CN1132932C - 一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌 - Google Patents

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一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensisyc-03)，中国典型培养物保藏中心保藏号：CCTCC NO：M 201003，该菌株以柳兰叶甲、马铃薯甲虫为试虫，经过毒力生物测定筛选对鞘翅目害虫有高毒力的菌株，利用该菌株生产的杀虫剂，可扩大苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药防治费用、减少化学农药的污染，对人、畜及动植物无害，具有良好的经济和生态效益，由于该菌株遗传特性比较稳定，故适合用作构建广谱或高效工程菌的受体菌。

Description

一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌
本发明涉及芽孢杆菌，更具体涉及杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，本发明所称的一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis yc-03)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M201003，培养物名称为：Bacillusthuringiensis yc-03(cry3A)，该菌株是从我国土壤样品中分离、并以柳兰叶甲、马铃薯甲虫为试虫，经过毒力生物测定所筛选出的对鞘翅目害虫有高毒力的菌株。根据分离该菌株的土壤样品来源地的名称和杀鞘翅目昆虫的特点，取云南(Yunnan)、鞘翅目(Coleoptera)的第一个字母组成其代码YC，又因该菌株是从同一土壤样品中分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为03的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为YC-03。
基本的技术原理是：利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法分离苏云金芽孢杆菌。以2龄柳兰叶甲和马铃薯甲虫的幼虫为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc50，筛选到该高毒力菌株。
鞘翅目害虫的危害仅次于鳞翅目害虫，对农林牧业生产有重大危害，1991年我国新疆霍城地区首次发现马铃薯甲虫入侵，迅速蔓延并对农作物造成巨大危害。因此，筛选出对鞘翅目有高效的苏云金芽孢杆菌并运用其生产新型杀虫剂具有现实意义和紧迫性。为了扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱和提高杀虫活性，目前国内外均致力于新菌株的分离鉴定和新的杀虫基因的开发。在苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定、筛选方面，文献“土壤来源的苏云金芽孢杆菌的形态、δ-内毒素蛋白质及其毒力特性(微生物学报，1992，32(6)：387-393)”、“从土壤分离的410株苏云金芽孢杆菌的鉴定(华中农业大学学报，1994，第二期)、“我国南北方土壤中苏云金芽孢杆菌的分布及杀虫特性”(微生物学报，1996，36(4)；295-302)、及“土壤来源的五个苏云金芽孢杆菌新亚种的鉴定(微生物学报，1999，39(2)：154-159)等对我国苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定、分布特点、晶体蛋白质形态、杀虫特性等进行了研究。在高效、特异性菌株的筛选方面，文献“对斜纹夜蛾高毒力的Bt新分离株及其特性的研究(微生物学通报，1997，24(5)：262-265)”、“对夜蛾幼虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株及其晶体蛋白质特征(中国生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选(中国病毒学，2000，Vol.15：98-101)”等分别从众多的苏云金芽孢杆菌菌株中筛选到了杀鳞翅目夜蛾科害虫的高效特异性菌株；在杀虫基因克隆和工程菌构建方面，目前全世界已克隆了33类近200个苏云金芽孢杆菌的基因，文献“抗鞘翅目δ-内毒素及毒素基因文库的构建(生物工程学报，1994，10(2)：103-108)”、“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的启动子及其转录调控(微生物学通报，1999，26(2)：130-134)”、“苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究(南开大学学报，1999，32(3)：163-168)”等分别建立了抗鞘翅目δ-内毒素的基因文库、克隆了杀鳞翅目害虫的基因，对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的表达与调控进行了阐述。文献“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”(生物工程学报，-1999，15(2)：215-220)以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将苏云金芽孢杆菌HD-1杀虫蛋白质基因crylAc导入水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析，核酸印记(Southern)分析和杀虫生物活性测定结果证实了crylAc基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。文献“苏云金芽孢杆菌以色列亚种130000道尔顿杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中的表达”将苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊蛋白质基因亚克隆到pNQ122载体上，通过枯草芽孢杆菌原生质体转化，得到KMr-CMs的正反向克隆子。蛋白质免疫杂交(Western-blotting)证明杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的杀蚊蛋白质。所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。
YC-03是国内首次分离获得的杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌，并对其有关特性进行了研究。该苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫特点和毒力水平国内领先，达到国际先进水平。
本发明的目的是，提供一株对鞘翅目害虫具有特异性毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。
为了达到上述目的，本发明利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法从我国云南的土壤样品中分离出苏云金芽孢杆菌。以2龄柳兰叶甲和马铃薯甲虫的幼虫为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc50，筛选到该高毒力菌株。
该菌株的具体特征如下：
1、血清型：以YC-03的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行交叉凝集反应及交叉吸收凝集反应试验，YC-03的H血清型为H8ab，属苏云金芽孢杆菌的莫氏亚种(Bacillus thuringiensissubsp.morrisoni)。
2、生化特性：按Barjac的经典方法进行生理生化试验。
      苏云金芽孢杆菌YC-03菌株的生化特征
形态特征和生化特性     YC-03菌株
杆状：宽(μm)(μm)革兰氏反应原生质上未染上色的小球芽孢椭圆圆形内生或偏内生芽孢囊膨大伴孢晶体运动性     1.2-1.83.0-5.0+++-+-薄扁的四方体+
接触酶厌氧生长V-P反应V-P肉汤中的pH值生长温度(℃)：最高最低卵黄反应在0.001％溶菌酶上生长在7％NaCL上生长在pH6.0培养基上生长葡萄糖产酸阿拉伯糖产酸木糖产酸甘露糖产酸水解淀粉利用柠酸盐还原NO3-NO21周内脱苯丙氨酸溶血试验RNA酶试验     +兼性嫌气菌+4.3-5.640-4510-15+++++---+++-++
3、杀虫晶体蛋白质：经SDS-PAGE分析，菌株YC-03产生68-70kD的杀虫晶体蛋白质。
4、质粒：菌株YC-03至少含64、45及9.0MD三种质粒。
5、杀虫晶体蛋白质基因：菌株YC-03的杀虫晶体蛋白质基因为cry3A，并且杀虫晶体蛋白质基因的表达为非芽孢依赖型，即杀虫晶体蛋白质的形成不依赖于芽孢的形成。
发明的优点在于，苏云金芽孢杆菌YC-03具有杀鞘翅目害虫的特点，国内目前尚无杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌商品制剂，因而可利用YC-03生产新型苏云金芽孢杆菌杀虫剂，使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药防治费用、减少化学农药对环境的污染，增加农作物产量。其安全性与其它野生苏云金芽孢杆菌无异，对人、畜及动植物无害，不污染环境，有良好的经济和生态效益。因而，从优越而独特的杀虫特性、生产和使用成本低、对人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌YC-03有良好的推广应用前景。并且由于该菌株遗传特性比较稳定，故该菌适合用作构建广谱或高效工程菌的受体菌。
用本发明制备的杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌YC-03杀虫剂经发酵小试及中试、菌剂生产、田间试验、示范应用，其质量达到农业部规定的一级标准；防治马铃薯甲虫、猿叶虫等鞘翅目害虫的防效达到80％以上；并用该菌株的高含量粉剂制备了杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌杀虫剂的质量检测标准。

Claims (1)

1、一株杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌，其特征在于，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis yc-03(cry3A)，CCTCC NO：M201003。
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