TWI695886B

TWI695886B - 芽孢桿菌屬菌種的培養基及其製備方法

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Publication number: TWI695886B
Application number: TW107133791A
Authority: TW
Inventors: 蔡濰安; 施雨伸; 翁崧夏; 邱品叡; 邱淑媛
Original assignee: 行政院農業委員會花蓮區農業改良場
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2020-06-11
Also published as: TW202012613A

Abstract

一種芽孢桿菌屬菌種的培養基，培養基成分包含有以重量百分比計為0.1％～5％的碳源、重量百分比0.5％～1.5％的氮源、重量百分比0.01％～0.5％的含鎂化合物以及水，或是再添加1％～30％的木屑萃取液，使用本發明培養基培養芽孢桿菌可增加芽孢桿菌屬菌種的生長分裂菌數、產孢菌量以及抗生活性，以蘇力菌為例：能促進蘇力菌的分裂生長而增加菌數，以及促進蘇力菌的產孢菌量，增加蘇力菌的菌數以及產孢菌量可提高殺死害蟲的效力。

Description

芽孢桿菌屬菌種的培養基及其製備方法

本發明係與一種芽孢桿菌屬菌種的培養基有關，特別是指一種用於培養蘇力菌、甲基營養型芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌的培養基。

已知長期使用化學農藥容易造成土質的酸化、水質的汙染以及生態的浩劫，不僅如此農藥亦會影響人類的健康，人體若食用殘留有農藥的作物會造成身體的負擔，嚴重地更導致中毒以及死亡，此外化學農藥的使用容易使病蟲害產生抗藥性，使得病蟲害越來越不容易被清除，所以近年來提倡生物防治法。生物防治法係利用病蟲害的天敵來達到防治病蟲害的目的，芽孢桿菌為其中一種生物防治法，芽孢桿菌不只可做為農藥亦可作為肥料，不同種的芽孢桿菌可防治不同的病蟲害。

以蘇力菌（ Bacillus thuringiensis）為例，蘇力菌為寄生細菌，在分類上又可依品系（strain）細分成庫斯蘇力菌（ Bacillus thuringiensis serovar kurstaki）、蘇力菌以色列亞種（ Bacillus thuringiensis israelensis）等，會寄生在鱗翅目類的幼蟲（例如：小菜蛾）、雙翅目類的幼蟲（例如：果蠅）以及鞘翅目類的幼蟲（例如：甲蟲類）等宿主的幼蟲體內。不同品系的蘇力菌會產生一種或多種的殺蟲晶體毒蛋白，不同的殺蟲晶體毒蛋白只會針對特定的昆蟲，對於目標以外的生物無害，所以被認為是安全的生物農藥。

蘇力菌的生長週期可分為營養期的細胞分裂期（vegetative cell division）、孢子時期（sporulation cycle）以及死亡期，當環境中養分不足或生長條件較嚴苛時，部分的蘇力菌就會傾向於進入孢子時期，蘇力菌於孢子時期會產生許多晶體毒蛋白，當晶體毒蛋白被以上所述種類的昆蟲攝食而進入腸道後，腸道中的胃液會活化晶體毒蛋白，活化的晶體毒蛋白會使宿主的腸道內壁受損甚至穿孔、破裂，繼而導致宿主因腸壁穿孔而死亡，已知只以晶體毒蛋白做為農藥其效果較不彰，所以以蘇力菌及其孢子以及晶體毒蛋白的形式作為農藥較佳。

芽孢桿菌中的枯草桿菌（ Bacillus subtilis）以及甲基營養型芽孢桿菌（ Bacillus methylotrophicus）又稱作土壤益生菌，喜歡生長在植物的根部的土壤中，稱作根際（rhizosphere）的區域，這些益菌不但會產生一些物質去抑制或是殺死其他也喜歡生長在根際的病原菌，還會分泌一些物質促進植物生長或是促進植物利用土壤的養份。

舉例來說，枯草桿菌會分泌表面活性素（surfactin）去抑制會引起萎凋病的尖鐮胞菌（ Fusarium oxysporum）的生長，而甲基營養型芽孢桿菌（ Bacillus methylotrophicus）可用來防治造成細菌性軟腐病害的細菌性軟腐病菌（ Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）。

已知的芽孢桿菌培養基尚有待改良的部分，其一係在使用已知的芽孢桿菌培養基培養蘇力菌後，其蘇力菌能造成小菜蛾死亡的比率為86.67％；其二係目前的芽孢桿菌培養基尚未能廣泛適用於多種芽孢桿菌，例如：既能用以培養蘇力菌亦能用以培養甲基營養型芽孢桿菌。

為提升蘇力菌殺死害蟲的效力，以及能適用於培養不同種的芽孢桿菌，增加芽孢桿菌的抗生活性，所以本發明人積極地研發培養基的配方。

本發明之目的在於提供一種芽孢桿菌屬菌種的培養基及其製備方法，以提升蘇力菌的菌數以及產孢量，還有其他種芽孢桿菌的抗病害活性或產孢量。

緣以達成上述目的，本發明提供的一種芽孢桿菌屬菌種的培養基，配方係於水中含有重量百分比0.1％～5％的碳源、0.5％～1.5％的氮源以及0.01％～0.5％的含鎂化合物，將上述配方充分混合後於120℃以上以及1.2 atm以上的環境下，滅菌15分鐘以上，即完成培養基。

本發明提供製備另一種芽孢桿菌屬菌種的培養基的方法，配方係於水中含有重量百分比0.1％～5％的碳源、0.5％～1.5％的氮源、1％～30％的木屑萃取液以及0.01％～0.5％的含鎂化合物，將上述配方充分混合後於120℃以上以及1.2 atm以上的環境下，滅菌15分鐘以上，即完成培養基。

本發明亦提供芽孢桿菌屬菌種的培養基的用途，其中該培養基用以培養的芽孢桿菌屬菌種，包含有蘇力菌、甲基營養型芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。

本發明之效果在於以本發明的培養基培養的蘇力菌，其產孢菌量以及菌數皆提高，使害蟲小菜蛾死亡的比率達到96.67％；以本發明的培養基培養的甲基營養型芽孢桿菌或是枯草桿菌，能增強甲基營養型芽孢桿菌或是枯草桿菌的抗生活性，且本發明的培養基在成本上相較於已知的培養基每一槽能減少2／3的金額。

為能更清楚地說明本發明，茲舉較佳實施例並配合圖表詳細說明如後。

本發明的芽孢桿菌屬菌種的培養基，溶劑為水，其中又以逆滲透水為佳，於逆滲透水中加入以重量百分比計為0.1％～5％的碳源、0.5％～1.5％的氮源以及0.01％～0.5％的含鎂化合物，其中碳源為糖蜜、澱粉或葡萄糖，氮源為活性酵母、肉骨粉或上述兩者的組合物。前述培養基係具備可提升蘇力菌的菌數以及產孢量，還有其他種芽孢桿菌的抗病害活性之效。

以下說明可用以製備上述培養基的方法如後。其中圖１所示方法步驟係可製備出培養基A，圖２所示方法步驟係可製備出培養基B。

培養基A的碳源以糖蜜為例，含鎂化合物以硫酸鎂為例，硫酸鎂的重量百分比以0.01％～0.1％為佳，另外氮源係由活性酵母以及肉骨粉所組成，且活性酵母與肉骨粉的重量百分比為1：1。

請配合圖１所示，將0.1％～5％的糖蜜、0.25％～0.75％的活性酵母、0.25％～0.75％肉骨粉以及0.05％硫酸鎂加入逆滲透水中，使用攪拌器或是震盪器將以上所述原料混合均勻，於實務上亦可使用其他方式將上述材料混合均勻，例如：均質機。當糖蜜、活性酵母以及硫酸鎂完全溶解於水中且肉骨粉均勻地分布於水中即完成混合，為便於說明將混合均勻之培養基定義為原培養基。

接著測量原培養基之酸鹼值，酸鹼值較佳地介於6.8～7.1之間，確認酸鹼值後將原培養基進行高溫高壓滅菌，高溫係指120℃以上、高壓係指1.2 atm以上，本實施例的高溫高壓滅菌條件如下：溫度為121℃，壓力為1.5 atm，滅菌時間為15分鐘以上，較佳滅菌時間為20分鐘，滅菌好後待培養基冷卻至室溫即完成培養基A的配製。

另外，培養基B具有大致相同於上述實施例之原料比例，不同的是，本實施例更包含1％～30％（w／w）的木屑萃取液，更具體地說，係在將0.1％～5％的糖蜜、0.25％～0.75％的活性酵母、0.25％～0.75％肉骨粉以及0.05％硫酸鎂加入逆滲透水的步驟中更加入有1％～30％的木屑萃取液，接著進行混合、滅菌程序，最終即可獲得培養基B。前述混合、滅菌程序相同於上述實施例，於此不再贅述。

另外說明的是，用以製備上述木屑萃取液的方法為使用來自紙漿生產廠所製造之木屑堆肥，將木屑堆肥經烘乾後秤重45～55公克，最佳重量為50公克，接著加入1公升的水進行加熱處理30分鐘以上，加熱溫度為120℃以上，確切條件為1.5 atm下以121℃加熱1小時，加熱後濾除木屑渣即是木屑萃取液。

上述木屑萃取液的重量百分比例並不以1％～30％為限，係取決於上述木屑萃取液製作時木屑堆肥與水的重量比，舉例而言當1公升的水中木屑堆肥的重量為50公克以下，因木屑堆肥的重量減少而使木屑萃取液變稀，此時培養基B所需添加的木屑萃取液重量比則為30％以上。

為評估培養基A以及培養基B促進芽孢桿菌屬產孢菌量之能力，以下就蘇力菌進行試驗：

分別計算10 ⁷個的蘇力菌菌數種植於10毫升的培養基A以及10毫升的培養基B，培養條件為30℃下以180 rpm震盪培養72小時，觀察的時間點為48小時以及72小時，48小時係蘇力菌處於生長對數期的高點，72小時因培養基中大部分的養分已被消耗，所以蘇力菌進入生長停滯期且部分的蘇力菌傾向於進入孢子期，於48小時以及72小時分別計算總菌數以及孢子量。

請參表１及表２所示，由實驗數據得知蘇力菌以培養基A培養48小時的總菌數為7.2x10 ⁸個，72小時總菌數增加為7.92x10 ⁸，而孢子量增加為4.8x10 ⁸個，使用培養基A進行蘇力菌的培養，相較於種植10 ⁷個的蘇力菌，經過48小時即可增加七十倍的菌數，所以使用培養基A的效果不但能促進蘇力菌於生長期的分裂，還能增加蘇力菌於孢子期的產孢量。

同樣地在總菌數以及孢子量的統計上亦可以發現，培養基B的蘇力菌總菌數在經過48小時後為將近6x10 ⁸個，與10 ⁷個相比成長六十倍，72小時的孢子量為5.6x10 ⁸個。

由表１以及表２可知添加木屑萃取液的培養基B，使蘇力菌在48小時的時候即有較多部分的蘇力菌進入孢子期，且於72小時的時候亦有較多的蘇力菌處於孢子期，因此添加木屑萃取液的培養基B相較於沒有添加的培養基A又更能促進蘇力菌提升產孢量。

表１、蘇力菌總菌數

表２、蘇力菌孢子量

為評估培養基A以及培養基B促進芽孢桿菌屬抗生活性之能力，以下就甲基營養型芽孢桿菌進行試驗，實驗結果請參照圖３。

首先，分別使用培養基A以及培養基B培養甲基營養型芽孢桿菌，接著取培養後的發酵培養液以不同的稀釋倍數進行抗病原菌的抗菌力測試，本實驗所使用的病原菌為細菌性軟腐病菌（ Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），此病菌會引起植物的軟腐病害。

詳細步驟如下：甲基營養型芽孢桿菌的培養方式為計算10 ⁷個的菌數分別種植於10毫升的培養基A以及10毫升的培養基B，培養條件為30℃下以180 rpm震盪培養78小時。

於培養78小時後收集發酵的培養液，並以等張溶液（例如：PBS）進行1倍、2倍、10倍或100倍的稀釋，將各稀釋倍數的發酵培養液加入至培養細菌性軟腐病菌的培養基中，細菌性軟腐病菌的接種數量為10 ⁷／mL，培養的溫度條件為30℃，且不同於上述培養甲基營養型芽孢桿菌或是蘇力菌的方式，係將培養基以靜置的方式進行培養。

於24小時後計算細菌性軟腐病菌的活菌菌數，統計如圖１所示，稀釋1倍時培養基A以及培養基B皆能有效抑制細菌性軟腐病菌的生長，而有添加木屑萃取液的培養基B相較於沒有添加的培養基A，在稀釋2倍以上仍能有效的抑制細菌性軟腐病菌的生長，由此可知添加木屑萃取液更可增加甲基營養型芽孢桿菌的抗生活性，如此在稀釋發酵培養液後仍能有效防治細菌性軟腐病菌的生長。

除以上所述之蘇力菌以及甲基營養型芽孢桿菌外，以本發明的培養基培養枯草桿菌亦能有效增加枯草桿菌的總菌量，統計如表3所示，枯草桿菌的接種菌量與培養方式同上述之蘇力菌的培養，所以於此不再贅述。

表3、枯草桿菌總菌數

以上所述僅為本發明較佳可行實施例而已，舉凡應用本發明說明書及申請專利範圍所為之等效變化，理應包含在本發明之專利範圍內。

A培養基A B培養基B

圖１為本發明一較佳實施例之製備培養基的方法流程圖。圖２為本發明另一較佳實施例之製備培養基的方法流程圖。圖３為一種統計圖，揭示芽孢桿菌屬菌種經本發明的培養基培養後，用於抑制細菌性軟腐病菌生長的效果。

A培養基A B培養基B

Claims

一種芽孢桿菌屬菌種的培養基，係由重量百分比計為0.1%~5%的碳源、重量百分比計為0.5%~1.5%的氮源、重量百分比計為0.01%~0.1%的含鎂化合物、重量百分比1%~30%的木屑萃取液以及水補足至100%所組成，其中該碳源包含糖蜜；該氮源為活性酵母、肉骨粉或是上述兩者的組合物；該含鎂化合物包含硫酸鎂。
如請求項1所述芽孢桿菌屬菌種的培養基，其中該活性酵母與該肉骨粉的重量比例為1：1。
一種如請求項1或2所述之芽孢桿菌屬菌種的培養基的用途，其中該培養基用以培養的芽孢桿菌屬菌種，包含有蘇力菌、甲基營養型芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌。
一種製備如請求項1所述之芽孢桿菌屬菌種的培養基的方法，包含將以重量百分比計為0.1%~5%的碳源、重量百分比0.5%~1.5%的氮源以及重量百分比0.01%~0.5%的含鎂化合物與水混合均勻，混合後調整酸鹼值，酸鹼值介於6.8~7.1之間，接著在120℃以上以及1.2atm以上的環境下滅菌15分鐘以上。
一種製備如請求項1所述之芽孢桿菌屬菌種的培養基的方法，包含將以重量百分比計為0.1%~5%的碳源、重量百分比0.5%~1.5%的氮源、重量百分比1%~30%的木屑萃取液以及重量百分比0.01%~0.5%的含鎂化合物與水混合均勻，混合後調整酸鹼值，酸鹼值介於6.8~7.1之間，接著在120℃以上以及1.2atm以上的環境下，滅菌15分鐘以上。
如請求項5所述之芽孢桿菌屬菌種的培養基的製備方法，其中該木屑萃取液之製備步驟包含將木屑堆肥烘乾後秤取45~55公克，並與1公升的水混合，混合後經過120℃以上加熱處理30分鐘以上，去除木屑即得該木屑萃取液。