CN107043716B

CN107043716B - 一种苏云金芽胞杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107043716B
Application number: CN201611253650.2A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 束长龙; 耿丽丽; 宋福平; 彭琦; 梁影屏
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN107043716A

Abstract

本发明涉及一种苏云金芽胞杆菌，该菌株被定名为IPPBiotCo1085，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13303。相比于工程菌株，作为药剂开发，使用该菌株省去了环境安全性评价等环节，而且在转基因倍受部分群体质疑的当下，更容易获得公众在安全性方面的认可。即本发明的苏云金芽胞杆菌菌株IPPBiotCo1085更具应用价值。

Description

一种苏云金芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及苏云金芽胞杆菌，特别涉及一种对大猿叶甲(Colaphellus bowring)、小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)等害虫的幼虫有活性的苏云金芽胞杆菌。

背景技术

鞘翅目害虫在我国农业生产中的危害逐年加重，且造成了严重的经济损失，因此，急需发掘更多的对鞘翅目害虫具有毒杀作用的菌株及基因。目前，从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中发现了一些的Cry蛋白对鞘翅目害虫具有杀虫活性。然而，为了丰富生物防治的种类，特别是蛋白对鞘翅目害虫防治的种类，以期获得具有不同杀虫机理的生物防治材料，来应对因长期使用某单一药剂可能产生的抗药性。因此，仍然有必要寻找新的具有优良活性的新型杀虫蛋白。

发明内容

本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从吉林长白山中分离得到了众多的芽胞杆菌菌株，并对这些芽胞杆菌的管家基因glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi进行测序分析，以确定这些芽胞杆菌的种属分类关系。并利用这些芽胞杆菌对有害生物的毒力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，以期为植物害虫的防治提供材料。本发明首次发现了一种可以用于防治多种农作物害虫的优良野生苏云金芽胞杆菌。

在研究过程中，发明人发现苏云金芽胞杆菌菌株IPPBiotCo1085对大猿叶甲(Colaphellus bowring)、小猿叶甲(PhaedonbrassicaeBaly)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)等害虫，特别是对它们的幼虫具有良好的杀虫活性。由于苏云金芽胞杆菌对害虫高效、对人畜安全无毒、对环境友好等优点，其为生物防治农业害虫提供了一种有效的方法。本发明的苏云金芽胞杆菌菌株IPPBiotCo1085应用于生产，可以达到节省成本、提高害虫防效的目的。同时，由于IPPBiotCo1085为野生菌株，相比于工程菌株BIOT1853A，作为药剂开发省去了环境安全性评价等环节。虽然本发明的野生菌株IPPBiotCo1085并不在于否定工程菌菌株的可应用性，然而在转基因倍受部分群体质疑的当下，野生菌更容易获得公众在安全性方面的认可。即本发明的苏云金芽胞杆菌菌株IPPBiotCo1085更具应用价值。

因此，本发明之一提供了一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌株被定名为IPPBiotCo1085，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13303。

本发明之二提供了一种对本发明之一所述的苏云金芽胞杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。

本发明之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本发明之一所述的苏云金芽胞杆菌和/或如本发明之二所述的工程菌。其中，由于该工程菌株以苏云金芽胞杆菌IPPBiotCo1085为改造对象，向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该菌株仍然为苏云金芽胞杆菌。另外，所述菌株可以为提高了对大猿叶甲(Colaphellusbowring)、小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)等害虫中的至少一种的活性的菌株。还可以为兼具其他病虫害等活性的菌株。

在一个具体实施方式中，所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的苏云金芽胞杆菌具有增效作用的其他物质，该物质可以是微生物来源杀虫物质，也可以是杀虫化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的苏云金芽胞杆菌相配合的辅剂、增稠剂、分散剂和/或能使所述芽胞杆菌增殖的营养组分，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等中的至少一种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等中的至少一种：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等中的至少一种。

本发明之四提供了一种农药制剂，所述农药制剂包含如本发明之一所述的苏云金芽胞杆菌、本发明之二所述的工程菌和本发明之三所述的组合物中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本发明的苏云金芽胞杆菌具有增效作用的其他物质，该物质可以是微生物来源杀虫物质，也可以是杀虫化合物。所述农药制剂进一步可以包括与本发明的苏云金芽胞杆菌相配合的辅剂、增稠剂和分散剂中的至少一种，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等中的至少一种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等中的至少一种：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述农药制剂的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

本发明之五提供了如本发明之一所述的苏云金芽胞杆菌、如本发明之二所述的工程菌、如本发明之三所述的组合物以及如本发明之四所述的农药制剂中的至少一种的应用。

在一个具体实施方式中，所述苏云金芽胞杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于防治鞘翅目害虫。

在一个具体实施方式中，所述鞘翅目害虫选自大猿叶甲(Colaphellus bowring)、小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)中的至少一种。

在本发明中没有特殊说明的情况下，本发明中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。

附图说明

图1为IPPBiotCo1085的MEGA软件构建系统发育树。

菌株保藏

本发明筛选的微生物被定名为IPPBiotCo1085，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13303，保藏日期为2016年11月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

菌株的分离与鉴定

使用LB固体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1L，pH7.0，15磅灭菌15min)对2015年8月在吉林长白山采集的土样进行芽胞杆菌筛选与分离。首先利用无菌水对土样进行梯度稀释，然后将系列稀释的样品置于70℃的水浴锅中10分钟，在无菌条件下取100微升的不同梯度下的稀释液涂布于LB固体平板上，并于30℃培养16-48小时，对菌落形态为无粘液、湿润、厚实且菌落外沿稍有扩散而不很整齐的菌落进行纯化，然后保藏纯化出的单菌落，以备用于后续的菌种鉴定和生物活性分析。

对纯化的单菌落在30℃条件下LB培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在LB培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.0×0.5μm至1.5×0.5μm；单个或两个以上呈链状存在。芽胞：椭圆形，大小约1.0×0.5μm至1.3×0.5μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴孢晶体：球形、菱形和方形等。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社.2001年)中描述的芽胞杆菌形态特征基本一致，初步判断具有这种形态菌落的菌株属于苏云金芽胞杆菌。对分离的菌株进行编号。

实施例2

生物活性测定

利用牛肉膏蛋白胨(3％牛肉膏，0.5％蛋白胨，pH 7.2，15磅灭菌15min)培养基对分离的不同菌株分别进行发酵培养，在产生出50％左右的芽胞时，收获发酵培养物，并对每种发酵培养物进行常规的菌落计数，系列稀释。然后针对大猿叶甲(Colaphellusbowringii)、小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)、黄曲条跳甲(Phyllotretastriolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)和马铃薯甲虫(Leplinotarsadecernlineata)的初孵幼虫、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)的5日龄幼虫分别进行生物活性测定，以清水作为空白对照，以BIOT1853A工程菌株(以上述同样的方法发酵)为阳性对照。其中大猿叶甲、小猿叶甲用小油菜叶片进行生物活性测定，黄曲条跳甲用白萝卜进行生物活性测定，榆蓝叶甲用榆树叶片进行生物活性测定，马铃薯甲虫用马铃薯叶片进行生物活性测定，铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)用土豆丝和土进行生物活性测定。

地上害虫的生物活性测定操作步骤如下：

(1)选取鲜嫩一致的叶片或白萝卜片(根据试虫选择合适的食物，如上所述)，用清水洗净，晾干，剪成一次性平皿(直径＝6cm)大小；

(2)将叶片或白萝卜片在配制好的系列稀释的发酵培养物(加入洗涤剂，终浓度0.1％)中浸泡30s；

(3)在实验台上铺一层保鲜膜，蘸有样品的叶片或白萝卜片置于保鲜膜上，室温晾干；

(4)将叶片或白萝卜片分别放于培养皿中，培养皿(直径＝9cm)中垫入无菌水喷湿的滤纸(需用锡箔纸包装灭菌)；

(5)用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个叶片或白萝卜片接幼虫30头作为一个处理，每个处理做三次重复，接完虫后以2层吸水纸严格密封，并用橡皮筋固定，防止幼虫爬出；

(6)放置25℃生化培养箱中，光周期为16h：8h，湿度50％左右，每天观察叶片或白萝卜片是否腐烂或干枯，是否有水蒸气凝结，并调整生化培养箱内的水分，保持箱内湿度；

(7)48h后调查各个处理的死、活虫数，计算死亡率、存活率、校正死亡率和LC₅₀。

地下害虫的生物活性测定操作步骤如下：

(1)将土豆切成细丝在阳光下晾晒至失水约60％-90％，同时将过筛后的土在阳光下晒2-3小时；

(2)将晾晒过的土豆丝在配制好的系列稀释的发酵培养物(加入洗涤剂，终浓度0.1％)中浸泡30s；

(3)然后将土豆丝分装于六孔板中；

(4)用浸泡过土豆丝的培养物拌土，并将拌好的土分装于六孔板中；

(5)将健康的铜绿丽金龟或暗黑鳃金龟的幼虫接种于六孔板中，每30头作为一个处理，每个处理做三次重复，接完虫后严格密封，防止幼虫爬出；

(6)放置25℃生化培养箱中，光周期为16h：8h，湿度50％左右，每天观察土豆丝是否发霉，是否有水蒸气凝结，并在调整生化培养箱内的水分，保持箱内湿度；

(7)7天后调查各个处理的死、活虫数，计算死亡率、存活率、校正死亡率和LC₅₀。

其中，对试虫进行LC₅₀测定之前，首先使用如上的生物活性测定方法经过初筛初步确定杀虫的浓度范围，然后再测定一系列的浓度梯度下的杀虫活性，进而计算出LC₅₀。在某一特定浓度下的死亡率和校正死亡率计算公式如下：

根据生测数据采用SPSS(V13.0)软件计算致死中浓度(LC₅₀)。在众多菌株中，菌株编号为IPPBiotCo1085的菌株表现出优良的杀虫活性，其结果见表1。

表1

实验表明，野生菌株IPPBiotCo1085对大猿叶甲、小猿叶甲、黄曲条跳甲、马铃薯甲虫、铜绿丽金龟和暗黑鳃金龟具有非常好的杀虫效果，其可以用于同防治上述鞘翅目害虫，有效地避免了现有Bt菌株杀虫性单一的问题。同时由于其是天然菌株，因而不存在环境安全性问题。使用该菌株用于防治上述害虫可以避免对现有菌株的改造，从而省去了工程菌环境安全性评价的环节。

实施例3

活性菌株IPPBiotCo1085进一步的分类鉴定

1.多位点序列分型

多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)是近年来发展很快的分子生物学分析方法，其具有很高的分辨能力，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学的研究。通过分析多个450bp左右的管家基因(Housekeeping gene)核心片段的核酸序列，从而对菌株的等位基因进行多样性的比较，不同的菌株对应不同的序列型(Sequencetype)。所以MLST越来越多的被作进行国际间菌株比较的常用工具，以及建立一种更为准确的分型系统方法，并且将其应用于研究出现的不同的抗生素抵抗株、毒力或抗原的相关特殊基因型，及新的变异株引起的疾病流行等流行病学分析，进行生物进化和种群结构的研究。

1.1提取基因组

S1：5mL 1M Tris-HCL，1mL 0.5M EDTA，171.15g蔗糖，pH7.0，定容至500mL，115℃20min灭菌。

S2：10％SDS 4mL+ddH₂O 6mL，pH4.8-5.2。

S3：5M异硫氰酸胍，1M NaAc。

TE：10mM Tris-HCL 3mL，1mM EDTA 600ul，pH8.0，定容至300mL。

提取IPPBiotCo1085菌株和已知的17株芽胞杆菌的标准菌株(其中，苏云金芽胞杆菌4株，分别为HBF18、4M2、4BV1和4XX1；蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)4株，分别为27、28、34和6A51；蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)4株，分别为6A11、6A20、6A47和6A68；韦氏芽胞杆菌(Bacillus weihenstephanensis)5株，分别为6A21、6A22、6A23、6A24和6A46)的基因组，具体方法如下：

(1)菌株在LB固体培养基上划线，30℃过夜培养，刮取100μg菌体到1.5mL EP管中；

(2)加入150μl S1(加溶菌酶和石英砂)悬浮，于振荡器上剧烈振荡，混匀，无需用枪头吹打；

(3)加200μl S2，充分混匀；再加入400μl的S3，充分混匀，剧烈震荡；

(4)取上清，加等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置20min；

(5)取出离心，12000rpm，10min，弃上清；

(6)加入70％的乙醇清洗，12000rpm，10min；

(7)倒掉乙醇，再次12000rpm，3min；

(8)用枪头吸干上清，室温晾干；

(9)再加入100μl的TE或者质粒提取试剂盒中Eluent(每毫升TE或Eluent中加10μl的RNaseA)溶解沉淀；

(10)-20℃保存备用。

提取的基因组利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示提取的基因组效果良好。

1.2PCR引物的设计与合成

根据pubMLST(http://pubmlst.org/bcereus/info/primers.shtml)发布的Bcgroup的七个管家基因引物序列进行合成。

七个管家基因分别是：glpF(甘油吸收有利蛋白，glycerol uptake facilitatorprotein)、gmk(假定的鸟苷酸激酶，putative guanylate kinase)、ilvD(二羟酸脱水酶，dihydroxy-acid dehydratase)、pta(磷酸转乙酰酶，phosphate acetyltransferase)、pur(phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide)、pycA(丙酮酸羧化酶，pyruvatecarboxylase)以及tpi(磷酸丙糖异构酶，triosephosphate isomerase)。所选取的七个管家基因名称，引物名称及序列(5’-3’)，扩增长度见下表2。

表2

1.3PCR扩增

将提取成功的每个菌株基因组DNA分别稀释到10ng/μL左右作为PCR扩增模板，采用50μL反应体系，分别对7个目的管家基因进行PCR扩增。扩增体系包含有，Taq PCR MasterMix(25μL)，正反向引物(各1μL)、基因组DNA(2μL)和ddH₂O(21μL)。

对于pta基因的扩增，循环参数为：

72℃末端延伸10min。

其他六个管家基因除退火温度不同外。其他循环参数设定相同，其中glpF为59℃，gmk和pur均为56℃，pycA为57℃，ilvD和tpi均为58℃。

1.4扩增产物检测

待扩增反应结束后，取3μL的PCR产物加样于预先制备加有核酸染料的1％琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压140V，10min后取出，紫外分光光度计下拍照、保存。所有菌株均扩增成功。

1.5测序及整理序列

对上述芽胞杆菌的PCR产物进行测序。将每株菌的glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi的测序序列分别提交到pubMLST网站中上述相应基因的基因库中，获得用于MLST分析的序列长度分别glpF：372bp；gmk：504bp；ilvD：393bp；pta：414bp；pur：348bp；pycA：363bp；tpi：435bp。其中IPPBiotCo1085的glpF序列如SEQ ID No.15所示，IPPBiotCo1085的gmk序列如SEQ ID No.16所示，IPPBiotCo1085的ilvD序列如SEQ ID No.17所示，IPPBiotCo1085的pta序列如SEQ ID No.18所示，IPPBiotCo1085的pur序列如SEQ ID No.19所示，IPPBiotCo1085的pycA序列如SEQ ID No.20所示，IPPBiotCo1085的tpi序列如SEQ IDNo.21所示。然后获得依次连接的“glpF-gmk-ilvD-pta-pur-pycA-tpi”序列。IPPBiotCo1085的“glpF-gmk-ilvD-pta-pur-pycA-tpi”序列如SEQ ID No.22所示。

2.实验菌株的等位基因及ST分型结果

采用MLST技术分析芽胞杆菌的7个持家基因位点的核苷酸多态性。在pubMLST网站进行序列分型的确定。该菌对应的“glpF-gmk-ilvD-pta-pur-pycA-tpi”这一组持家基因编号的组合称为等位基因图谱(Allelic profile)，并给这个等位基因谱分配一个唯一的编号作为该分离株的核酸型或序列型(Sequence type，STs)。经确认，IPPBiotCo1085具有新的ST型，说明其为一株不同于现有菌株的新菌株。

3.系统发育分析

采用MEGA 6.0软件对IPPBiotCo1085和上述已知标准菌株的ST型的联合基因序列(长度均为2829bp)构建NJ聚类图，在核苷酸水平上对芽胞杆菌进行遗传聚类分析，见图1。结果IPPBiotCo1085菌株与苏云金芽胞杆菌聚合在一起，说明IPPBiotCo1085菌株在分类上属于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)，并且与已知的任何其他菌株不同，是一个新菌株。

该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13303，保藏日期为2016年11月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。

YH1662427CN 核苷酸序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>一种苏云金芽胞杆菌及其应用

<130> YH1662427CN

<160>22

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>glpF_F引物

<400> 1

GCGTTTGTGCTGGTGTAAGT；

<210>2

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> glpF_R引物

<400>2

CTGCAATCGGAAGGAAGAAG；

<210>3

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<223> gmk_F引物

<400>3

ATTTAAGTGAGGAAGGGTAGG；

<210>4

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> gmk_R引物

<400>4

GCAATGTTCACCAACCACAA；

<210>5

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> ilvD_F引物

<400> 5

CGGGGCAAACATTAAGAGAA；

<210>6

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> ilvD_R引物

<400>6

GGTTCTGGTCGTTTCCATTC；

<210>7

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pta_F引物

<400>7

GCAGAGCGTTTAGCAAAAGAA；

<210>8

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pta_R引物

<400>8

TGCAATGCGAGTTGCTTCTA；

<210>9

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pur_F引物

<400>9

CTGCTGCGAAAAATCACAAA；

<210>10

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pur_R引物

<400>10

CTCACGATTCGCTGCAATAA；

<210>11

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pycA_F引物

<400>11

GCGTTAGGTGGAAACGAAAG；

<210>12

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> pycA_R引物

<400>12

CGCGTCCAAGTTTATGGAAT；

<210>13

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> tpi_F引物

<400>13

GCCCAGTAGCACTTAGCGAC；

<210>14

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> tpi_R引物

<400>14

CCGAAACCGTCAAGAATGAT；

<210>15

<211>372

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> glpF

<400>15

GCAGCGTATGCGGTTGGATCAATTAGTGGGGCACATTTGAATCCAGCTTTAACGATAGGACTAGCATTTAAGGGAGCGTTCCCATGGAGTGACGTACCAGGTTATATCGTAGCACAAATGATTGGGGCAATTATCGGGGCAGTTATCGTATATTTACATTACTTACCACACTGGAAAGAAACAGAAGATCCAGGAACAAAGTTAGGTGTATTTGCAACAGGTCCAGCAATTCCGAACACATTTGCAAACCTTTTAAGTGAAATGATTGGAACATTCGTTTTAGTATTTGGTATATTAGCAATTGGTGCAAATAAATTTGCAGATGGATTAAATCCATTTATCGTAGGTTTCTTAATTGTAAGTATTGGTTTA；

<210>16

<211>504

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> gmk

<400>16

GTTCTTTCAGGGCCTTCTGGGGTTGGAAAAGGAACGGTTCGTAAAGAGCTGTTTAGCCATGAGGATACACGTTTTCAGTACTCTATTTCAGTAACGACACGTAAGCCGCGTGAAGGTGAAGTAGATGGTGTGGATTATTTCTTTAAAGAAAGAGAAGAATTCGAGGAAATGATTCGTAATGAAAGATTACTTGAGTGGGCTGAGTTCGTAGGTAATTATTACGGAACACCGATTGACTATGTTGAAAAAACATTACAAGAAGGAAAAGATGTATTCTTAGAAATTGAAGTGCAAGGAGCA

ATTCAAGTTAAGAAAGCTTTCCCAGAAGGTGTATTTATTTTCTTAGCACCTCCAAGTTTATCTGAACTAAAGAGCCGTATTGTCGGCCGTGGTACAGAGACTGAAGATGTTATTGAAAATCGTTTAACTGTAGCGAAAGAAGAAATCGAGATGATGGACGCTTACGACTATGTAGTAGAAAACGATCAAGTTGAATTAGCTTGT；

<210>17

<211>393

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> ilvD

<400>17

GAAGAGGGGGGCTTACGTATATTAAAAGGAAATCTTGCTAAAGATGGAGCGGTTATTAAAAGCGGTGCAACAGAGGTAAAGCGTTTTGAAGGGCCTTGCGTTATTTTTAATTCACAAGATGAGGCACTTGCGGGCATTATGCTTGGGAAAGTGAAAAAAGGAGATGTAGTTGTCATTCGTTATGAAGGACCAAGAGGTGGCCCTGGTATGCCAGAAATGTTAGCCCCAACATCAGCAATTGCTGGAATGGGATTAGGTGCTGAGGTTGCATTATTAACAGATGGACGTTTTTCTGGAGCTTCACGTGGAATTTCAGTAGGACATATTTCACCAGAAGCAGCAGCGGGCGGGATGATTGCACTTCTTGAACAAGGGGATATTGTATGTATTGAT；

<210>18

<211>414

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> pta

<400>18

AATTTAACATTAGCAGGCGTTGATATTTATGACCCAGCTACATATGAAGAAATGGATGCAATGGTAGCATCTTTCGTTGAACGCCGTAAAGGTAAAGCAACTGAAGAAGACGCTCGCAAAATCCTTAAAGACGAAAACTACTTCGGTACAATGCTTGTATACATGGGCAAAGCACACGGTTTAGTAAGTGGTGCAGCTCACTCTACAGCTGATACAGTTCGTCCAGCACTTCAAATCATTAAAACAAAACCAGGCGTTACAAAAACTTCTGGCGTATTCATCATGGTACGTGAAGAAGAG

AAATATGTATTCGCTGATTGCGCAATTAACATTGCACCAAACAGCCAAGATTTAGCTGAAATTGGTATCGAGAGTGCAAAAACTGCTGAATTATTCGGTATTGACCCACGCGTT；

<210>19

<211>348

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> pur

<400>19

AAACGTAAACTAGCAGCGAAAGTATTCCGTCATACAGCAGCGTATGATGCGTTAATTTCTAACTACTTAACAGAGCAAATGGGTGAAGAAAGTCCAGAAACATTAACTGTGACATTTGAGAAAAAGCAAGACTTACGTTATGGCGAGAACCCACATCAAAAGGCAACTTTCTATAAAGCGCCATTCGCAGCAACTTCTTCTGTTGCATACGCAGAACAATTACACGGTAAAGAATTATCGTATAACAATATTAATGATGCAGACGCAGCACTTAGCATCGTAAAAGAATTTACAGAACCA

GCAGTAGTAGCAGTAAAACATATGAATCCATGTGGTGTTGGAGTAGGA；

<210>20

<211>363

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> pycA

<400>20

TACTATGCACCGTTTGAAAGTGGTATGAATGCGCCTCATACAGAGGTATATATGCATGAAATGCCGGGTGGGCAGTATAGTAATCTTCAGCAACAAGCGAAGGCGGTTGGTTTAGGAGATCGCTTCGATGAAGTGAAAGTAATGTACCGCCGTGTGAATGACATGTTTGGAGATATTGTAAAAGTAACGCCATCATCAAAAGTTGTTGGTGATATGGCATTATTTATGGTTCAAAACCATCTGACAGAACAAGATGTTTTAGAGCGTGGACATGCTATGGACTTCCCAGGATCTGTTGTTGAAATGTTCTCTGGTGATTTAGGTCAACCGTACGGTGGTTTCCCGAAAGAATTACAAAAGATT；

<210>21

<211>435

<212> DNA

<213>苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）

<223> tpi

<400>21

GAATCAGTAAACAAAAAGACTCTAGCAGCATTTGAACATGGTTTAACACCAATCGTATGTTGTGGTGAGACTTTAGAAGAGCGCGAAAGCGGAAAAACATTTGATCTAGTAGCAGGTCAAGTGACAAAAGCACTTGCAGGTTTAACAGAAGAGCAAGTTAAAGCAACTGTTATCGCTTATGAGCCTATCTGGGCTATCGGTACAGGTAAATCTTCTTCTTCTGCAGATGCAAATGAAGTATGTGCGCACATCCGTAAAGTTGTTGCAGAAGCTGTTTCTCCAGAAGCTGCAGAAGCTGTTCGTATTCAATACGGCGGTAGCGTAAAACCAGAAAACATTAAAGAGTATATGGCACAATCTGACATCGACGGCGCTTTAGTTGGCGGTGCTAGCTTAGAGCCTGCTTCGTTCTTAGGTCTTCTGGGGGCGGTAAAA；

<210>22

<211>2829

<212> DNA

<213>人工序列

<223> glpF-gmk-ilvD-pta-pur-pycA-tpi

<400>22

GCAGCGTATGCGGTTGGATCAATTAGTGGGGCACATTTGAATCCAGCTTTAACGATAGGATTAGCATTTAAGGGAGCGTTCCCATGGAGTGACGTACCAGGTTATATCGTAGCACAAATGATTGGGGCAATTATCGGGGCAGTTATCGTATATTTACATTACTTACCACACTGGAAAGAAACAGAAGATCCAGGAACAAAGTTAGGTGTATTTGCAACAGGTCCAGCAATTCCGAACACATTTGCAAACCTTTTAAGTGAAATGATTGGAACATTCGTTTTAGTATTTGGTATATTAGCAATTGGTGCAAATAAATTTGCAGATGGATTAAATCCATTCATCGTAGGTTTCTTAATTGTAAGTATTGGTTTAGTTCTTTCAGGGCCTTCTGGGGTTGGAAAAGGGACGGTTCGTAAAGAGCTGTTTAGCCATGAGGATACACGTTTTCAGTACTCTATTTCAGTAACGACACGTAAGCCGCGTGAAGGTGAAGTAGATGGTGTGGATTATTTCTTTAAAGAAAGAGAAGAATTCGAGGAAATGATTCGTAATGAAAAATTACTTGAGTGGGCTGAGTTCGTAGGTAATTATTACGGAACACCGATTGACTATGTTGAAAAAACATTACAAGAAGGAAAAGATGTATTCTTAGAAATTGAAGTGCAAGGAGCAATTCAAGTTAAGAAAGCTTTCCCAGAAGGTGTATTTATTTTCTTAGCACCTCCAAGTTTATCTGAACTAAAGAGCCGTATTGTCGGACGTGGTACAGAGACTGAAGATGTTATTGAAAATCGTTTAACTGTAGCGAAAGAAGAAATCGAGATGATGGACGCTTACGACTATGTAGTAGAAAACGATCAAGTTGAATTAGCTTGTGAGGAAGGAGGATTGCGTATATTAAAAGGAAACCTTGCGAAAGATGGAGCTGTTATTAAAAGCGGTGCAACAGAGGTAAAGCGTTTTGAAGGACCTTGCGTTATTTTTAATTCACAAGATGAGGCACTTGCTGGCATTATGCTTGGGAAAGTGAAAAAAGGAGATGTAGTTGTCATTCGTTATGAAGGACCAAGAGGTGGCCCTGGTATGCCAGAAATGTTAGCACCAACGTCAGCGATTTCACGTGGTATTTCAGTAGGGCATATTTCACCAGAAGCAGCTGCGGGCGGAACGATTGCGGCTGGTATGGGATTAGGTGCAGATGTTGCGCTATTAACGGATGGTCGTTTCTCGGGTGCTCTTCTTGAACAAGGGGATATCGTTTGTATCGATAATTTAACATTAGCAGGCGTTGATATTTACGACCCAGCTACATACGAAGAAATGGATGCAATGGTAGCATCTTTCGTTGAACGCCGTAAAGGTAAAGCAACTGAAGAAGACGCTCGCAAAATCCTTAAAGACGAAAACTACTTCGGTACAATGCTTGTATACATGGGAAAAGCACACGGTTTAGTAAGTGGTGCAGCTCACTCTACAGCTGATACAGTTCGTCCAGCACTTCAAATTATTAAAACAAAACCAGGCGTTACAAAAACTTCTGGCGTATTCATTATGGTACGTGAAGAAGAGAAATATGTATTCGCTGATTGCGCAATTAACATTGCACCAAACAGCCAAGATTTAGCTGAAATCGGTATCGAAAGTGCGAAAACTGCTGAGTTATTCGGCATTGATCCACGCGTTAAACGTAAATTAGCAGCGAAAGTATTCCGTCATACAGCAGCGTATGATGCGTTAATTTCTAACTACTTAACAGAGCAAATGGGTGAAGAAAGTCCAGAAACATTAACTGTGACATTTGAGAAAAAGCAAGACTTACGTTATGGCGAGAACCCACATCAAAAAGCAACTTTCTATAAAGCGCCATTCGCAGCAACTTCTTCTGTTGCATACGCAGAACAATTACACGGTAAGGAATTATCGTATAACAATATTAATGATGCAGACGCAGCGCTTAGCATCGTAAAAGAATTTACAGAACCAGCAGTAGTAGCAGTAAAACATATGAATCCATGTGGTGTTGGAGTAGGATACTATGCACCGTTTGAAAGTGGTATGAATGCGCCTCATACAGAGGTATATATGCATGAAATGCCGGGTGGGCAGTATAGTAATCTTCAGCAACAAGCGAAAGCGGTTGGTTTAGGAGATCGTTTCGATGAAGTGAAAGTAATGTACCGCCGTGTGAATGACATGTTTGGAGATATTGTAAAAGTAACGCCATCATCAAAAGTTGTTGGTGATATGGCATTATTTATGGTTCAAAACCATCTGACAGAACAGGATGTTTTAGAGCGTGGGCATGCGATGGACTTCCCAGGGTCTGTTGTTGAAATGTTCTCGGGTGATTTAGGTCAACCGTACGGTGGTTTCCCGAAAGAATTACAAAAGATTGAGTCAGTAAACAAAAAGACTATCGCAGCATTTGAACATGGTTTAACACCAATCGTATGTTGTGGTGAGACTTTAGAAGAGCGCGAAAGCGGAAAAACATTTGATCTAGTAGCAGGTCAAGTGACAAAAGCACTTGCAGGTTTAACAGAAGAGCAAGTTAAAGCAACTGTTATCGCTTATGAGCCAATCTGGGCTATCGGTACAGGTAAATCTTCTTCTTCTGCAGATGCAAACGAAGTATGTGCGCACATCCGTAAAGTTGTTGCAGAAGCTGTTTCTCCAGAAGCTGCAGAAGCTGTTCGTATCCAATACGGCGGTAGCGTAAAACCAGAAAACATTAAAGAGTATATGGCACAATCTGACATCGACGGCGCTTTAGTTGGCGGTGCTAGCTTAGAGCCTGCTTCGTTCTTAGGTCTTCTGGGGGCGGTAAAA。

Claims

1.一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌株被定名为IPPBiotCo1085，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13303。

2.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌。

3.一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌和如权利要求2所述的组合物中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的农药制剂，其特征在于，所述农药制剂的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。

5.如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌、如权利要求2所述的组合物以及如权利要求3或4所述的农药制剂中的至少一种的在用于防治大猿叶甲(Colaphellus bowring)、小猿叶甲(Phaedon brassicae Baly)、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)中至少一种的应用。