CN115287228B - 基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂及其应用，所述复合生物菌剂包括阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种，所述阿氏芽孢杆菌于2022年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25072。采用本发明的技术方案，采用阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种后，可以使得培养液中的氮、磷含量大幅度增加，远远大于单独添加阿氏芽孢杆菌或宏大肾形虫相似种的情况，将其作为生物肥料，可以用于增加土壤中的氮磷含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂及其应用。
背景技术
阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）在生物防治、提高土壤肥效、促进植物生长和环境生物修复等方面具有显著的优势。市面上的阿氏芽孢杆菌都是单独添加作为生物菌剂，或者与其他化学物质联合运用作为农药，防止多种病虫害。但没有与其他生物联合作用，共同作为复合生物菌剂的研究。而国外已经将原生动物作为生物菌剂，用来提高土壤肥力，但我国对原生动物的这方面研究还很少。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂及其应用。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种复合生物菌剂，其包括阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种（Colpodea ciliates），所述阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）于2022年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏编号为CGMCC No.25072。
采用此技术方案，阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种通过共同培养后，可以使氮磷含量大幅度增加，可以用来提高土壤肥力，而且采用阿氏芽孢杆菌以及原生动物共同培养用于土壤增加肥力，环境更加友好，而且其中的阿氏芽孢杆菌还可以防止多种病虫害。
作为本发明的进一步改进，所述宏大肾形虫相似种为从甜菜根际土壤中分离获得。
作为本发明的进一步改进，所述宏大肾形虫相似种为从甜菜根际土壤中分离，然后采用以麦粒浸出液为食，在25℃的恒湿培养箱中进行培养获得。
作为本发明的进一步改进，所述阿氏芽孢杆菌为从甜菜根际土壤筛选获得。
作为本发明的进一步改进，所述阿氏芽孢杆菌为从甜菜根际土壤筛选后，采用LB固体培养基在37℃的恒温箱里进行培养获得。
作为本发明的进一步改进，所述宏大肾形虫相似种和阿氏芽孢杆菌的比例为1-5：2.5×105。
作为本发明的进一步改进，所述的复合生物菌剂包括培养液，所述阿氏芽孢杆菌的浓度为2.5×107 ind./mL，所述宏大肾形虫相似种的浓度为100-500 ind./mL。进一步的，所述宏大肾形虫相似种的浓度为100-400 ind./mL。进一步优选的，所述宏大肾形虫相似种的浓度为300 ind./mL。
作为本发明的进一步改进，所述复合生物菌剂还包括载体。进一步的，所述载体为固体载体或液体载体。
作为本发明的进一步改进，所述复合生物菌剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂或水分散粒剂。
本发明还公开了一种氮磷复合生物肥，其包括如上所述的复合生物菌剂。
本发明还公开了如上所述的复合生物菌剂在增加土壤中氮磷含量的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，采用阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种后，可以使得培养液中的氮、磷含量大幅度增加，远远大于单独添加阿氏芽孢杆菌或宏大肾形虫相似种的情况，将其作为生物肥料，可以用于增加土壤中的氮磷含量。本发明的技术方案相比微生物的单独添加作为生物肥料有更好的应用前景，其效果更好。
附图说明
图1是本发明实施例1-5的不同含量的阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种在培养液中培养后铵态氮含量的对比图。
图2是本发明实施例1-5的不同含量的阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种在培养液中培养后总磷含量的对比图。
图3是本发明实施例3与对比例的铵态氮含量的对比图。
图4是本发明实施例3与对比例的总磷含量的对比图。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1-5
实验所用的供试原生动物为宏大肾形虫相似种（Colpoda cf. Grandis）从甜菜根际土壤中分离获得，以麦粒或米粒浸出液为食，在25℃的恒湿培养箱中进行大量培养。每24h清理一次代谢废物。
供试细菌为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），其从甜菜根际土壤筛选获得，用LB固体培养基在37℃的恒温箱里进行培养，培养后转移到LB液体培养基中培养，进一步处理后得到阿氏芽孢杆菌菌悬液。
试验步骤：
（1）取6mL无菌水（使用前，经高压蒸汽灭菌锅灭菌）加入6孔培养皿；
（2）取300μL 阿氏芽孢杆菌菌悬液分别加入6个孔中（相当于每个孔中有2×108细菌）；
（3）转移200-800μL原生动物培养液加入有细菌悬浮液细胞培养板的6个孔
中（相当于每个孔中有1600-4000个原生动物）；
（4）在将相同数量的原生动物（宏大肾形虫相似种）培养液加入不含细菌悬浮液的6孔板中；其中包括五种不同浓度阿氏芽孢杆菌悬液+宏大肾形虫相似种的实施例，分别如下：
实施例1中，阿氏芽孢杆菌悬液(B)浓度为2.5×107ind./mL，宏大肾形虫相似种（P）的浓度为100ind./mL；
实施例2中，阿氏芽孢杆菌悬液(B)浓度为2.5×107ind./mL，宏大肾形虫相似种（P）的浓度为200ind./mL；
实施例3中，阿氏芽孢杆菌悬液(B)浓度为2.5×107ind./mL，宏大肾形虫相似种（P）的浓度为300ind./mL；
实施例4中，阿氏芽孢杆菌悬液(B)浓度为2.5×107ind./mL，宏大肾形虫相似种（P）的浓度为400ind./mL；
实施例5中，阿氏芽孢杆菌悬液(B)浓度为2.5×107ind./mL，宏大肾形虫相似种（P）的浓度为500ind./mL；
（5）以添加无菌水作为对照。所有处理都添加无菌水补体积到8mL，每个处理6个重复在25℃的光照培养箱里培养96h；
（6）每隔24h对每组处理进行铵态氮和总磷的测定。
上述实施例1~实施例5的铵态氮含量对比结果如图1所示，可见，宏大肾形虫相似种与阿氏芽孢杆菌共培养48-96 h后，实施例1~实施例5中铵态氮含量都持续增加。
其中，实施例1（宏大肾形虫相似种100 ind./mL+阿氏芽孢杆菌2.5×107 ind./mL，简称“1BP”）和实施例3（宏大肾形虫相似种300 ind./mL+阿氏芽孢杆菌2.5×107 ind./mL，简称“3BP”）两种处理在铵态氮含量在96 h达到最大值，分别为7.0mg/L和6.9mg/L；实施例2（宏大肾形虫相似种200 ind./mL+阿氏芽孢杆菌 2.5×107ind./mL，简称“2BP”）和实施例4（宏大肾形虫相似种 400 ind./mL+阿氏芽孢杆菌 2.5×107ind./mL，简称“4BP”）两种组合在96 h达到最大值，分别为7.7mg/L 和7.9 mg/L，高于其它三种组合。实施例5（宏大肾形虫相似种500 ind./mL+阿氏芽孢杆菌 2.5×107ind./mL，简称“5BP”）在96 h铵态氮含量稍低于其他四中组合，含量为4.9 mg/L。
上述实施例1~实施例5的总磷含量对比结果如图2所示，可见，宏大肾形虫相似种与阿氏芽孢杆菌共培养48-96 h后，实施例1~实施例5中总磷含量都持续增加。
实施例1的总磷含量72 h达到最大值为0.23 mg/L；实施例2的总磷含量在96 h达到最大值为 0.34 mg/L；实施例3的总磷含量在48-96 h显著上升，在96 h最大，达到0.47mg/L，均明显高于其他四个实施例。实施例4的总磷含量先升高，在48 h达到最低值0.09mg/L，然后再升高。实施例5的总磷含量在96 h时，高于其他实施例，达到0.19 mg/L。
对比例1
本对比例与实施例的不同在于，采用原生动物（宏大肾形虫相似种）培养液在25℃的光照培养箱里培养96h，其中宏大肾形虫相似种的浓度为300 ind./mL。
对比例2
本对比例与实施例的不同在于，采用阿氏芽孢杆菌菌悬液在25℃的光照培养箱里培养96h，其中阿氏芽孢杆菌的浓度为2.5×107ind./mL。
对实施例3与对比例1-2每隔24h进行铵态氮含量和总磷含量的测定，铵态氮含量的结果如图3所示，总磷含量的结果如图4所示。
由图3可知，对比例1（宏大肾形虫相似种300 ind./mL，简称“P”）处理下的铵态氮的含量最低，低于CK处理。实施例3（宏大肾形虫相似种300 ind./mL+阿氏芽孢杆菌2.5×107ind./mL）的可以看出，宏大肾形虫相似种捕食细菌后，0-24 h水体铵态氮下降，主要是因为宏大肾形虫相似种在培养第一天会出现延滞效应，所以导致向水体中释放铵态氮减少；24-96h BP处理下的铵态氮含量都持续增加，在96 h达到最大值6.9 mg/L，这是由于宏大肾形虫相似种捕食细菌后，氮以铵态氮的形式被排泄到水中。对比例2（阿氏芽孢杆菌2.5×107ind./mL，简称“B”）处理下的铵态氮含量高于CK和P处理，但低于BP处理，尤其是在96h。
从图4可以看出，对比例1（宏大肾形虫相似种300 ind./mL）处理下的总磷含量也很低，最高也只有0.05 mg/L；实施例3（宏大肾形虫相似种300 ind./mL+阿氏芽孢杆菌2.5×107ind./mL）处理下的总磷含量在96 h达到最大值0.47 mg/L，高于对比例1（宏大肾形虫相似种300 ind./mL）处理的47倍，高于对比例2（阿氏芽孢杆菌2.5×107ind./mL）处理的5.9倍，可见原生动物捕食细菌，可释放大量磷。
通过上述结果表明，宏大肾形虫相似种和阿氏芽孢杆菌组合培养能显著增加培养液中铵态氮和总磷含量，以实施例3的为最优，而且与宏大肾形虫相似种和阿氏芽孢杆菌单独添加时氮磷含量相比，宏大肾形虫相似种和阿氏芽孢杆菌的组合培养产生了协同作用。由此可见，相比微生物的单独添加作为生物肥料，原生动物-细菌混合肥料有更好的应用前景，其效果更好，并不单纯是二者叠加的效果，可以将用来提高土壤肥力。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1. 一种基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：其包括阿氏芽孢杆菌和宏大肾形虫相似种Colpoda cf. Grandis，所述阿氏芽孢杆菌于2022年06月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.25072；所述宏大肾形虫相似种为从甜菜根际土壤中分离获得。
2.根据权利要求1所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：所述宏大肾形虫相似种为从甜菜根际土壤中分离，然后采用以米粒或麦粒浸出液为食，在25℃的恒湿培养箱中进行培养获得。
3.根据权利要求1所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：所述阿氏芽孢杆菌为从甜菜根际土壤筛选获得。
4.根据权利要求3所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：所述阿氏芽孢杆菌为从甜菜根际土壤筛选后，采用LB固体培养基在37℃的恒温箱里进行培养获得。
5. 根据权利要求1~4任意一项所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：其包括培养液，所述阿氏芽孢杆菌的浓度为2.5×107 ind./mL，所述宏大肾形虫相似种的浓度为100-400 ind./mL。
6.根据权利要求5所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：所述宏大肾形虫相似种的浓度为300ind./mL。
7.根据权利要求5所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂，其特征在于：还包括载体。
8.一种氮磷复合生物肥，其特征在于：其包括如权利要求1-7任意一项所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂。
9.如权利要求1~7任意一项所述的基于阿氏芽孢杆菌和肾形虫的复合生物菌剂在增加土壤中氮磷含量的应用。
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