CN115627247B - 一种复合微生物肥料制备及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合菌剂，其含有暹罗芽胞杆菌、东方醋酸菌、临高链霉菌、永兴链霉菌和棘孢木霉中的两种或以上，本发明还提供了一种复合微生物菌肥及其制备方法和应用。本发明将不同功能微生物组合形成复合菌剂，对香蕉枯萎病有良好的防控效果，还能促进香蕉幼苗的生长，恢复病原菌破坏的土壤微生物生态等，本发明的复合菌剂经发酵后可获得高效、稳定、群落多样性丰富的复合微生物菌肥，能在土壤中很好的定殖，协同促进土壤益生菌和拮抗菌的生长繁殖，增加土壤微生物多样性，进而抑制土壤中病原微生物的生长和繁殖，优化土壤微生物的群落结构和影响土壤微生物优势种群。

Description

一种复合微生物肥料制备及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种复合微生物肥料制备及其制备方法和应用。
背景技术
香蕉富有营养，植株生长迅速，经济价值高，是很多地区的经济支柱。但是香蕉种植业目前存在着一种号称“香蕉绝症”的疾病—香蕉枯萎病。香蕉枯萎病又被称作香蕉巴拿马病、黄叶病，香蕉枯萎病的病原真菌是尖孢镰刀菌古巴专化型（ Fusarium oxysporum f.  sp. cubense），该病原菌能够破坏香蕉植株的维管束，并最终导致植株死亡，具有毁灭性。该病通过土壤传播，一旦一片蕉园发病了，那该蕉园的土壤都具有致病菌，没办法继续种植香蕉，因此该枯萎病严重威胁着香蕉产业的发展和安全。目前生物防治因其具有高效、绿色等优点，被认为是最有效的香蕉枯萎病防治方法。
对防病促生的多功能菌肥的研究，是当前复合生物菌肥研究的热点之一，同时起到促进作物生长和防治植物病害的作用，并且能够提高土壤肥力，对环境不会造成负担，这些都是很符合可持续发展农业的发展需求，为香蕉枯萎病的生物防治提供了新的思路。
对于微生物肥料的研究最早是从豆科植物的根瘤菌开始，主要是大豆和花生这两种豆科植物的根瘤菌剂。从菌肥的发展历程看，可以发现菌肥包含的菌种的范围处于不断扩大的趋势，而且对于菌肥的功能也强调的是多功能的组合，材料上强调多菌种的混合，乃至无机或有机材料与菌种的混合（孟瑶等，2008；郭永利等，2012）。要使菌肥能够在农业上扩大影响力，需要做到以下几个方面：选育功能强大的菌株，并且提高功能发挥的速率；加速菌肥商品化、产业化的实现，同时通过优化生产工艺和仪器设备，提高菌肥质量；建立健全行业标准，在标准确立的情况下要做到依据标准严格执行质量监督、市场管理等等（陈思茹等，2014）。
微生物肥料的分类，主要按照几个方面分：包含的微生物、内含物、剂型、作用机理、成品性状。微生物肥料具有以下几个优点：
（1）菌肥能够提高土壤肥力。解磷解钾菌可以在生命活动中将土壤中的无效磷和无效钾转化为可被植株吸收的速效磷和速效钾，同时释放土壤中的铁、镁、硅、铝等要素，提高土壤营养水平（麻瑞阳，2013；蒋宝贵等，2005；刘晚苟等，2014）。固氮菌通过生物固氮作用，将氮气转化为植物可吸收的氨，增加土壤中的氮含量（马杰，2009；Colnaghi et al.，1997）。
（2）菌肥有利于提高植株的产量。许多的微生物在其生命活动中可以产生刺激植物生长的生物活性物质，例如细胞分裂素、生长素、赤霉素等，这些生物活性物质与植物接触，刺激植物生长，从而促进作物增产（王粉莲等，2010；Lin et al.，2008；Çakmakçı etal.，2014）。有的菌肥还能增加植株的光合作用，提高作物有机质的积累（陈慧，2014）。另外，菌肥还对作物的果实产量与品质有着提高作用（Wang et al.，2003）。
（3）菌肥能提高植株抗病抗逆能力。菌肥中的部分菌种胞外分泌的抑菌活性物质和杀虫物质不仅可以有效杀死致病菌，杀死害虫，抑制植物病虫害的发生（Elhadad etal.，2011），而且能促进植株蛋白质、核酸合成，提高植物的抗逆抗病能力。另外，菌肥的部分菌株可以土壤中的有害物质进行转化与固定，从而减少了有害物质对植株的毒害作用（黄敦元等，2013）。
（4）菌肥能够减少化肥的使用，有效降低环境污染。化肥的不合理使用，带来土壤退化的问题，还有土壤污染问题。另外，化肥的生产还会带来水体和大气的污染。而菌肥不会破坏土壤结构，引起土壤退化，对生物无毒害作用，还能调节土壤酸碱度。另外，菌肥的生产本身成本低廉，工艺简单，无毒害，无残留，还能分解环境中残留物，净化环境。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，以功能微生物合成菌群的概念作为立足点，通过对分离的功能菌进行筛选，筛选出功能最为强大，且生长状况良好的各种功能菌，并研究功能菌的抑菌机理。将筛选出来的功能菌进行共生实验，确定各个菌株能够共生，并通过抗生素标记的方法对培养的功能微生物群落进行动态分析，构建合成菌群，制备复合微生物液体菌肥。对各个显著影响群落生长的因素进行实验研究，优化该群落的培养条件，研究出该功能微生物群落最适的培养条件。最后通过盆栽试验，对盆栽植物的生长特性、土壤的理化性质以及微生物多样性的变化进行动态分析，研究微生物菌肥的防病、解磷、解钾、固氮、促生长功能以及与复合肥搭配使用的效果，为微生物菌肥的大田试用以及推广使用提供了实践基础与科学依据，也对农作物的产量与质量的提高提供了一个新的方向。
本发明的第一个方面是提供一种复合菌剂，所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌、东方醋酸菌、临高链霉菌、永兴链霉菌和棘孢木霉中的两种或以上。
其中，所述暹罗芽胞杆菌为暹罗芽胞杆菌QN2MO-1（ Bacillus siamensisQN2MO-1），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021305；
其中，所述东方醋酸菌为东方醋酸菌 ( Acetobacter orientalis)XJC-C，于2020年04月20日，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC NO：19592；
其中，所述临高链霉菌为临高链霉菌1-7（ Streptomyces lingaoensissp. nov.1-7），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021300；
其中，所述永兴链霉菌为永兴链霉菌2-11（Streptomyces Yongxingensis sp.nov. 2-11），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 2021303；
其中，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7 (Trichoderma asperellum MM7)，于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
优选地，根据按照有效活菌数量计，所述复合菌剂中，如果存在暹罗芽胞杆菌，则所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌1-100份（例如1份、5份、10份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等）；如果存在东方醋酸菌，则所述复合菌剂含有东方醋酸菌1-100份（例如1份、5份、10份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等）；如果存在临高链霉菌，则所述复合菌剂含有临高链霉菌1-100份（例如1份、5份、10份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等）；如果存在永兴链霉菌，则所述复合菌剂含有永兴链霉菌1-100份（例如1份、5份、10份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等）；如果存在棘孢木霉，则所述复合菌剂含有棘孢木霉1-100份（例如1份、5份、10份、20份、30份、40份、50份、60份、70份、80份、90份、100份等）。
优选地，所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌、东方醋酸菌、临高链霉菌、永兴链霉菌和棘孢木霉中的两种或以上，且含有棘孢木霉。
优选地，所述复合菌剂含有所述暹罗芽胞杆菌QN2MO-1和所述东方醋酸菌XJC-C。
优选地，所述复合菌剂含有所述临高链霉菌1-7和所述永兴链霉菌2-11。
优选地，所述复合菌剂含有所述棘孢木霉MM7、所述暹罗芽胞杆菌QN2MO-1和所述东方醋酸菌XJC-C。
优选地，所述复合菌剂含有所述棘孢木霉MM7、所述临高链霉菌1-7和所述永兴链霉菌2-11。
优选地，所述复合菌剂含有所述暹罗芽胞杆菌QN2MO-1、所述东方醋酸菌XJC-C、所述临高链霉菌1-7和所述永兴链霉菌2-11。
优选地，所述复合菌剂含有所述暹罗芽胞杆菌棘孢木霉MM7、QN2MO-1、所述东方醋酸菌XJC-C、所述临高链霉菌1-7和所述永兴链霉菌2-11。
本发明的第二个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂的发酵液。
本发明的第三个方面是提供一种复合微生物菌肥，其含有本发明第一方面所述的复合菌剂的发酵液、或者棘孢木霉的发酵液，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂、或者棘孢木霉、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三方面所述的复合微生物菌肥在制备防治香蕉枯萎病制剂中的应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂、或者棘孢木霉、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三方面所述的复合微生物菌肥在制备促进香蕉幼苗生长的制剂中的应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂、或者棘孢木霉、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三方面所述的复合微生物菌肥在恢复被病原菌破坏的土壤微生物生态中的应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂、或者棘孢木霉、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三方面所述的复合微生物菌肥在降低土壤中Foc TR4的数量、和/或提高了土壤中细菌和放线菌的数量中的应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一方面所述的复合菌剂、或者棘孢木霉、或者本发明第二个方面所述的发酵液、或者本发明第三方面所述的复合微生物菌肥在提高感染香蕉枯萎病香蕉根际土壤中芽孢杆菌属、和/或黄单胞菌属相对丰度、和/或降低感染香蕉枯萎病香蕉根际土壤中病原菌镰刀菌属相对丰度中的应用，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
本发明第九个方面是提供一种如本发明第三个方面所述的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，在发酵营养液中接入本发明第一个方面所述的复合菌剂进行发酵培养；或者在发酵营养液中接入棘孢木霉进行发酵培养，所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7，在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
优选地，发酵营养液中的碳氮比为25:1。例如由豆粕和糖蜜加适量水制成的碳氮比为25:1的发酵营养液。
本发明将不同功能微生物组合形成复合菌剂，对香蕉枯萎病有良好的防控效果，还能促进香蕉幼苗的生长，恢复病原菌破坏的土壤微生物生态等，本发明的复合菌剂经发酵后可获得高效、稳定、群落多样性丰富的复合微生物菌肥，能在土壤中很好的定殖，协同促进土壤益生菌和拮抗菌的生长繁殖，增加土壤微生物多样性，进而抑制土壤中病原微生物的生长和繁殖，优化土壤微生物的群落结构和影响土壤微生物优势种群。
附图说明
图1为临高链霉菌1-7的系统发育树。
图2为不同复合微生物肥料处理对香蕉茎粗的影响。
图3为不同复合微生物肥料对香蕉苗鲜重和干重的影响。
图4为不同复合微生物肥料处理后微生物优势群落相对丰度柱形图。
图5为不同复合微生物肥料处理后土壤微生物群落Heatmap图。
图6-8为基于T-检验的组间差异物种分析。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1试验材料
1.1供试病原菌
香蕉枯萎病菌四号生理小种 Fusarium oxysporumf. sp. Cubensetropical Race4 （ FocTR4，ATCC 76255）。
1.2主要试剂
本试验所用主要试剂见表1。
表1 主要试剂及来源
1.3试验仪器与设备
本试验所需主要仪器与设备见表2。
表2 仪器与设备
1.4主要培养基
 本研究主要供试培养基，见表3。
表3 主要培养基及配方
1.5供试香蕉苗
香蕉组培苗均为生长较为一致，5~6叶期的健康巴西蕉杯苗，由中国热带农业科学院儋州组培中心提供。
供试土壤
试验所用土壤取海南省儋州市香蕉园(109°54'66"E, 19°44′63"N)，土质为红壤土。
供试功能菌株信息
本试验供试菌种如表4示。
表4供试菌种信息
（1）暹罗芽胞杆菌QN2MO-1
暹罗芽胞杆菌QN2MO-1（ Bacillus siamensisQN2MO-1），保藏编号为CCTCC NO：M2021305，保藏日期为2021年3月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，从诺尼活株果实中分离、筛选得到。暹罗芽胞杆菌QN2MO-1的菌学特性等参见中国专利申请号为202110415167.4，发明名称为“一株诺尼内生暹罗芽胞杆菌的应用”的专利申请。
（2）东方醋酸菌XJC-C
东方醋酸菌XJC-C（Acetobacter orientalis XJC-C），保藏编号为CGMCC NO：19592，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，从南海软珊瑚中分离、筛选得到。东方醋酸菌XJC-C的菌学特性等参见中国专利申请号为202011194208.3，发明名称为“一种用于纤维素降解的东方醋酸菌及应用”的专利申请。
（3）临高链霉菌1-7
临高链霉菌1-7（ Streptomyces lingaoensissp. nov.1-7），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300。从采自中国海南临高（109◦ 51′17′′E，19◦ 47′ 1 ′′N）香蕉根际土壤样品中分离得到。
对临高链霉菌1-7菌株采用插片法（Park et al., 2004）进行形态学观察，菌株1-7在Gause’s no. 1培养基上产生浅黄色基内菌丝，随着年龄增长颜色加深；形成灰白色气生菌丝，气生菌丝分化为螺旋状孢子链；产生灰黑色气生孢子团，孢子具皱纹状纹饰。参照《常见细菌系统鉴定手册》对临高链霉菌1-7进行生理生化分析，结果显示：临高链霉菌1-7在ISP2、ISP4、ISP7和Gause’s no. 1培养基上生长良好，气生菌丝较发达，呈灰色和白色，基内菌丝丰富多样，颜色由白到淡黄，再到亮黄；菌株1-7可以利用的碳源有α-乳糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、棉子糖、蜜二糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖等；菌株1-7可利用的氮源有L-丝氨酸、L-苯基丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、L-羟基脯氨酸、L-半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、氯化铵、L-天门冬酰胺、酪氨酸、蛋氨酸、色氨酸等；菌株1-7具有多种酶学活性，可使明胶液化和硝酸盐还原，可产生过氧化氢酶、淀粉酶、酯酶和脲酶；菌株1-7能产生H2S，但MR和VP试验均为阴性；菌株1-7耐受pH值范围为5-10，最适生长pH值为6；在NaCl中耐受范围为0-7%，最适生长盐浓度范围为5-6%；可耐受温度范围为15-45℃，最适生长温度为30℃；菌株1-7对克林霉素、氯霉素、多西环素、新霉素、诺氟沙星(氟哌酸)、庆大霉素、头孢他啶、头孢拉定、头孢唑啉、麦迪霉素、苯唑西林、哌拉西林(氧哌嗪青霉素)表现出较强的抗药性。对万古霉素、环丙沙星（悉复欢）、氧氟沙星（泰利必妥）、米诺环素、卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星(丁胺卡那霉素) 表现为高敏，对多粘菌素B和头孢曲松表现为中敏。
采用通用引物27F（5ʹ-AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG-3ʹ）和1492R（5ʹ-TACGGCTACCTT GTTA CGAC TT-3ʹ）进行PCR的扩增。PCR的反应体系见表5，PCR扩增的反应条件见表6。产物纯化后测定基因序列，将测得的16S rRNA基因序列与保存在公共数据库GenBank和EzBiocloud服务器（https://www.EzBiocloud.net/identify）（Kim et al.，2012）中已知的16S rRNA序列进行同源性比较，选取25株同源性较高的标准菌株，利用MEGA versionX软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树（图1）。菌株1-7确定为链霉菌属（Streptomyces），与标准菌株 Streptomyces albospinusNBRC 13846 (AB184527)显示最高的同源性，分别为98.8%，且在系统发育树中形成一个独立、稳定的大分支，分支自展值为64%，亲缘关系最近，结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，将菌株1-7鉴定为Streptomyces属新种，命名为临高链霉菌1-7（ Streptomyces lingaoensissp. nov.1-7）。
表5 临高链霉菌1-7 16S rRNA序列PCR反应体系
表6 临高链霉菌1-7 16S rRNA序列PCR扩增反应条件
依据糖蜜的含碳量，取糖蜜15.0g，加入无菌水1000mL，配制成营养液，装入5L的三角瓶中，121℃灭菌30分钟备用。配置YE液体培养基，分装在250mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟，待冷却后接入新鲜的供试菌种，在28～30℃条件下，180rpm/min摇床培养3天后，取活化后的链霉菌1-7，按2%的接菌量接入灭菌好的营养液中，于28～30℃，180rpm/min摇床条件下，发酵培养7d。用点接平板对峙法（Sharma et al., 2016）对用打孔器取下新鲜的表7所示8种植物病原菌的菌饼(Φ=5 mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5 cm处的四个点处接入10μL发酵液，以等量的无菌培养液为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7 d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照公式“”计算抑菌率，式中：R1是对照组的病原菌菌落直径，R2是处理组的病原菌菌落直径。结果如表7所示，临高链霉菌1-7具有广谱抑菌活性。
表7临高链霉菌1-7对8种植物病原真菌的抑菌活性
（4）永兴链霉菌2-11
永兴链霉菌2-11（ StreptomycesYongxingensissp.nov.），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。从南海软珊瑚分离获得。永兴链霉菌2-11的菌学特性等参见中国专利申请号为202111205925.6，发明名称为“一种抗香蕉枯萎病的链霉菌新种及其应用”的专利申请。
（5）棘孢木霉MM7
棘孢木霉MM7（ Trichoderma asperellumMM7），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。从香蕉根际土壤分离获得。棘孢木霉MM7的菌学特性等参见中国专利申请号为202111570689.8，发明名称为“一种捕食香蕉枯萎病菌的棘孢木霉及其应用”的专利申请。
试验方法与结果
2.1功能菌株的共生实验
配制LB培养基，121 ℃灭菌20 min备用。在LB平板上相对应的两边都划线接上菌株，然后再在各个线上十字交叉，间隔相同，将其他菌株划线接上菌株。在28 ℃下倒置培养3 d，观察各个菌株的生长情况，确认各个功能菌株是否能够共生。
将5株功能菌分别接种到LB培养基平板上，以一株菌作为待测菌，其他菌株与其进行交叉培养，分别进行共生拮抗实验，经过培养发现，各个菌株都能与其他菌株良好共生，相互之间没有拮抗性，共生性较强，适合构建稳定的功能微生物合成菌群。
复合微生物菌肥制备中功能菌群发酵稳定性分析
从各个标记菌株的种子液各取1 mL后接入发酵培养基中混合培养，培养5 d，每天观察各个菌株的数量。实验结果如表8所示。从表8我们可以看出，每株菌都能够在发酵培养基中正常生长，从1~3 d，都处于潜伏期，从第3 d到第4 d开始功能菌菌体数量急剧增加，到了第5 d之后，每株菌的数量都有部分降低，但是幅度不大，菌体数量保持在一定水平上。因此，通过发酵过程各菌株的生长情况，可以确定制备的复合微生物肥料中合成菌群是稳定的。
表8 功能菌群发酵过程菌体数量变化情况
2.3复合微生物肥料的制备
制备原料：豆粕、糖蜜、复合菌剂（如表9所示）。
经中国热带农业科学院分析测试中心测得，豆粕含氮量为7.0%，C/N为6.76，糖蜜含碳量为48.25%。本试验依据豆粕碳氮比和糖蜜的含碳量，调节基质碳氮比为25:1，取豆粕80kg，糖蜜20.kg，无菌水1000 L，配制成糖蜜和豆粕混合营养液，装入1000L的不锈钢发酵罐中，121℃灭菌30分钟冷却备用。
配置LB液体培养基，分装在250mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟，待冷却后接入新鲜的供试菌种，在28～30℃条件下，180rpm/min摇床培养3天后，按表8的菌种组合以2%的接菌量接入新配置的发酵营养液中，于28～30℃，有氧发酵12d，制成复合微生物肥料。
表9 菌种组合
2.4盆栽实验
盆栽实验于2020年6-8月在中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所进行。温室条件为28℃，湿度70%，自然光照。从海南省儋州市采集蕉园健康土壤，20目过筛。选取生长一致、3-4片叶子的香蕉幼苗，无菌水冲洗干净，切下第二条主根，种植于装有1400g土的塑料盆中，每个处理30株。实验设9个处理组：CK（不接病原菌，施无菌水）；A（接种 FocTR4-GFP，施不加菌复合微生物肥料）；B（接种 FocTR4-GFP，施B组合复合微生物肥料）；C（接种 FocTR4-GFP，施C组合复合微生物肥料）；D（接种 FocTR4-GFP，施D组合复合微生物肥料）；E（接种 FocTR4-GFP，施E组合复合微生物肥料）；F（接种 FocTR4-GFP，施F组合复合微生物肥料）；G（接种 FocTR4-GFP，施G组合复合微生物肥料）；H（接种 FocTR4-GFP，施H组合复合微生物肥料）。按不同处理施入稀释50倍的复合微生物肥料，每株100mL，试验期间，各处理的其它管理措施均一致。
复合微生物肥料防控效果统计
根据Himaman et al.,（2016）的描述，每组共选取21株香蕉幼苗，对接种49 d的病情指数（DI）进行评价。共分为5个等级，以一棵植株中黄化病叶占比计算，0级：健康植物，1级：1-25%的黄化病叶，2级：26-50%的黄化病叶，3级：51-75%黄化病叶，4级：75%以上黄化病叶。香蕉枯萎病的病情指数（DI）计算公式如下所示:
结果如表10所示，经不同合成菌群复合微生物肥料处理的香蕉苗，枯萎病病情指数和防控效果之间存在显著性差异，且成活株数也不尽相同。拮抗菌群复合微生物菌肥处理过的香蕉植株，其病情指数均显著低于不加菌处理A（75.21），其中以H组合复合微生物肥料处理的病情指数最低，为10.27，防控效果达84.22%，与其他处理间差异极显著（P<0.05）。其次为E、F和G处理，病情指数分别为22.67、20.55和23.52，防控效果分别为70.28%，73.91%和69.65%，三者无显著性差异。各处理对香蕉枯萎病的防控效果相对较好，除了A为7.55%，其他处理防控效果均达39%以上，以H处理的防控效果最佳，高达84.22%。因此，H组合复合微生物肥料为最佳合成菌群组合，制成产品效果最佳。
表10 不同复合微生物肥料处理对香蕉枯萎病病情指数及防控效果的影响
注：表中各列不同字母表示在0.05水平上差异显著
2.4.2香蕉苗生理指标测定
根据Chen et al.（2018）方法测定了香蕉幼苗移栽42天的生理指标，包括叶绿素含量、株高、茎粗、叶面积、叶片厚度、鲜重和干重。
（1）香蕉苗叶绿素含量的测定
通过SPAD-502便携式叶绿素测定仪进行测定，选取香蕉苗顶上第二展开叶，分别测量叶片两侧底部、中部、上部边缘的叶绿素含量。
叶片中的叶绿素含量与香蕉植株的健康生长息息相关，因为它们与光合作用直接相关，当香蕉植株发病时，叶片中的叶绿素的合成将会受到干扰，甚至叶绿素遭到破坏，降低了植株的光合作用的效率，抑制了植株的生长发育。不同处理对香蕉苗叶片叶绿素含量的影响的实验结果如表11所示，施加无菌微生物肥料的处理A的叶绿素含量最低0.72 mg/g，处理B和处理C的叶绿素含量没有多大的差别，分别为0.93 mg/g和0.88 mg/g，处理C和处理D的叶绿素含量轻微有上升趋势，分别为1.14mg/g和1.17mg/g，两者无显著性差异。处理F表现出明显的上升，叶绿素含量高达1.25mg/g，然复合微生物肥料处理H叶绿素含量显著高于其他处理，这是因为复合微生物肥料对香蕉苗的促生作用，能够有效提高叶片叶绿素含量，增强植株的光合作用效率，促进植株的健康生长。
表11 不同复合微生物肥料处理对香蕉叶绿素含量、叶面积及根系生长的影响
处理 叶绿素含量（mg/g） <![CDATA[叶面积 （cm<sup>2</sup>/株）]]> 根长 （cm） 根直径 （mm）
CK 1.40 ± 0.07 1472.31 ± 30.05 1596.44 ± 25.89 1.08 ± 0.05
A 0.72 ± 0.06 576.55 ± 22.85 454.63 ± 28.23 0.46 ± 0.05
B 0.93 ± 0.04 1112.33 ± 30.41 1060.58 ± 30.12 0.82 ± 0.04
C 0.88 ± 0.06 1146.77 ± 20.65 1122.43 ± 29.33 0.89± 0.06
D 1.14 ± 0.05 1167.54 ± 25.89 1091.65 ± 22.57 0.92 ± 0.06
E 1.17 ± 0.06 1255.87 ± 32.32 1426.38 ± 31.47 1.08 ± 0.05
F 1.25 ± 0.09 1302.33 ± 37.88 1494.57 ± 28.95 1.14 ± 0.07
G 1.21± 0.07 1224.19 ± 30.02 1381.83 ± 33.05 1.07 ± 0.04
H 1.48 ± 0.08 1527.16 ± 28.33 1672.02 ± 30.58 1.16 ± 0.08
注：各列后面不同的小写字母表示不同处理差异显著性（P＜0.05）
（2）香蕉苗的叶面积、根长和根直径
香蕉苗的叶面积通过陈志杰（2018）的香蕉苗叶面积计算公式得到，选取香蕉苗顶上第三展开叶，公式为：叶长×叶宽×0.75。叶长为叶基到叶尖的距离，叶宽为叶中部最宽处两边之间的距离。采用LA2400 SCANNER根系扫描仪测定香蕉苗的根长和根直径，应用洗根测量分析软件进行分析。
植株叶面积大小直接影响植物的光合作用效果，根系是植物吸收养分和水分的重要器官，其形态大小和特征是影响植物养分吸收的重要因素。由表11可知，各组合复合微生物肥料处理的香蕉植株叶面积、根长和根直径均显著高于无菌微生物肥料处理。其中H处理的香蕉叶面积、根长和根直径最大，显著高于其他处理，叶面积为1527.16cm2、根长为1672.02cm和根直径为1.16mm。综合结果分析可得，H组合的复合微生物肥料对香蕉植株促生最显著，主要通过提高香蕉植株根长和根系直径，来提高香蕉植株根系吸收率，进而增大叶面积。
（3）香蕉苗的茎粗
香蕉苗茎粗是用最小刻度0.01游标卡尺测量离盆栽基质3 cm处假茎的周长。
结果如图2所示，从图上可以看出，各合成菌群的复合微生物肥料处理的茎粗在一定程度上均有提高，其中处理H的植株茎粗最大，为9.82 cm，显著高于其他处理；而F处理的茎粗次之，为9.05cm；E处理与G处理无显著性差异，平均茎粗分别为7.54cm和7.97cm。因此，复合微生物肥料不仅具有良好的防控效果，且具有较好的促生作用，可提高香蕉植株株高，也能显著增加香蕉的茎粗，以H处理效果最为显著。
（4）香蕉苗的鲜重和干重
将香蕉苗用清水洗净，于报纸上晾干，测量香蕉苗的鲜重。将称完鲜重后的香蕉苗置于烘箱中，80℃烘干3 d，取出进行称重。
结果如图3所示，从图上可以看出，香蕉植株干重和鲜重在各个处理组上的情况保持一致。对于A-H这8个组合的复合微生物肥料处理的香蕉植株，其鲜重和干重以H处理最高，分别达224.6g和33.8g，显著高于其他处理，且鲜重和干重两者只差较小，表示该处理香蕉苗体内有效生物量较大。由此可知，构建合成菌群制备的复合微生物肥料能显著提高香蕉生物量，且H合成菌群的效果最好，适合后续生产利用。
（5）香蕉苗的株高
香蕉苗株高是用最小刻度0.1 cm直尺测量从盆栽的基质表面开始到最顶上展开叶的叶柄与假茎交汇处。
表12 不同复合微生物肥料处理对香蕉株高的影响
处理 株高（cm）
CK 38.52±2.01
A 20.24±2.86
B 27.59±3.78
C 28.85±2.67
D 30.58±3.98
E 37.42±3.74
F 39.55±2.89
G 41.28±4.39
H 48.67±1.24
由表12可以看出，不同组合微生物肥料处理的香蕉幼苗的株高之间存在显著性差异，且均显著高于无菌复合肥料处理。香蕉幼苗的株高以H组合处理最大，显著高于其他处理，高达48.67cm，由此可见，H组合复合微生物肥料处理对香蕉的促生作用最好。
土壤微生物群落分析
（1）土壤DNA提取及PCR扩增
根据E.Z.N.A.®Soil DNA Kit Protocol（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）土壤DNA提取试剂盒中方法提取土壤微生物总DNA，总DNA浓度用NanoDrop 2000UV-vis紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，USA）检测。并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。
以提取的土壤总DNA为模板，采用热循环PCR系统（GeneAmp 9700，ABI，USA），用细菌通用引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') / 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')和真菌通用引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') / ITS1-R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 分别扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS1区。
细菌16S rRNA聚合酶链反应采用以下程序进行：95℃预变性3 min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环27次，最后72℃延伸10min。真菌ITS序列PCR反应使用以下程序进行： 95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，最后72℃延伸10min。
（2）高通量（Illumina MiSeq）测序
根据Majorbio Bio Pharm Technology Co.Ltd.（中国上海）的标准方法，纯化的DNA片段以等摩尔量汇集，并使用Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego，USA）进行成对末端测序（2×300）。
（3）序列处理生物信息学分析
原始fastq文件被分解，质量由Trimmomatic过滤，并通过FLASH合并，标准如下：（i）在50 bp滑动窗口上接收到平均质量分数<20的任何位置处，读取被截断；（ii）引物完全匹配，允许2-核苷酸失配，并删除含有不明确碱基的读取；以及（iii）根据重叠序列合并重叠长度大于10bp的序列。使用UPARSE（7.1版http://drive5.com/UPARSE/）对操作分类单元（otu）进行聚类，相似度为97%，并使用UCHIME识别和去除嵌合序列。根据Silva（SSU123）16srrna数据库对每个16srrna基因序列和序列进行分类分析，真菌ITS序列采用RDP分类器算法（http://RDP.cme.msu.edu/）进行分析，置信阈值为70%。
（4）统计分析
采用SPSS v20.0统计软件包（美国IBM公司）对α多样性指数进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett（E）进行差异分析。治疗组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
（5）不同处理对土壤微生物群落组成的影响
在研究不同处理对土壤微生物群落的影响中选择盆栽实验的土壤样品，提取土壤DNA共51个样本，得到了2248488条有效质量序列，序列的平均长度为437.5 bp。对序列进行聚类操作，将得到的系列按照97%的一致性划分为N个小组，一个小组就是一个OUT，共得到6176个OTUs。
对OTU进行去低含量筛除后，将OTU的代表序列与微生物参考数据库进行比对，获得物种注释，共注释到21个门，57个纲，136个目，223个科，401个属，457个种。以属为研究对象，选取9个处理组中丰度前20的物种进行比较，9个处理优势物种差异显著（图4，表13）。CK处理组中的优势菌属是 Subdoligranulum，A处理组中的优势菌属是 Rhodanobacter，B处理组中的优势菌属是 Devosia，C处理组中的优势菌属是 Lactobacillus，D处理组中的优势菌属是 Streptococcus，E处理组中的优势菌属是 Pseudolabrys，F处理组中的优势菌属是 Ochrobactrum，G和H处理组中的优势菌属是 Bacillus。值得注意的是，与对照相比，经复合微生物菌肥处理土壤中，芽孢杆菌属（ Bacillus）数量有了显著升高，特别是H处理，升高倍数最大，与对照组相比，其占比是对照组的10倍。结果表明，病原菌处理的物种多样性较低，这是因为病原菌的影响，破坏了原来的土壤微生物生态，在经过复合微生物肥料的处理后，有效提高了芽孢杆菌（ Bacillus）的相对丰度，重组了土壤微生物群落结构，恢复了被病原菌破坏的土壤微生物生态。这说明了复合微生物肥料有利于恢复被病原菌的土壤微生物生态，而H组合的效果最佳。
表13不同处理土壤微生物的优势种群
genus CK A B C D E F G H
Bacillus 0.0023 0.0060 0.0081 0.0135 0.0095 0.0314 0.0133 0.1606 0.2408
Pseudolabrys 0.0079 0.0152 0.0686 0.0405 0.0027 0.1002 0.0002 0.0685 0.0313
Lactobacillus 0.0130 0.0139 0.0402 0.1140 0.0642 0.0299 0.0220 0.0075 0.0118
Rhodanobacter 0.0075 0.1528 0.0155 0.0359 0.0022 0.0058 0.0020 0.0283 0.0267
Ochrobactrum 0.0128 0.0038 0.0051 0.0093 0.0706 0.0265 0.0827 0.0048 0.0046
Chujaibacter 0.0070 0.0418 0.0250 0.0257 0.0044 0.0262 0.0035 0.0714 0.0105
Streptococcus 0.0068 0.0029 0.0123 0.0286 0.1024 0.0247 0.0190 0.0032 0.0030
Devosia 0.0068 0.0301 0.0201 0.0146 0.0024 0.0167 0.0004 0.0180 0.0211
Candidatus_Udaeobacter 0.0417 0.0738 0.0006 0.0014 0.0008 0.0003 0.0001 0.0002 0.0007
Sphingomonas 0.0092 0.0155 0.0083 0.0087 0.0118 0.0269 0.0085 0.0060 0.0118
Rothia 0.0039 0.0010 0.0030 0.0056 0.0675 0.0063 0.0079 0.0054 0.0008
Terrisporobacter 0.0101 0.0048 0.0133 0.0268 0.0246 0.0073 0.0023 0.0034 0.0042
Altererythrobacter 0.0020 0.0290 0.0137 0.0088 0.0002 0.0124 0.0000 0.0088 0.0117
Actinomyces 0.0098 0.0009 0.0022 0.0040 0.0470 0.0102 0.0049 0.0027 0.0008
Corynebacterium_1 0.0068 0.0003 0.0032 0.0028 0.0250 0.0024 0.0388 0.0013 0.0002
Subdoligranulum 0.0746 0.0006 0.0002 0.0014 0.0013 0.0010 0.0005 0.0004 0.0002
（6）不同处理的土壤微生物聚类分析
Heatmap图是以颜色梯度来直观地表现数值的大小，并通过颜色梯度以及相似程度反映不同处理样本在指定的分类水平上群落组成的相似性和差异性。根据各样本在属水平的物种注释，选取属水平总丰度前20的物种，绘制成群落Heatmap图，结果如图5所示。
从样本进行聚类后可以从图上看出，盆栽中期的处理E和处理F土壤中细菌群落相似度最近，这两者聚类后与中期处理B相似度最近，聚为一类，而处理C受病原菌侵袭，跟处理B相似度就低了一些，跟中期处理A相似度更高，聚为一类。两组聚类后的相似度跟其他处理比起来更近，聚为一大类。后期处理F与后期处理B相似度更近，两者聚为一类后跟后期处理C因相似度近而聚为一类，然后是与后期处理E聚为一类，这时与处理A相似度高而聚为一大类，这些是因为后期处理E受菌肥的影响，物种丰度增加，而后期处理F则因为病原菌而丰度降低，但又受到菌肥的影响，因此跟后期处理B物种丰度相近，而后期处理C只受到病原菌影响而丰度降低，因此跟B相似度变低。中期和后期这两大类相似度相近而再聚为一类，只剩下中期和后期的处理D、G、H，因为这些处理受到复合肥影响严重，因此跟其他处理相似度差距较大，而且随时间影响受到的影响越重，所以中期处理D、G、H跟其他处理更相似，先是处理G和H聚为一类，然后跟处理D聚为一类，而进行盆栽实验前的种苗土CK再跟它们聚为一类，而丰度相似度更远的后期处理D、G、H单独为一类，同时更相似的G和H在其下聚为一小类。这样的聚类结果跟上面的主成分分析的结果也是大致相符。
（8）不同处理的土壤微生物组间差异显著性分析
在科水平上利用t检验统计学方法对受枯萎病菌侵染的处理和对应处理进行分析，得到的统计学差异的结果如图6-8所示。
从图上可以看出，处理D和处理A的显著性差异物种为黄色杆菌科( Xanthobacteraceae)、 norank_P__Saccharibacteria、黄单胞菌科（ Xanthomonadaceae）、噬几丁质菌科( Chitinophagaceae)、亚硝化单胞菌科( Nitrosomonadaceae)和小单孢菌科( Micromonosporaceae)，其中 norank_P__Saccharibacteria、黄单胞菌科（ Xanthomonadaceae）和亚硝化单胞菌科( Nitrosomonadaceae)差异极显著，处理A的黄色杆菌科( Xanthobacteraceae)、亚硝化单胞菌科( Nitrosomonadaceae)和小单孢菌科( Micromonosporaceae)比处理D多，另外三科菌是处理D更多。处理B对比处理C的没有特别显著的差异物种，差异较大的是小单孢菌科( Micromonosporaceae)，处理B比处理C多。处理E和处理F之间存在极显著差异的物种，是伯克氏菌科( Burkholderiaceae)，处理F比处理E多。处理G和处理H之间存在一科差异性极显著的物种，处理H的黄单胞菌科（ Xanthomonadaceae）显著高于处理G。
小结
通过盆栽试验，验证了复合微生物肥料对Foc TR4的防控效果，结果显示，复合微生物肥料处理后，降低了土壤中Foc TR4的数量，提高了土壤中细菌和放线菌的数量。土壤微生物高通量测序结果表明，复合微生物肥料处理感病香蕉，香蕉根际土壤中益生菌芽孢杆菌属（Bacillus）和黄单胞菌属（Xanthomonadaceae）的相对丰度升高，病原菌镰刀菌属（Fusarium）相对丰度降低。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围。

Claims (9)

1.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂含有棘孢木霉MM7、暹罗芽胞杆菌QN2MO-1和东方醋酸杆菌XJC-C；
或者，所述复合菌剂含有棘孢木霉MM7、临高链霉菌1-7和永兴链霉菌2-11；
或者，所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌QN2MO-1、东方醋酸杆菌XJC-C、临高链霉菌1-7和永兴链霉菌2-11；
或者，所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌棘孢木霉MM7、暹罗芽胞杆菌QN2MO-1、东方醋酸杆菌XJC-C、临高链霉菌1-7和永兴链霉菌2-11；其中，
所述暹罗芽胞杆菌为暹罗芽胞杆菌QN2MO-1（Bacillus siamensis QN2MO-1），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021305；
所述东方醋酸杆菌为东方醋酸菌 （Acetobacter orientalis）XJC-C，于2020年04月20日，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC NO. 19592；
所述临高链霉菌为临高链霉菌1-7（Streptomyces lingaoensis sp. nov.1-7），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021300；
所述永兴链霉菌为永兴链霉菌2-11（Streptomyces Yongxingensis sp. nov.2-11），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303；
所述棘孢木霉为棘孢木霉MM7 （Trichoderma asperellum MM7），于2021年3月30日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2021302。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，根据按照有效活菌数量计，所述复合菌剂中，
如果存在暹罗芽胞杆菌，则所述复合菌剂含有暹罗芽胞杆菌1-100份；
如果存在东方醋酸杆菌，则所述复合菌剂含有东方醋酸杆菌1-100份；
如果存在临高链霉菌，则所述复合菌剂含有临高链霉菌1-100份；
如果存在永兴链霉菌，则所述复合菌剂含有永兴链霉菌1-100份；
如果存在棘孢木霉，则所述复合菌剂含有棘孢木霉1-100份。
3.如权利要求1或2所述的复合菌剂的发酵液。
4.一种复合微生物菌肥，其特征在于，其含有权利要求1或2所述的复合菌剂、或者权利要求3所述的发酵液。
5.如权利要求1或2所述的复合菌剂、或者权利要求3所述的发酵液、或者权利要求4所述的复合微生物菌肥在制备防治香蕉枯萎病制剂中的应用。
6.如权利要求1或2所述的复合菌剂、或者权利要求3所述的发酵液、或者权利要求4所述的复合微生物菌肥在制备促进香蕉幼苗生长的制剂中的应用。
7.如权利要求1或2所述的复合菌剂、或者权利要求3所述的发酵液、或者权利要求4所述的复合微生物菌肥在提高感染香蕉枯萎病香蕉根际土壤中芽孢杆菌属相对丰度、和/或提高感染香蕉枯萎病香蕉根际土壤中黄单胞菌属相对丰度、和/或降低感染香蕉枯萎病香蕉根际土壤中病原菌镰刀菌属相对丰度中的应用。
8. 如权利要求1或2所述的复合菌剂、或者权利要求3所述的发酵液、或者权利要求4所述的复合微生物菌肥在降低土壤中香蕉枯萎病菌四号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp. Cubense tropical Race 4）的数量中的应用。
9.一种如权利要求4所述的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，在发酵营养液中接入权利要求1或2中任意一项所述的复合菌剂进行发酵培养。
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