为底物，同时加入复合抗生素传代培养，厌氧培养即得到高活力菌剂；

（2）厌氧发酵秸秆生产阿魏酸酯酶

吸取步骤（1）制备的菌剂，按10% v/v接种量接入以1% w/v秸秆为底物的液体基本培养基中，加入复合抗生素厌氧培养；

所述的梨囊鞭菌（Piromycessp.）CY1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.18141。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体基本培养基配方为：酵母膏 1.0g，蛋白胨 1.0 g，NaHCO₃ 7.0 g，1.0 g/ L刃天青 1 mL，L-半胱氨酸盐1.7 g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20 min后的上清 170 mL，盐溶液 I 165 mL，盐溶液 II 165 mL，蒸馏水定容至1000 mL。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的盐溶液 I 包括 NaCl 6 g，(NH4)₂SO₄3 g，KH₂PO₄ 3 g，CaCl₂·2H₂O 0.4 g， MgSO₄·2H₂O 0.6 g，蒸馏水定容至1000 mL；所述的盐溶液 II 包括4 g K₂HPO₄，蒸馏水定容至1000 mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合抗生素为青霉素钠、硫酸链霉素和氯霉素；所述的青霉素钠和硫酸链霉素在厌氧培养基的终浓度分别为 1600 IU/mL和2000 IU/mL，所述的氯霉素在培养基终浓度为50 μg/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中加入的底物为小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆的任一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中加入的底物为羊草。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中加入秸秆底物后除氧，高温高压灭菌。