KR101130782B1 - 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리 ｋｃｔｃ 11451ｂｐ 균주의 배양액을 함유하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제 - Google Patents

바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리 ｋｃｔｃ 11451ｂｐ 균주의 배양액을 함유하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제에 관한 것으로, 고품질 농산물의 생산량 감소를 발생시키는 농업해충에 대한 결정성 독소를 함유함으로써 인체에는 무해하나, 뛰어난 살충성을 가지고 있다.
나비목, 농업해충, 미생물, 바실러스 투린지엔시스, 살충제, 친환경

Description

바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리 ＫＣＴＣ 11451ＢＰ 균주의 배양액을 함유하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제{Pesticide containing culture medium of Bacillus thuringiensis serovar colmeri KCTC 11451BP}
본 발명은 나비목 유충에 대한 미생물 살충제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제에 관한 것이다.
작물 재배에 있어 생산성에 영향을 미치는 요소 가운데 농업해충은 농작물에 직접적인 피해를 줌으로써 고품질 농산물 생산은 물론 생산량 감소에 막대한 손실을 초래해 왔다. 과채류나 엽채류, 과수류, 수도작 등을 친환경적으로 재배하는 농가에서 문제가 되는 해충 가운데 나비목 해충은 고추, 가지, 토마토에서 담배나방, 왕담배나방이 문제가 되고, 배추, 양배추를 비롯해서 기타 쌈채류에서는 배추흰나비와 좀나방이 문제가 심한 편이다. 파밤나방과 담배거세미나방은 기주범위가 넓어 여러 작물에 해를 준다.
1950~1970년대에 이르러 유기합성 농약이 개발 보급되면서 농약의 황금시대를 맞이하게 되었고, 다양한 계통의 농약이 합성되어 병해충은 물론 잡초에 이르기까지 생산성 감소 요소에 대한 화학적 방제의 기틀을 마련하기에 이르렀다. 1970년대 이후 농약의 강한 독성과 병해충의 내성 또는 저항성유발과 농업 생산물 및 환경 중 농약의 잔류성이 사회적 문제로 야기되면서 1970년대 이후에는 이들 농약이 생태계에 영향이 없는 안전한 농약을 개발하는데 주력하고 있다.
그러나 농약 회사들의 이러한 노력에도 불구하고 소비자들의 합성화학물질 즉, 농약에 대한 불안과 친환경농업에 대한 새로운 인식으로 1990년대에 이르러 유기농업에 대한 사회적 평가가 이루어지면서 국가 차원에서 유기농, 무농약, 저농약 농산물 등 재배 방법과 사용 자재에 따라 생산된 농산물을 인증해주는 친환경농산물 인증제도를 마련하기에 이르렀다. 또한 각종 대형할인 매장에서 친환경농산물을 취급하기 시작하면서 친환경농산물 소비가 촉진되기에 이르렀고, 이에 따라 친환경농업을 실천하는 농가가 증가하면서 보다 다양하고 효과적인 병해충 관리자재에 대한 개발의 필요성이 대두되기 시작하였다.
한편, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis ; 이하 'BT'라고 약칭함) 균주는 그람 양성 토양세균으로 농작물, 산림 및 위생 해충의 방제에 유용한 생물 농약으로 잘 알려져 있다. 즉, 성장조건이 악화되면 BT 균주는 내생 포자와 함께 내독소 단백질을 생산하는데, 이 내독소 단백질은 먹이와 함께 섭취된 후 중장내의 알칼리성 환경하에서 활성화되어 특정한 수용체에 결합하여 독성을 나타내 므로 이러한 조건이 갖추어지지 않은 사람이나 동?식물 및 어류 등에는 무해하며 자연 생태계에도 안전한 미래형 농약으로 알려져 있다.
가장 많이 사용되는 BT 균주는 BT 쿠르스타키(Kurstaki) 균주로 이를 이용한 미생물 살충제는 2000년도 현재 127 개 품목에 이른다. 이 균주는 나비목 특히 배추좀나방에 강한 독성을 보이며, 이외에도 담배나방, 흰불나방 등에 높은 독성을 보여 제제로서의 개발이 활발하게 진행되어 왔다. 그러나 이 균주는 나비목에 광범위한 독성을 가진 반면 파밤나방에 대해서는 독성이 매우 낮은 것으로 보고되었으며(Bai C., et al., J. Invertebr. Pathol., 62: 211-215 (1993)), 실험실 조건뿐만 아니라 야외 조건에서도 저항성이 유발되어 사용상의 제약이 있다(Ferre, J., et al., FEMS Microbiol. Lett. 132 : 1-7 (1995)).
이러한 저항성 문제를 해결하고 숙주범위를 확대하기 위해, 최근에는 BT 아이자와이(aizawai) 균주가 주로 사용되고 있다(Tanada, Y. and H. K. Kaya. 1993. Insect pathology. pp. 83-146. Academic Press, Inc. CA, USA.). 그러나 이 균주는 쿠르스타키에 비하여 배양효율이 상당히 떨어져 미생물 살충제로 개발시에 비용이 많이 들고 제품 가격이 높아지는 단점이 있다.
이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 나비목 해충에 대한 살충효과 범위가 광범위한 신규의 미생물 살충제를 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제를 제공한다.
이하, 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 친환경적인 살충제를 제공하기 위해 토양 또는 누에나방 유충 사체로부터 분리한 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주들로부터 결정성 살충 독소를 효과적으로 생산하는 BT17 균주를 선발하였고, BT17 균주의 동정을 통해 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri)라는 사실을 확인하였으며, 이를 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11451BP).
필드테스트를 위해 액상으로 제조된 BT17 제제를 채소 재배용 하우스에서 파 밤나방(Spodoptera exigua)과 배추좀나방(Plutella xylostella)의 유충에 섭식시켜 실험을 실시한 결과, 파밤나방 및 배추좀나방 유충에 대한 우수한 살충성을 확인할 수 있었다.
한편, BT17 제제에 대한 안정성을 확인하기 위한 BT17 균주 배양액의 급성 경구 독성시험, 급성 경피 독성시험, 어독성 시험을 실시하였는데, 그 결과, BT17 균주 배양액에 대한 안정성을 확인할 수 있었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 미생물 살충제는 고품질 농산물의 생산량 감소를 발생시키는 농업해충에 대한 결정성 독소를 함유하는 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주의 배양액을 유효성분으로 함유함으로써 인체에는 무해하나, 뛰어난 살충성을 가지고 있다.
또한, 본 발명의 미생물 살충제는 특히, 배추좀나방(Plutella xylostella) 및 파밤나방(Spodoptera exigua) 유충에 대한 살충성이 뛰어남으로 살충효과의 범위가 광범위하다.
또한, 본 발명에 사용된 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주는 토양으로부터 분리된 친환경적인 것으로, 합성화학물질로 조성된 농약에 대한 소비자의 불안감을 해소시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 분리한 균들 결정형 내독소 생산 여부 측정
바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis ; 이하 'BT'라고 칭함) 균주를 국내 토양 또는 나비목 유충의 사체로부터 분리하였다. 분리한 균주들 중에서 BT135, BT144, BT154, BT170, BT17 균주를 선발하여 LB 배지(trypton 1g, yeast extract 0.5g, NaCl 0.5g, D.W. 100ml)에 배양한 후, 위상차현미경을 이용한 검사를 통하여 내생포자 이외에 결정형 내독소를 생산 여부를 측정하였다. BT17 균주는 충북 청원군 오창면 토양에서 분리하였으며, BT135와 BT144, BT170 균주는 경북 안동시에서, BT154 균주는 경북 영주시에서 각각 토양이나 누에나방 유충 사체로부터 분리하였다.
측정결과, 각 균들은 내생포자와 더불어서 마름모꼴의 결정성 독소를 생산하였으며, 배양시간이 지속되면 결정성 독소들은 균체 외부로 빠져나오는 것을 볼 수 있었다. 특히 BT170 균주가 약간 크기가 작은 결정들을 많이 생산하였으며 BT144균주는 결정성 독소를 전혀 생산하지 못하였다.
결정성 독소를 생산하지 못하는 BT144균주를 제외한 나머지 4 균주에 대해 API kit를 이용한 동정 실험을 하였다.
모두 동일한 탄수화물 이용 패턴(pattern)을 보였다(표 1). 이 자료를 'Biomerieux' 회사(www. biomerieux .com)에서 제공하는 'Apiweb'을 통하여 분석한 결과, 바실러스 세레우스(B. cereus)이거나 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis)일 것으로 나타났는데 결정성 독소를 생산하는 균은 후자이므로 모두 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis)로 판정하였다.
카르보하이드레이트 소스
(Carbohydrate source)		 결과 카르보하이드레이트 소스
(Carbohydrate source)		 결과
글리세롤(Glycerol) + 살리신(Salicin) -
에리스리톨(Erythritol) - 셀로비오즈(Cellobiose) -
D-아라비노스(D-Arabinose) - 말토즈(Maltose) +
L-아라비노스(L-Arabinose) + 락토즈(Lactose) -
리보스(Ribose) + 메리비오즈(Melibiose) -
D-자일로스(D-Xylose) + 수크로스(Sucrose) +
L-자일로스(L-Xylose) - 트레할로스(Trehalose) +
아도니톨(Adonitol) - 이눌린(Inulin) +
β-메틸-D-자이로사이드
(β-Methyl-D-xyloside)		 - 멜레치토스(Melezitose) -
갈락토스(Galactose) - 라피노스(Raffinose) -
글루코스(Glucose) + 스타치(Starch) -
프락토즈(Fructose) + 글리코겐(Glycogen) -
만노스(Mannose) + 자일리톨(Xylitol) -
소르보스(Sorbose) - 겐티오비오스(Gentiobiose) +
람노스(Rhamnose) - D-튜라노스(D-Turanose) +
덜시톨(Dulcitol) - D-라이조스(D-Lyxose) -
이노시톨(Inositol) + D-타가토즈(D-Tagatose) -
만니톨(Mannitol) + D-푸코스(D-Fucose) -
솔비톨(Sorbitol) + L-푸코스(L-Fucose) -
α-메틸-D-만노사이드
(α-Methyl-D-mannoside)		 - D-아라비톨(D-Arabitol) -
α-메틸-D-글루코사이드
(α-Methyl-D-glucoside)		 + L-아라비톨(L-Arabitol) -
N-아세틸-글루코사민
(N-acetyl glucosamine)		 + 글루코네이트(Gluconate) -
아미그달린(Amygdalin) - 2-케토-글루코네이트(2-Keto-gluconate) -
알부틴(Arbutin) + 5-케토-글루코네이트(5-Keto-gluconate) -
에스큘린(Esculin) +
실시예 2: 분리 균주들의 살충성 측정
실시예 2에서는 실험실 내에서 순화된 주요 해충의 유충에 대하여 분리 균주들이 나타내는 살충효과를 측정하였다.
상기 실시예 1에서 순수 분리된 균주들을 배추잎에 도말하고, 배추좀나방 유충을 처리한 후, 24시간과 48시간 후 살충효과를 측정하였다(L2는 다른 회사의 BT제품이다).
측정결과(도 1), BT144 균주는 전혀 유충을 죽이지 못하였고, 처리 후 24시간에 BT17 균주는 거의 모든 유충을 사멸시켰으며, 48시간 후에는 BT17와 BT144 균주 처리구에서 모든 유충이 사멸하였다.
실시예 3: 살충성이 우수한 균주의 동정
실시예 3에서는 상기 실험예 2에서 살충성이 우수한 BT17 균주에 대한 동정시험을 위하여 API 50CHB (France, Biom)를 사용하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 16s rDNA 염기서열을 분석하였고, 지방산 분석도 행하였다.
순수 분리된 BT17 균주를 'Nutrient Broth Agar(Difco)'배지에 접종하고, 28℃에서 2일간 배양하였으며, 벤질클로라이드(Benzyl chloride)법을 변형하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭을 위하여 사용된 프라이머는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')였다.
증폭된 16S rDNA는 'PCR Product Purification Kit(Qiagen)'를 사용하여 정제하였고, PCR 정제산물은 'Genetic analyzer 310A(Applied Biosystems)'를 사용하여 염기서열을 분석하였으며, 'DDBJ/NCBI/Genebank'와 'Ribosomal Database Project Ⅱ(RDP Ⅱ)'의 데이타베이스(database)에서 상동성 검색을 수행하였다.
한편, 세균의 경우, 균체지방산 조성이 다양하여 화학분류학적인 측면에서 유용한 정보로 사용되고 있다. 순수 분리된 BT17 균주를 TSA(Trypticase Soy Broth Agar, Difco)배지에 접종 후, 28℃에서 3일간 배양하였으며 균체 50㎎(wet weight)을 'Ikemoto & Miyagawa'의 방법에 의하여 균체 지방산 메틸에스터(methyl ester)화 및 추출을 수행하였다.
획득한 실험 자료는 'Microbial Identification System(MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, Del.,USA)'을 이용하여 '6890N GC(Gas Chromatograph; Agilent Technologies)'로 분석하였다.
BT17 균주의 16s rDNA를 추출하여 1,319염기쌍의 전체 염기배열 순서를 조사한 결과, 기존의 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(B. thuringiensis serovar colmeri)와 100% 동일함을 알 수 있었고, BT17 균주를 유사한 바실러스(Bacillus)속 균주들의 자료와 비교하여 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(B. thuringiensis serovar colmeri)로 동정 확인하였다(도 2).
한편, BT17 균주의 균체 지방산조성 분석을 실시한 결과, 주요 지방산으로는 C16:0(19.96%), C13:0 iso(15.09%)와 C15: iso(12.53%)의 분포를 나타내었으며, C14:0 iso, C16:0 iso, C17:0 iso 그리고 C17:0 anteiso와 같은 다양한 분지형 지방산을 함유하는 특징을 나타내었다. 또한 BT17 균주는 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis) ATCC 10792T 표준균주의 주요 균체지방산 조성과도 유사한 특징을 나타내었다.
한편, BT17 균주를 2009년 1월 2일 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11451BP를 부여받았다.
실시예 4: 필드 테스트용 BT17 제제의 제조
본 실시예에서는 대두박 2%(v/v) 및 탈지유 1%(v/v)가 포함된 200L의 배지에서 BT17 균을 2%(v/v) 접종한 후, 30℃에서 36시간 배양함으로써 배양액을 수득하고, 20℃에 해당하는 실온에 보관하였다.
그 후, 액상의 제제를 제조하기 위해 36시간 배양한 BT17 균 배양액 자체를 냉각시킨 후, 첨가물로서 증점제, 동결방지제와 계면활성제, 부패 방지를 위한 산도조절제를 총중량의 10% 이내가 되도록 첨가하였다
상기와 같이 제조된 분상의 BT제제는 희석한 후, 하기의 필드 실험에 사용되었고, 액상의 BT제제에 대해 위상차 현미경으로 결정성 독소의 수가 측정되었다. 측정결과, 액상의 BT제제에 함유된 결정성 독소의 수는 원 배양액에 비하여 크게 줄지 않는 수준으로 유지되었다.
실시예 5: 필드 테스트( Field test )를 통한 방제 효과 측정
상기 실시예 4에서 액상으로 제조된 BT17 제제를 채소 재배용 하우스에서 파밤나방(Spodoptera exigua)과 배추좀나방(Plutella xylostella)의 유충에 섭식시켜 필드테스트(field test)를 실시하였다.
대상 해충을 배추좀나방(Plutella xylostella)으로 하여 실시한 실험은 시험작물인 배추(품종: 상상이상)에 약제 처리 전 무처리구의 유충의 평균밀도가 60개체로 하고, BT17 제제를 250배, 500배, 1,000배 희석하여 처리하였다.
한편, 대상 해충을 파밤나방(Spodoptera exigua) 2령으로 실시한 실험은 시험작물인 배추(품종: 신춘1호)에 약제 처리 전 무처리구의 밀도가 평균 30마리로 하고, BT17 제제를 125배, 250배, 500배 희석하여 처리하였다. 비교예로 비티 쿠르스타키 수화제를 1,000배 희석하여 처리하였다(표 6에서 1/1000*은 비티 쿠르스타키 수화제를 1,000배 희석하여 처리한 것).
배추좀나방(Plutella xylostella) 유충
희석배율 생존률(Viability, %) 유의성(Significance, DMRT) 방제율(Mortality, %)
샘플
I II III 평균(Mean)
1/250 3.3 6.6 5 4.9 d 95.1
1/500 10 18.3 10 12.7 c 87.3
1/1000 20 20 21.6 20.5 d 79.5
대조군 100 100 100 100 a -
파밤나방(Spodoptera exigua) 유충
희석배율 생존률(Viability, %) 유의성(Significance, DMRT)
 방제율(Mortality, %)
샘플
I II III 평균(Mean)
1/125 10 16.7 3.3 10 c 75.0
1/250 10 13.3 10 11 c 72.5
1/500 20 20 16.7 19 b 52.5
1/1000* 10 3.3 6.6 6.6 c 83.8
대조군 40 43.3 36.7 40 a -
측정결과(표 2 및 표 3), 배추좀나방 유충에 대해서는 BT17 제제가 500배 이상에서 대조약제와 비등하였고, 파밤나방 유충에 대해서는 250배 이상에서 대조약제인 비티 쿠르스타키 수화제 1000배액과 비등하였다.
한편, 동일한 농도에서 보면 파밤나방보다 배추좀나방에 대한 방제율이 높게 나왔으므로 BT17 제제는 배추좀나방에 대해 더 효과적이라고 할 수 있다.
한편 BT17제제를 살포하는 시기에 있어서 오전보다 오후에 처리한 경우가 더 방제율이 높게 나타나는데 이는 일광 하에서 BT 제제가 분해된다는 보고와 동일한 결과이다(Griego, V. M. and K. D. Spence. 1978. Inactivation of Bacillus thuringiensis spores by ultraviolet and visible light. Appl . and Environ . Microbiol. 35, 906-910, Pusztai, M., P. Fast, L. Gringorten, H. Kaplan, T. Lessard, and P. R. Carey. 1991. The mechanism of sunlight-mediated inactivation of Bacillus thuringiensis crystals. Biochem . J. 273, 43-47)
실시예 6: 안정성 검증
본 실시예 6에서는 BT17 균주의 배양액을 이용한 미생물 살충제의 제품화를 위해 안정성을 확인하였다. BT17 균주 배양액의 급성 경구 독성시험, 급성 경피 독성시험, 어독성 시험을 실시하였다.
급성 경구 독성시험은 ICR계 마우스를 사용하여 기초시험으로 5,000 mg/kg 투여군과 용매 대조군을 두어 1회 경구 투여한 후 2주간 사망율, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰 조사하였다.
급성 경피 독성시험은 SD계 랫드를 사용하여 기초시험으로 4,000 mg/kg 투여군과 용매 대조군 두어 1회 경피 투여한 후 2주 간 사망율, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰 조사하였다.
어독성 시험은 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 영향을 96시간 동안 실시하여 농도 당 노출 어류 10마리에 대한 생사수, 일반 중독증상을 관찰하고 체중 및 전장을 조사하였으며, 시험기준은 "농촌진흥청 고시 제 2008-13호, 별표4 환경생물독성 시험기준과 방법, II 생화학농약, 2. 담수어류에 대한 영향시험"(2008. 5. 27)에 따랐고, 시험농도(nominal concentration)는 10.0 mg/L로 하여 시험을 실시하였다.
먼저, 급성 경구 독성시험 결과, 투여군에 있어서 암?수 모두 사망사례는 물론 시험물질 투여에 기인한 일반증상은 관찰되지 않았고, 체중변화에 있어서는 대조군과 유의성 있는 변화를 보이지 않았으며, 생존동물에 대한 부검결과에 있어서도 특이한 병리학적 소견은 관찰되지 않았다. 따라서 마우스에 대한 BT17 시료의 경구 투여 시 LD50은 5,000 mg/kg 이상으로 사료되었다.
한편, 급성 경피 독성시험 결과, 투여군에 있어서 암?수 모두 사망 사례는 물론 시험물질 투여에 기인한 일반증상은 관찰되지 않았고, 체중변화에 있어서는 대조군과 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 또한, 생존동물에 대한 부검결과에 있어서도 특이한 병리학적 소견은 관찰되지 않았다. 따라서 랫드에 대한 BT17의 경피 투여 시 LD50은 4,000 mg/kg 이상으로 사료되었다.
어독성 실험 결과, 치사가 일어나지 않는 최대 농도는 10.0 mg/L 이었으며, 대조군과 처리군에서 일반중독증상 및 특이사항은 관찰되지 않았다. 따라서 본 시료의 48시간-LC50 값은 10.0 mg/L 이상으로 어독성 Ⅲ급으로 확인되었다.
도 1은 토양 또는 누에나방 유충사체로부터 분리된 균주들을 배추좀나방 유충에 처리한 후, 24시간과 48시간 후의 살충효과를 나타낸 도이다.
도 2는 BT17 균주를 동정한 결과에 대한 도이다.

Claims (1)

  1. 대두박 2%(v/v) 및 탈지유 1%(v/v)가 함유된 배지에 바실러스 투린지엔시스 세로바 코르메리(Bacillus thuringiensis serovar colmeri) KCTC 11451BP 균주를 2%(v/v) 접종한 후, 30℃에서 36시간 배양함으로써 수득된 배양액을 유효성분으로 함유하고,
    배추좀나방(Plutella xylostella) 및 파밤나방(Spodoptera exigua) 유충에 대하여 살충효과가 있는 것을 특징으로 하는 나비목 유충에 대한 미생물 살충제.
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Microbiol. Res. 155(1), p.23-29(2000)*

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